一種基于氨基酸的煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對(duì)煙草代謝組學(xué)煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別的方法。以煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值為指標(biāo)，對(duì)代謝組學(xué)煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別，為代謝組學(xué)合格樣本的選擇提供依據(jù)。本發(fā)明準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)單可行，可為煙草代謝特征分析及相關(guān)煙草代謝組學(xué)研究提供借鑒。
【專利說明】-種基于氨基酸的煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判 別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種判別煙草代謝組學(xué)研究所用的煙草鮮葉樣本質(zhì) 量是否滿足代謝組學(xué)研究需要的判別方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物代謝組學(xué)是通過考察植物受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的 變化，來研究植物體系的一種技術(shù)。在代謝組學(xué)輪廓分析的流程中，典型樣本的采集是首要 并且及其重要的步驟，獲得合格樣本，W真實(shí)客觀地反映樣本的代謝狀態(tài)，是代謝組學(xué)分析 進(jìn)行的基礎(chǔ)和前提。植物鮮葉樣本的采集，需要在低溫下渾滅W停止其生理活動(dòng)W保證其 停止在采樣時(shí)的代謝狀態(tài)，標(biāo)準(zhǔn)做法為采摘植物樣本后，錫紙包裹，置于-196C液氮冷凍， 用于煙草鮮葉分析或者凍干后用干粉樣本分析。在樣本采摘到分析前的該一段過程，需保 證煙草鮮葉在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會(huì)造成鮮葉的酶促褐變。
[0003] 氨基酸是植物中重要的一類化合物，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，一些蛋白酶可調(diào) 節(jié)植物的物質(zhì)代謝。多數(shù)氨基酸在植物代謝網(wǎng)絡(luò)中是初生和次生代謝的樞紐，氨基酸代謝 是植物代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。氨基酸進(jìn)一步代謝產(chǎn)物包括核酸，醋，多酷，葉綠素，生物堿等重要 物質(zhì)。氨基酸的代謝作為氮代謝的起始部分，在協(xié)調(diào)碳氮代謝方面起重要作用，在煙草植株 生長代謝過程中，碳氮代謝的協(xié)調(diào)決定了煙葉的質(zhì)量和品質(zhì)。另外，在植物蛋白質(zhì)營養(yǎng)質(zhì)量 排序中，煙葉蛋白質(zhì)居于首位。同一些主要作物如水稻、小麥、玉米、大豆蛋白質(zhì)中必需氨基 酸相比，煙草蛋白中的必需氨基酸含量較高，均高于國際糧農(nóng)組織（FA0)制定的蛋白制品 中必需氨基酸含量標(biāo)準(zhǔn)，其中酪氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和亮氨酸超過該標(biāo)準(zhǔn)的1倍左右。
[0004] 嚴(yán)重褐變的煙草鮮葉樣本，其顏色會(huì)由鮮綠變?yōu)楹稚?，但酶促褐變反?yīng)輕微的樣 本僅通過觀察樣本外觀顏色深淺難W準(zhǔn)確判別樣本是否正常。本專利首次提出采用谷氨酸 與谷氨醜胺含量的比值鑒別煙草鮮葉的質(zhì)量，為代謝組學(xué)研究的樣本質(zhì)量判別提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種對(duì)煙草代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì)量判別的方法。為了 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述的一種對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別的方 法，其利用煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉質(zhì)量進(jìn) 行判別。
[0006] 通過檢測(cè)煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨醜胺含量，計(jì)算其比值，對(duì)代謝組學(xué)研究中的 煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別。
[0007] 將煙草鮮葉中加入含內(nèi)標(biāo)的提取溶劑，提取后離也過濾，采用6-氨基唾晰-N-玻 巧醜亞胺甲醋（AQC)衍生后，利用超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-SQDMS)進(jìn)行分析， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出谷氨醜胺和谷氨酸的含量。
[0008] 所述內(nèi)標(biāo)為降額氨酸，其含量為5mg/L，所述提取溶劑為含己醇70%的水溶液；所 述煙草鮮葉與含內(nèi)標(biāo)的提取溶劑按質(zhì)量/體積比加入量為=35:1-3。
[0009] 超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-SQDMS)的條件為；色譜柱Waters UPLC ClScolumn ;流動(dòng)相A ;20mM甲酸饋，0. 5%甲酸，1%己膳，98. 5%水，流動(dòng)相B ;1. 6%甲酸， 98. 4%己膳（v/v );流速；0. 35血/min ;柱溫；55 °C ;進(jìn)樣體積；1 y L ;進(jìn)樣器溫度；15 °C ; 洗脫梯度為；〇-l.〇8min，0. l〇/〇-〇.l〇/〇B;l. 08-11. 48min，0.1〇/〇-9. l〇/〇B;ll. 48-16. 3min, 9. 1%-21. 2%B ；16. 3-16. 9min, 21. 2%-59.6%B ；16. 9-18. Imin,59.6%-59. 6%B ； 18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B ;質(zhì)譜方法；ESI 正離子模式下，分 段SIR掃描，毛細(xì)管電壓；3KV，錐孔電壓；30V，脫溶劑氣溫度；30(TC，錐孔溫度；12(TC，脫 溶劑氣流量；650L/h，錐孔氣流量；5化A。
[0010] 所述煙草鮮葉是經(jīng)-196C液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，凍干，-8(TC冰箱保存 待用。
[0011] W谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值為指標(biāo)，建立區(qū)分代謝組學(xué)正常樣本、部分褐化 及褐化樣本的標(biāo)準(zhǔn)，即待測(cè)樣本中谷氨酸與谷氨醜胺比值在0. 67 W上的為合格樣本，用于 煙草代謝組學(xué)分析；谷氨酸與谷氨醜胺比值在0. 12 W下的為變質(zhì)的不合格樣本，谷氨酸與 谷氨醜胺比值介于0. 12與0. 67之間為部分質(zhì)變的不合格樣本。
[0012] 本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量煙草鮮葉樣本的分析研究，發(fā)現(xiàn)煙草鮮葉如果發(fā)生酶促 褐變等反應(yīng)，其游離氨基酸的含量會(huì)發(fā)生較大變化，谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值明顯降 低，此類樣本將不能用于代謝組學(xué)分析。因此W谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值作為一個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0014] 利用谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行 判別，鑒別其是否滿足代謝組學(xué)研究的需要，該方法簡(jiǎn)單可行，快捷高效。具體地說，本發(fā)明 W谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值作為區(qū)分代謝組學(xué)合格樣本、嚴(yán)重質(zhì)變的不合格樣本和部 分質(zhì)變的不合格樣本的標(biāo)準(zhǔn)。即待測(cè)樣本中谷氨酸與谷氨醜胺比值在0.67 W上的為正常 樣本，可用于代謝組學(xué)分析，谷氨酸與谷氨醜胺比值在0. 12 W下的為褐化變質(zhì)的不合格樣 本，谷氨酸與谷氨醜胺比值介于0. 12與0. 67之間為部分質(zhì)變不合格樣本，需要對(duì)樣本來源 進(jìn)行進(jìn)一步核實(shí)。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面通過實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，實(shí)例僅限于說明本發(fā)明W便于理解，而非對(duì)本 發(fā)明的限定。
[0016] 1)由大田采摘的煙草鮮葉，于-196 C液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，低 溫凍干，-8(TC冰箱保存待后續(xù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。準(zhǔn)確稱取35mg煙草鮮葉，加入 2血70%〔2&地（含內(nèi)標(biāo)降額氨酸5mg/L)，搖床160巧m, 25 °C，比提取，3000巧m離也， 0. 22 y m過濾，采用柱前6-氨基唾晰-N-玻巧醜亞胺甲醋（AQC)(來自waters公司的 Waters AccQ-化g derivation kit衍生試劑盒）衍生，超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜 (UPLC-SQDMS)分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可W對(duì)煙草鮮葉中游離氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確，快速定量。
[0017] 采用6-氨基唾晰-N-玻巧醜亞胺甲醋（AQC)衍生的具體衍生步驟為；70yL P服.8的測(cè)酸鹽緩沖液（來自waters公司的Waters AccQ-hg derivation kit衍生試劑 盒)，加入巧pendo計(jì)管(德國化pendcxrf公司）中，加入10 y L樣品或者氨基酸混標(biāo)溶液， 潤旋5-10砂，再加入20 y L衍生試劑，潤旋5-10砂，室溫下放置Imin左右，于55C加熱 lOmin。
[0018] 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量步驟：配置 0. 025,0. 05,0. 1,0. 25,0. 5,1,2. 5,5,12. 5,25， 50mg/L共11個(gè)系列濃度的29種氨基酸的混標(biāo)溶液，每個(gè)系列濃度均加入內(nèi)標(biāo)，得到含內(nèi)標(biāo) 降額氨酸5mg/L的29種氨基酸及胺的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0019] 將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生后進(jìn)樣分析。各個(gè)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過W其系 列濃度對(duì)應(yīng)的峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面為應(yīng)變量，W系列濃度為自變量作圖得到，即公式（1);
[0020] A1 / a X S二K1C1+B1****************************************************** Cl)
[0021] 其中；Ai -系列濃度氨基酸的峰面積，AIS -內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ci -氨基酸系列濃 度，Ki -標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；Bi -標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將樣品中的峰 面積/內(nèi)標(biāo)峰面積代入公式，得到各個(gè)氨基酸的濃度。
[0022] 2)對(duì)所有樣本進(jìn)行游離氨基酸分析，色譜柱Waters UPLC ClScolumn (粒 徑1. 7 y m，內(nèi)徑2. 1mm，柱長100mm);流動(dòng)相A ;20mM甲酸饋，0. 5%甲酸，1%己膳， 98. 5%水，流動(dòng)相B ;1. 6%甲酸，98. 4%己膳（v/v);流速；0. 35血/min ;柱溫；55 °C ;進(jìn)樣 體積；ly L ;進(jìn)樣器溫度；15°C ;洗脫梯度為；0-1.08min，0. 1%-0. 1%B ;1.08-11.48min， 0. P/o-9. P/oB ;11. 48-16. 3min，9. P/o-21. 2〇/〇B ;16. 3-16. 9min，21. 2〇/〇-59. 6〇/〇B ;16. 9-18. Imin， 59. 6%-59. 6%B ;18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B。質(zhì)譜方法；ESI 正 離子模式下，分段SIR掃描，毛細(xì)管電壓；3KV，錐孔電壓；30V，脫溶劑氣溫度；30(TC，錐孔溫 度；12(TC，脫溶劑氣流量；650L/h，錐孔氣流量；5化A。
[0023] 采用保留時(shí)間結(jié)合標(biāo)樣的質(zhì)量數(shù)定性，內(nèi)標(biāo)法定量。在上述條件下可測(cè)得煙草鮮 葉中的29種游離氨基酸及胺等物質(zhì)。
[0024] 本發(fā)明的技術(shù)路線是：
[0025] 采用樣本為中國云南，貴州，河南H省的紅花大金元，K326,中煙100 H個(gè)品種在 胚長期，現(xiàn)蕾期，盛花期，下部葉成熟期，中部葉成熟期5個(gè)生育期的煙草鮮葉及其他一些 省份主栽品種的中部葉成熟期煙草鮮葉材料，其中包括符合代謝組學(xué)樣本要求的質(zhì)量合格 樣本，葉片嚴(yán)重質(zhì)變的不合格樣本W(wǎng)及部分質(zhì)變的不合格的疑似樣本。根據(jù)大批量樣本建 立的合格樣本與不合格樣本的谷氨酸與谷氨醜胺比值的規(guī)律，判斷樣本的質(zhì)量是否合格。
[0026] 本發(fā)明研究人員利用煙草鮮葉樣本中谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值和樣本質(zhì)量 的相關(guān)性，對(duì)代謝組學(xué)煙草鮮葉樣本進(jìn)行質(zhì)量判別。本發(fā)明具有W下特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單快速， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠；樣本用量少；方法適用于不同生育期、不同地點(diǎn)及品種的煙草鮮葉的判別。 本方法可為煙草代謝特征分析及相關(guān)煙草代謝組學(xué)研究提供借鑒。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 采用超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-SQDMS)方法測(cè)定成熟期煙草鮮葉樣 本中的游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)不合格的褐化樣本中的大部分游離氨基酸含量顯著變化，谷 氨酸與谷氨醜胺含量的比值明顯降低。
[0029] 待測(cè)樣本包括福建、貴州、湖南等7個(gè)省份、7個(gè)品種、15個(gè)產(chǎn)地，5個(gè)不同生育期的 212份煙草鮮葉樣本。其中中部葉成熟時(shí)期的福建龍巖云煙87,貴州矜南的畢納1號(hào)、湖南 張家界的K326等煙草鮮葉樣本及云南大理現(xiàn)蕾期中煙100及下部葉成熟期紅大，貴州遵義 盛花期紅大樣本因液氮不足等原因已完全褐化，河南許昌的鮮葉樣本部分質(zhì)變，其他樣本 保存完好。
[0030] 樣本分析步驟如下所述：
[0031] 1，煙草鮮葉樣本采集：
[003引煙草鮮葉樣本在不同產(chǎn)地大田種植，到達(dá)一定生育期后采樣，-196C液氮保存，運(yùn) 輸，液氮條件下研磨，低溫凍干，-8(TC冰箱儲(chǔ)存。
[0033] 2,游離氨基酸測(cè)定方法：
[0034] 煙草鮮葉樣本從-8(TC冰箱中取出，4 C冰箱過夜放置后，室溫下放置1小時(shí)。準(zhǔn)確 稱取35mg煙草鮮葉樣本，加入2mL70%C2H日0H(含內(nèi)標(biāo)降額氨酸5mg/L)，搖床16化pm, 25°C， Ih提取，300化pm離也，0. 22 y m過濾后，采用柱前6-氨基唾晰-N-玻巧醜亞胺甲醋（AQC)衍 生，具體衍生步驟為；7〇y L P服.8的測(cè)酸鹽緩沖液(來自waters公司的Waters AccQ-化g derivation kit衍生試劑盒)，加入eppendorf管(德國E：ppendorf公司）中，加入10 y L樣品 或者氨基酸混標(biāo)溶液，潤旋5-10砂，再加入20 y L衍生試劑，潤旋5-10砂，室溫下放置Imin 左右，于55 °C加熱lOmin。衍生完成后，利用超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-SQDMS ) 進(jìn)行分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)煙草新鮮煙葉中氨基酸進(jìn)行定量。
[0035] 3)對(duì)所有樣本進(jìn)行游離氨基酸分析，色譜柱Waters UPLC ClScolumn(粒 徑1. 7 y m，內(nèi)徑2. 1mm，柱長100mm);流動(dòng)相A ;20mM甲酸饋，0. 5%甲酸，1%己膳， 98. 5%水，流動(dòng)相B ;1. 6%甲酸，98. 4%己膳（v/v);流速；0. 35血/min ;柱溫；55 °C ;進(jìn)樣 體積；ly L ;進(jìn)樣器溫度；15°C ;洗脫梯度為；0-1.08min，0. 1%-0. 1%B ;1.08-11.48min， 0. P/o-9. P/oB ;11. 48-16. 3min，9. P/o-21. 2〇/〇B ;16. 3-16. 9min，21. 2〇/〇-59. 6〇/〇B ;16. 9-18. Imin， 59. 6%-59. 6%B ;18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B。質(zhì)譜方法；ESI 正 離子模式下，分段SIR掃描，毛細(xì)管電壓；3KV，錐孔電壓；30V，脫溶劑氣溫度；30(TC，錐孔溫 度；12(TC，脫溶劑氣流量；650L/h，錐孔氣流量；5化A。
[0036] 該分析條件下獲得了上述212份煙草鮮葉中29種游離氨基酸及胺的絕對(duì)含量，發(fā) 現(xiàn)谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值變化顯著，見表1。
[0037] 表1實(shí)施例1所用的實(shí)驗(yàn)材料信息及谷氨酸與谷氨醜胺含量的比值
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì)量進(jìn)行判別的方法，其特征在于：通過檢 測(cè)煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨酰胺含量，計(jì)算其比值，對(duì)代謝組學(xué)研究中的煙草鮮葉樣本質(zhì) 量進(jìn)行判別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：其具體方法為：將煙草鮮葉中加入含內(nèi) 標(biāo)的提取溶劑，提取后離心過濾，采用6-氨基喹啉-N-琥珀酰亞胺甲酯（AQC)衍生后，利用 超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-SQDMS)進(jìn)行分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出谷氨酰胺 和谷氨酸的含量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述判別方法，其特征在于：所述內(nèi)標(biāo)為降纈氨酸，其含量為5mg/L， 所述提取溶劑為含乙醇70%的水溶液；所述煙草鮮葉與含內(nèi)標(biāo)的提取溶劑按質(zhì)量/體積比 加入量為=35:1-3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：超高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜 (UPLC-SQDMS)的條件為：色譜柱 Waters UPLC C18column;流動(dòng)相 A :20mM 甲酸銨，0.5% 甲酸，1%乙腈，98. 5%水，流動(dòng)相B :1. 6%甲酸，98. 4%乙腈（v/v);流速：0. 35mL/min ;柱 溫：55°C ;進(jìn)樣體積：luL ;進(jìn)樣器溫度：15°C ;洗脫梯度為：0-1.08min，0. l%-0. 1%B ; 1. 08-11. 48min，0. l%-9. 1%B ;11. 48-16. 3min，9. 1%-21. 2%B ;16. 3-16. 9min，21. 2%-59. 6%B ; 16. 9-18. lmin，59. 6%-59. 6%B ; 18.1-18.28min，59.6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B ; 質(zhì)譜方法：ESI正離子模式下，分段SIR掃描，毛細(xì)管電壓：3KV，錐孔電壓：30V，脫溶劑氣溫 度：300°C，錐孔溫度：120°C，脫溶劑氣流量：650L/h，錐孔氣流量：50L/h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：所述煙草鮮葉是經(jīng)_196°C液氮罐保存 運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，凍干，-80°C冰箱保存待用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：以谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值為指 標(biāo)，建立區(qū)分代謝組學(xué)正常樣本、部分褐化及褐化樣本的標(biāo)準(zhǔn)，即待測(cè)樣本中谷氨酸與谷氨 酰胺比值在0.67以上的為合格樣本，用于煙草代謝組學(xué)分析；谷氨酸與谷氨酰胺比值在 〇. 12以下的為變質(zhì)的不合格樣本，谷氨酸與谷氨酰胺比值介于0. 12與0.67之間為部分質(zhì) 變的不合格樣本。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104422741SQ201310401114
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】許國旺, 張俊杰, 路鑫, 趙春霞, 常玉瑋, 趙燕妮, 沈丹紅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所