專(zhuān)利名稱(chēng)：Plac8活性抑制劑用于調(diào)控脂肪生成的用途的制作方法
PIac8活性抑制劑用于調(diào)控脂肪生成的用途本發(fā)明關(guān)注PlacS，即一種牽涉脂肪生成調(diào)控的新型靶物以及用于鑒定此靶物活性的調(diào)控劑的篩選測(cè)試。此外，本發(fā)明涉及PlacS活性的調(diào)控劑及其調(diào)控脂肪生成并且如此治療肥胖及相關(guān)病癥的用途，尤其在藥物組合物中。肥胖是許多病癥的一項(xiàng)主要風(fēng)險(xiǎn)因素，所述病癥包括高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、血脂異常(dyslipidemia)、胰島素抗性和2型糖尿病。由于肥胖流行的重要性，大量的調(diào)查已經(jīng)集中于脂肪細(xì)胞生物學(xué)，包括產(chǎn)生新脂肪細(xì)胞的發(fā)育途徑。脂肪生成是未分化的間充質(zhì)前體細(xì)胞變?yōu)槌墒斓闹炯?xì)胞的過(guò)程。在整個(gè)過(guò)去的十年期間，已經(jīng)在闡明脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制方面做出了相當(dāng)大的進(jìn)展，所述脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制牽涉序貫激活來(lái)自數(shù)個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子諸如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/ΕΒΡα、α、和γ)和核激素受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPARy) (Rosen, Ε. D.等，2002)。PPARy被描述為脂肪生成的一種“主要調(diào)節(jié)劑”，因?yàn)樵隗w外和在體內(nèi)都已經(jīng)顯示了它對(duì)于脂肪生成既是足夠的也是必要的。最近，已經(jīng)描述了新的轉(zhuǎn)錄因子參與脂肪生成，諸如KLF家族(KLF2、5和KLF15) (Baner jee, S. S.等，2003 ；Gray, S. Μ.等，2002)、Ebf 家族(Jimenez,Μ. Α.等，2007)及 Krox 20 (Chen, Ζ.等，2005)，這提示了脂肪生成過(guò)程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)比先前所想的復(fù)雜得多。 此外，還已經(jīng)描述了信號(hào)傳導(dǎo)分子和/或受體諸如分泌性蛋白質(zhì)的Wnt家族(Kang S.等， 2007)、Shh蛋白(sonic hedgehog protein)、Notch受體牽涉導(dǎo)致脂肪細(xì)胞形成的分子事件。有趣的是，注意到胞外和胞內(nèi)事件以某種方式偶聯(lián)以調(diào)節(jié)脂肪生成。所有這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑會(huì)聚于受到緊密調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)，其需要更為完整的了解以潛在地控制脂肪細(xì)胞發(fā)育，并預(yù)防肥胖。脂肪組織中的脂肪貯存是有限的，并且超過(guò)此容量導(dǎo)致脂質(zhì)在其它組織中，特別在肌肉、肝、和內(nèi)分泌胰腺中積累，而且導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌各種脂肪因子(adipokine)。脂肪組織由位于不同解剖部位的數(shù)種沉積物組成，所述位于不同解剖部位的沉積物可以源自獨(dú)特的前體，而且具有不同的生理學(xué)功能和病理生理學(xué)作用。與皮下脂肪庫(kù)(adipose depot) 形成對(duì)比，內(nèi)臟脂肪庫(kù)可以更多地促成與代謝綜合征有關(guān)的缺陷。已經(jīng)在葡萄糖代謝和2型糖尿病中發(fā)揮至關(guān)重要作用的所有器官，即脂肪組織、 胃腸道、肝、骨骼肌和胰腺中鑒定出大麻素1受體。已經(jīng)顯示了利莫那班(Rimonabant)(臨床使用的第一種選擇性大麻素受體I(CBlR)拮抗劑)降低食物攝取和體重，如此改善葡萄糖代謝調(diào)節(jié)。然而，仍需要用于治療肥胖的新型治療靶物。已知胎盤(pán)8蛋白(PlacS)是一種胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)分子，盡管已經(jīng)報(bào)告了它具有推定的信號(hào)肽(Rogulski，K.等，2005)。最近，生成了 PlacS敲除小鼠，并且其展現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答受損(Ledford，J.G.等，2007)。PlacS在免疫細(xì)胞中，及在其它細(xì)胞類(lèi)型中的作用和功能仍未知。發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，PlacS在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。如此，認(rèn)為PlacS是用于調(diào)控脂肪生成及用于治療肥胖及相關(guān)病癥的一種新型相關(guān)靶物。還可以使用對(duì)PlacS的抑制來(lái)降低脂肪生成以降低皮下和內(nèi)臟脂肪積累。
發(fā)明詳述本發(fā)明被吸引到用于調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪細(xì)胞中的代謝功能的方法。本發(fā)明在于PlacS活性抑制劑用于調(diào)控脂肪生成，特別是用于治療肥胖及相關(guān)病癥的用途。本發(fā)明還關(guān)注含有脂肪生成及相關(guān)病癥的此類(lèi)調(diào)控劑的藥物組合物和用于此類(lèi)調(diào)控劑的篩選測(cè)試。發(fā)明人已經(jīng)鑒定出PlacS在脂肪生成調(diào)控中的作用。經(jīng)由轉(zhuǎn)錄物組學(xué) (transcriptomic)方法，他們鑒定出其表達(dá)與喂養(yǎng)高脂肪飲食的C57BI/6小鼠分組中的體重增加相關(guān)聯(lián)的基因。然后，他們進(jìn)行第二項(xiàng)分析以評(píng)估通過(guò)用利莫那班處理高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。保留如下的基因，其先前尚未在脂肪細(xì)胞生物學(xué)中描述過(guò)， 但是其可以牽涉重要的生物學(xué)過(guò)程諸如信號(hào)傳導(dǎo)、修飾胞外基質(zhì)蛋白、和基因轉(zhuǎn)錄。這些基因?qū)τ谥旧啥钥梢允侵匾?，特別是因?yàn)樗鼈兛赡軤可胬前嘟档托∈笾械闹举|(zhì)量的機(jī)制。在此背景中，PlacS鑒定為牽涉脂肪細(xì)胞代謝，特別是新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。更一般地，此基因表現(xiàn)為在脂肪生成和控制肥胖中的脂肪組織發(fā)育方面發(fā)揮作用。本發(fā)明在于鑒定PlacS活性的調(diào)控劑。此類(lèi)調(diào)控劑可以是能夠調(diào)控PlacS活性的任何化合物或分子，特別是小分子、脂質(zhì)和siRNA?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)藥劑調(diào)控PlacS活性的能力來(lái)鑒定PlacS活性調(diào)控劑。PlacS的抑制劑是能夠完全或部分降低或抑制PlacS活性的任何化合物。PlacS的抑制劑包括但不限于干擾PlacS與其天然配體在胞內(nèi)區(qū)室中的相互作用的藥劑、在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低PlacS 表達(dá)的藥劑、及抑制牽涉PlacS的胞內(nèi)信號(hào)的藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用完全或部分抑制PlacS轉(zhuǎn)錄的小分子來(lái)降低PlacS 活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)鑒定此類(lèi)調(diào)控劑，像報(bào)告系統(tǒng)，其在于與報(bào)告基因以符合讀碼框方式連接且在合適的細(xì)胞系中表達(dá)的PlacS啟動(dòng)子；報(bào)告基因產(chǎn)物的活性可以定量測(cè)量。如此，通過(guò)例如抑制激活轉(zhuǎn)錄因子來(lái)抑制報(bào)告基因表達(dá)的化合物可以認(rèn)為是潛在的候選物。可以在此類(lèi)報(bào)告系統(tǒng)中使用的報(bào)告基因是眾多的，而且是本領(lǐng)域中公知的。例如， 此類(lèi)報(bào)告基因可以是容許綠色熒光蛋白(GFP)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等表達(dá)的基因。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種用于篩選PlacS活性抑制劑的方法，其包括下列步驟a)用包含與報(bào)告基因連接的PlacS啟動(dòng)子的報(bào)告構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；b)在容許所述報(bào)告基因表達(dá)的條件中培養(yǎng)所述細(xì)胞系；c)將候選化合物添加入所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，并d)將抑制劑化合物鑒定為是那些具有降低或抑制所述報(bào)告基因表達(dá)的能力的化合物。要在上文所描述的用于PlacS轉(zhuǎn)錄調(diào)控劑的篩選測(cè)試中使用的預(yù)測(cè)的PlacS啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 23。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用小干擾RNA(SiRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA)經(jīng)由RNA 干擾來(lái)調(diào)控PlacS表達(dá)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，諸如能夠介導(dǎo)針對(duì)PlacS基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)的短干擾核酸(siNA)、短干擾 RNA (siRNA)、雙鏈RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、和短發(fā)夾RNA (shRNA)分子，包括此類(lèi)小核酸分子的混合物及此類(lèi)小核酸分子的合適的配制劑。已經(jīng)在秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)系統(tǒng)中首次描述了 RNAi介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，其中報(bào)告了長(zhǎng)雙鏈RNA分子的顯微注射。RNA介導(dǎo)的基因失活機(jī)制在迄今已經(jīng)調(diào)查的各種生物體中似乎略有不同。然而，在所有系統(tǒng)中，RNA介導(dǎo)的基因沉默基于由內(nèi)切核酸酶Argonauts誘導(dǎo)的對(duì)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后降解，所述內(nèi)切核酸酶Argonauts是所謂的RISC復(fù)合物的一部分。降解的序列特異性是由加載入RISC復(fù)合物中的特異性反義RNA 鏈的核苷酸序列決定的。將SiRNA化合物導(dǎo)入細(xì)胞中產(chǎn)生如下的細(xì)胞，其具有降低水平的靶mRNA，和如此降低水平的相應(yīng)多肽及并發(fā)地降低水平的相應(yīng)酶活性?？梢允褂萌绫疚闹兴枋龅膶?duì)PlacS特異性的SiRNA作為PlacS活性的調(diào)控劑， 以降低PlacSmRNA的翻譯。更具體地，可以使用對(duì)PlacS特異性的siRNA來(lái)降低脂肪生成并如此治療肥胖及相關(guān)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種雙鏈核酸分子，諸如siRNA分子，其中一條鏈包含與靶PlacS核酸分子中預(yù)先確定的PlacS核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核苷酸序列或其部分。可以使用經(jīng)修飾的或未修飾的RNA分子。修飾的一個(gè)例子是摻入三環(huán) (tricylo)-DNA以容許寡核苷酸的血清穩(wěn)定性改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定的PlacS核苷酸序列是本文中所描述的PlacS核苷酸靶序列(SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 3)。由于不同生物體或不同受試者間基因組的序列變異性的潛力，廣泛治療性應(yīng)用的 siRNA分子的選擇有可能牽涉基因的保守區(qū)。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下的 siRNA分子，其靶向基因組的保守區(qū)或不同靶物間保守的區(qū)域。設(shè)計(jì)為靶向各種靶物的保守區(qū)的siRNA分子在多種多樣的患者群體中實(shí)現(xiàn)對(duì)PlacS基因表達(dá)的有效抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種雙鏈短干擾核酸分子，其下調(diào)靶PlacS 基因的表達(dá)或指導(dǎo)對(duì)靶RNA的切割，其中所述siRNA分子包含約15至約28個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選地約19個(gè)堿基對(duì)。本發(fā)明的siRNA或RNAi抑制劑可以化學(xué)合成、自載體表達(dá)或酶促合成。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對(duì)Plac8特異性的siRNA是具有序列SEQ IDN0. 5或SEQ ID NO. 6或SEQ ID N0. 7的shRNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)Plac8特異性的siRNA是具有序列SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 7的shRNA，而在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)Plac8 特異性的siRNA是具有序列SEQ IDN0. 6的shRNA。依照本發(fā)明的siRNA的使用導(dǎo)致mRNA水平從相應(yīng)野生型細(xì)胞的mRNA水平降低 5%至20%，優(yōu)選地5%至15%，更優(yōu)選地5%至10%。野生型細(xì)胞是導(dǎo)入編碼siRNA化合物的核酸前的細(xì)胞，其中靶定的mRNA不被siRNA化合物降解。PlacS活性抑制劑可以通過(guò)任何合適的路徑局部或系統(tǒng)施用，這取決于分子的性質(zhì)和期望的效果。依照本領(lǐng)域中所使用的方案，在雙鏈分子的情況中可以直接在靶定組織中局部施用siRNA，或者在shRNA的情況中可以經(jīng)由載體施用siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用shRNA分子來(lái)獲得RNAi。shRNA構(gòu)建體編碼莖-環(huán)RNA。 導(dǎo)入細(xì)胞中后，此莖-環(huán)RNA被加工成雙鏈RNA化合物，其序列對(duì)應(yīng)于初始RNA分子的莖。 此類(lèi)雙鏈RNA可以依照本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)制備，包括體外和體內(nèi)方法，如但不限于記載于 Sahber 等(1987)，Bhattacharyya 等，(1990)或 US 5，795，715 的。對(duì)于體內(nèi)施用，可以將shRNA導(dǎo)入質(zhì)粒中。質(zhì)粒衍生的shRNA呈現(xiàn)如下的優(yōu)點(diǎn)，即提供與報(bào)告基因或選擇標(biāo)志的組合和經(jīng)由病毒或非病毒載體投遞的選項(xiàng)。將shRNA導(dǎo)入載體中，然后導(dǎo)入細(xì)胞中，這確保shRNA得到持續(xù)表達(dá)。載體通常傳給子細(xì)胞，容許基因沉默進(jìn)行遺傳。本發(fā)明還提供了包含用于表達(dá)本發(fā)明的shRNA的多核苷酸的載體。例如，這些載體是AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特別是慢病毒載體、腺病毒載體，其可以通過(guò)不同的合適路徑來(lái)施用，包括靜脈內(nèi)路徑、肌肉內(nèi)路徑、直接注射入皮下組織或依照通常的實(shí)踐選擇的其它靶定組織中。siRNA的施用路徑從局部直接投遞變化至系統(tǒng)靜脈內(nèi)施用。局部投遞的優(yōu)點(diǎn)是功效需要的siRNA劑量實(shí)質(zhì)性較低，因?yàn)榉肿颖蛔⑸涞桨薪M織中或者靶組織附近。局部施用還容許siRNA的聚焦投遞。對(duì)于此類(lèi)直接投遞，可以使用裸siRNA?！奥鉺iRNA”指投遞在鹽水或其它簡(jiǎn)單賦形劑諸如5%右旋糖中的siRNA(未修飾的或經(jīng)修飾的)。容易配制和施用此類(lèi)分子使這成為一種有吸引力的治療方法。裸DNA也可以配制入脂質(zhì)，特別是脂質(zhì)體中。siRNA的系統(tǒng)應(yīng)用經(jīng)常是侵入性較小的，而且更重要的是，不限于可自外部足夠接近的組織。對(duì)于系統(tǒng)投遞，可以用膽固醇偶聯(lián)物、脂質(zhì)體或基于聚合物的納米顆粒配制 siRNA。傳統(tǒng)地使用脂質(zhì)體以提供升高的藥動(dòng)學(xué)特性和/或降低的毒性譜。它們?nèi)菰S顯著的且重復(fù)的成功體內(nèi)投遞。目前，使用基于脂質(zhì)的siRNA系統(tǒng)投遞配制劑(特別是向肝細(xì)胞)似乎代表最有希望的用于開(kāi)發(fā)RNAi治療劑的近期機(jī)會(huì)之一。用聚合物諸如動(dòng)力學(xué)多偶聯(lián)物(dynamic polyconjugate)(例如與用于肝細(xì)胞靶向的N-乙酰葡糖胺偶聯(lián)的)和基于環(huán)糊精的納米顆粒配制容許靶向性投遞和內(nèi)體逃脫機(jī)制兩者。其它聚合物諸如 Atelocollagen和殼聚糖容許對(duì)皮下腫瘤異種移植物及對(duì)骨轉(zhuǎn)移的治療性影響。siRNA也可以直接與設(shè)計(jì)為幫助靶向性投遞的分子實(shí)體偶聯(lián)。鑒于siRNA雙鏈體的性質(zhì)，無(wú)活性或有義鏈的存在促成理想的偶聯(lián)位點(diǎn)。偶聯(lián)物的例子是親脂性偶聯(lián)物諸如膽固醇、或基于適體的偶聯(lián)物。還使用陽(yáng)離子肽和蛋白質(zhì)來(lái)與siRNA雙鏈體的帶負(fù)電荷的磷酸酯主鏈形成復(fù)合物?？梢允褂眠@些不同的投遞方法來(lái)將PlacSsiRNA靶向到相關(guān)組織，特別是脂肪組織中。對(duì)于此類(lèi)靶向，可以將siRNA偶聯(lián)至與前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞相互作用的不同分子， 如例如與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用的配體、受體、胰島素受體或本領(lǐng)域中已知的任何分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種藥物組合物，其包含作為活性成分的依照本發(fā)明的 PlacS的調(diào)控劑。這些藥物組合物包含有效劑量的至少一種依照本發(fā)明的調(diào)控劑和至少一種藥學(xué)可接受賦形劑。依照想要的藥學(xué)形式和施用路徑在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的慣常賦形劑中選擇所述賦形劑。本發(fā)明還在于一種用于調(diào)控脂肪生成的方法?？梢允褂盟龇椒▉?lái)治療肥胖或相關(guān)疾病。還可以使用所述方法以便以美容目的降低脂肪積累。PlacS活性調(diào)控劑可用于調(diào)控脂肪生成的治療學(xué)，特別可用于治療和預(yù)防肥胖相關(guān)病癥，特別是2型糖尿病、血脂異常、血壓升高、胰島素抗性、心血管病癥和更一般地代謝綜合征。
依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其涉及一種用于治療上述病理學(xué)的方法，其包括對(duì)患者在體內(nèi)施用有效劑量的依照本發(fā)明的PlacS調(diào)控劑。合適的單位劑量形式包括口服形式，諸如片劑、硬或軟明膠膠囊、粉劑、粒劑和口服溶液或懸浮液、舌下、含服、氣管內(nèi)、眼內(nèi)、鼻內(nèi)形式、通過(guò)吸入、表面、經(jīng)皮、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)形式、直腸形式和植入物。對(duì)于表面應(yīng)用，本發(fā)明的化合物可以作為乳劑、凝膠劑、 軟膏劑或洗劑使用。依照通常的實(shí)踐，適合于每名患者的劑量由內(nèi)科醫(yī)生依照施用路徑、患者的重量和響應(yīng)來(lái)決定。PlacS抑制劑也可用于美容應(yīng)用，以降低有失體面的脂肪積累。對(duì)于美容應(yīng)用，可以在適合于表面使用的配制劑中摻入PlacS抑制劑。PlacS抑制劑可以是小分子或siRNA， 如先前所描述的。本發(fā)明現(xiàn)在通過(guò)參照以下實(shí)施例進(jìn)行描述，所述實(shí)施例僅是例示性的，而并不意圖限制本發(fā)明。實(shí)施例附圖簡(jiǎn)述

圖1 至關(guān)重要的脂肪組織調(diào)節(jié)基因的選擇。維恩圖(Verm diagram)顯示了基于下列標(biāo)準(zhǔn)選擇基因。A)高脂肪飼養(yǎng)在皮下(SCAT或Sq)和內(nèi)臟(VAT)中的相似調(diào)節(jié)。選擇151種基因(對(duì)于SCAT為48種，而對(duì)于VAT為88種)。B)那151種基因中，通過(guò)利莫那班處理調(diào)節(jié)的基因的選擇(對(duì)于SCAT為14種，而對(duì)于VAT為M種)。這導(dǎo)致在這兩種組織中通過(guò)高脂肪飲食和利莫那班調(diào)節(jié)的34種基因的選擇。那些基因中，16種具有與L、M 和H組重量相關(guān)的表達(dá)水平(肥胖有聯(lián)系的)，而18種在每個(gè)亞組中以相同水平受HFD調(diào)節(jié)(肥胖無(wú)聯(lián)系的)。圖2 在多種組織和細(xì)胞類(lèi)型中的Plac8表達(dá)。A)Plac8的Northern印跡，其顯示了多種小鼠組織中的mRNA表達(dá)脾、肌肉(腓腸肌)、心、肺、腎、肝、褐色脂肪組織(BAT)、皮下(SCAT)和內(nèi)臟(VAT)脂肪組織。作為對(duì)照，用亞甲藍(lán)對(duì)膜染色。在右側(cè)顯示了 PlacSmRNA 的大小。B至E 通過(guò)RT-PCR測(cè)量的Plac8的mRNA水平。B)在野生型和0b/0b小鼠(n = 5) *ρ < 0. 05的SCAT和VAT中，數(shù)據(jù)以均值士 sd顯示，并以相對(duì)于設(shè)置于1的對(duì)照SCAT的倍數(shù)增加表示。C)在小鼠的基質(zhì)血管級(jí)分(stromal vascular fraction, SVF)和分離的脂肪細(xì)胞中(n =為每次提取而合并的5只小鼠，將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，顯示了一項(xiàng)代表性的實(shí)驗(yàn))。數(shù)據(jù)以相對(duì)于SCAT SVF表達(dá)的倍數(shù)增加表示。D)在人全組織SCAT和VAT、分離的脂肪細(xì)胞、分離的前脂肪細(xì)胞和體外分化的脂肪細(xì)胞中。數(shù)據(jù)以相對(duì)于任意設(shè)置于1的全組織SCAT表達(dá)的水平表示。E)在DMI處理前第-2天和DMI處理后直至第7天的3T3-L1細(xì)胞中。N=2_3組細(xì)胞。數(shù)據(jù)以相對(duì)于第0天的表達(dá)的水平表示。圖3 =ShRNA對(duì)Plac8表達(dá)和活性的敲低。A)將shRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。將含有針對(duì)Plac8的shRNA序列的pSIREN逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒與pCMVSPORT表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。作為shRNA構(gòu)建體的對(duì)照，我們使用針對(duì)螢火蟲(chóng)螢光素酶蛋白的shRNA (shRNA螢光素酶)。在 Plac8方面測(cè)試3種shRNA。B)用含有針對(duì)螢光素酶(shLuc)或Plac8 (shPlac8)的shRNA 的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞。分化前通過(guò)RT-PCR來(lái)測(cè)量mRNA水平。C)在第9天的分化的3T3-L1的油紅0照片。D)在第9天與在C)中相同的細(xì)胞中通過(guò)RT-PCR測(cè)量的aP2 (分化標(biāo)志物)mRNA 表達(dá)。結(jié)果以均值士 sd 表示，*，P < 0. 05,**, P < 0. 01 ；*#，P < 0.005。 η = 3。圖4 :Plac8cDNA在3T3-L1細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)。A)用表達(dá)Plac8的鼠cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒或空逆轉(zhuǎn)錄病毒作為對(duì)照轉(zhuǎn)導(dǎo)的3T3-L1。在第0天通過(guò)RT-PCR測(cè)量的PlacSmRNA 表達(dá)。B)用含有PlacScDNA的構(gòu)建體或空構(gòu)建體逆轉(zhuǎn)錄病毒(對(duì)照)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分化的3T3-L1 的皿在第4天和第9天的油紅0照片。C)在第9天在相同細(xì)胞中通過(guò)RT-PCR測(cè)量的 PPARy 2(分化標(biāo)志物)mRNA表達(dá)。結(jié)果以均值士sd表示，*，P < 0. 05，**，P < 0. 01。η =3。材料和方法動(dòng)物處理給C57BL/6J小鼠(其是有肥胖傾向的(Collins等2004))喂養(yǎng)高脂肪飲食(HFD) 達(dá)6個(gè)月。6個(gè)月的HFD后，小鼠展現(xiàn)出離散的體重，具有不同程度的葡萄糖不耐性(通過(guò)葡萄糖耐受性測(cè)試所測(cè)量的)。將HFD小鼠分成3組，它們展現(xiàn)出相同水平的葡萄糖不耐性，但是具有低(L)、中等(M)或高(H)體重，并用媒介物(vehicle)或利莫那班(10mg. kg—1. 天_0處理它們及正常食物(chow) (NC)喂養(yǎng)小鼠達(dá)一個(gè)月以正?；?normalize)它們的體重。RNA制備、標(biāo)記和cDNA微陣列上的雜交使用peqGOLD Trifast (peqlab)和氯仿-異戊醇Q4 1)提取從內(nèi)臟和皮下脂肪組織提取來(lái)自每組5只不同小鼠的RNA。用異丙醇沉淀RNA，并通過(guò)在RNeasy柱 (Qiagen)上流過(guò)來(lái)純化。在用Bioanalyzer 2100 (Agilent)擴(kuò)增前和后檢查RNA質(zhì)量。將 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用MessageAmp 試劑盒(Ambion)來(lái)擴(kuò)增RNA。類(lèi)似地?cái)U(kuò)增小鼠通用參照物(Clontech)，并依照發(fā)表的方案(De Fourmestraux等，2004)通過(guò)用Cy5和Cy3的間接技術(shù)來(lái)標(biāo)記脂肪組織和參照RNA兩者。將經(jīng)標(biāo)記的RNA與在洛桑大學(xué)(University of Lausanne) DNA陣列工廠制備的含有17664種cDNA的微陣列雜交。進(jìn)行掃描、圖像、和質(zhì)量控制分析，如先前所發(fā)表的(de Fourmestraux 等，J.Biol. Chem. 2004 279 =50743-53) 將數(shù)據(jù)以10 強(qiáng)度比率(Cy5/Cy3)表示，用打印尖端(print tip)局部加權(quán)線性回歸(Lowess) 方法來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化(normalize)，并基于點(diǎn)質(zhì)量(spot quality)和不完全注釋來(lái)過(guò)濾。用在綜合R檔案網(wǎng)絡(luò)(Comprehensive R Archive Network) (cran.us.r-project.org/)可獲得的用于統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的R軟件來(lái)進(jìn)行所有分析。細(xì)胞培養(yǎng)將3T3-L1 細(xì)胞在具有 10% FBS(Gibco)的 DMEM(Gibco)中于 5% CO2 培養(yǎng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(參見(jiàn)下文)后，容許細(xì)胞在100-mm或60-mm皿中在具有10% FBS的DMEM中生長(zhǎng)至匯合。一旦達(dá)到匯合，將細(xì)胞暴露于含有地塞米松(dexamethasone) (ΙμΜ)、胰島素 (5μ g/ml)、和異丁基甲基黃嘌呤(0. 5μΜ) (DMI)的分化培養(yǎng)基。2天后，將細(xì)胞在含有胰島素(5yg/ml)的培養(yǎng)基中維持，直至準(zhǔn)備好于在第7天收獲。油紅0染色分化7至10天后，將細(xì)胞在PBS中清洗一次，并用甲醛(Formalde-Fresh ；Fisher) 固定15分鐘。如下制備染色溶液，即將0. 5g油紅0在IOOml異丙醇中溶解；混合60ml此溶液與40ml蒸餾水。于室溫1小時(shí)后，將染色溶液過(guò)濾，并添加至皿達(dá)4小時(shí)。然后，除去染色溶液，并用蒸餾水清洗細(xì)胞兩次。shRNA 構(gòu)建體使用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (Clontech)來(lái)構(gòu)建 shRNA。通過(guò)詢問(wèn) Whitehead siRNA 算法(http ://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/)及來(lái)自 Clontech 的 siRNA 設(shè)計(jì)者軟件(http ://bioinfo. clontech. com/rnaidesigner/)來(lái)設(shè)計(jì) Plac8 的靴序列；使用EcoRI和BamHl限制性位點(diǎn)將由這兩種算法呈現(xiàn)的至少兩種序列亞克隆入pSIREN 載體(Clontech)中。選擇三種下列的 Plac8 靴序列SEQ ID NO. 5 (shPlac8_l)、SEQ ID NO. 6 (shPlac8-2)和SEQ ID NO. 7 (shPlac8_3)；作為陰性對(duì)照，使用針對(duì)螢光素酶的siRNA 序列，其具有序列SEQ ID NO. 8 (shLuc)。shRNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染在293T HEK細(xì)胞中測(cè)試shRNA的特異性，所述293T HEK細(xì)胞使用記載于Jordan， Μ.，等Q004)的磷酸鈣方法用含有Plac8cDNA(SEQ ID NO. 21)的表達(dá)載體和表達(dá)針對(duì)螢光素酶(對(duì)照 shLUC)或 Plac8(shPlac8)的 shRNA 的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen 載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)對(duì)細(xì)胞RNA提取物進(jìn)行RT-PCR分析。逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的生成和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (pSIREN Clontech)或 pMSCV 嘌呤霉素質(zhì)粒(pMSCV，Clontech)中構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒。使用記載于Jordan，M.，等Q004)的磷酸鈣方法與編碼gag-pol和VSV-G蛋白的構(gòu)建體一起將病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入^3HEK包裝細(xì)胞中。在存在3μπι曲古抑菌素(Trichostatin)A(Sigma)的情況中在48小時(shí)后收獲上清液，并立即使用或快速冷凍，并于_80°C貯存，供以后使用。在存在PolybreneQy g/ml)的情況中將病毒上清液添加至細(xì)胞達(dá)6小時(shí)，并用新鮮的培養(yǎng)基稀釋兩倍，再持續(xù)15小時(shí)。過(guò)表達(dá)構(gòu)建體使用表達(dá)GFP標(biāo)志物的經(jīng)修飾的pMSCV嘌呤霉素逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(來(lái)自 Clontech)來(lái)使Plac8cDNA進(jìn)入細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。將cDNA(SEQ ID NO. 21)以鈍端插入來(lái)自 pMSCV的多克隆位點(diǎn)的hpal限制性位點(diǎn)中。對(duì)所得的集落測(cè)試正確的取向，并通過(guò)酶切割來(lái)選擇。選擇正確的克隆，將其擴(kuò)增，并用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染3T3-L1細(xì)胞。自脂肪組織分離脂肪細(xì)胞和基質(zhì)血管級(jí)分(SVF)通過(guò)(X)2吸入來(lái)對(duì)8周齡雄性C57BL/6J小鼠(n = 6-8)實(shí)施安樂(lè)死，收集附睪(內(nèi)臟)和皮下脂肪組織，并在含有10mg/ml脂肪酸不多的BSA(Sigma-Aldrich Jt. Louis,MI) 的DMEM培養(yǎng)基中放置。將組織切碎成細(xì)塊，然后在0. 12個(gè)單位/mL I型膠原酶(Sigma) 中于37°C在搖動(dòng)水浴(80Hz)中消化1小時(shí)。然后，將樣品過(guò)濾通過(guò)無(wú)菌250μπι尼龍網(wǎng)孔(Scrynel NY250HC, Milian)以除去未消化的碎片。將所得的懸浮液于1100RPM離心 10分鐘以分開(kāi)SVF與脂肪細(xì)胞。取出脂肪細(xì)胞，并用DMEM緩沖液清洗。然后，將它們?cè)?peqGOUyTriFast試劑(Axonlab)中懸浮，并依照制造商的指令來(lái)分離RNA。將SVF級(jí)分在紅細(xì)胞裂解緩沖液(0. 154mM NH4CiaOmM KHCO3,0. ImM EDTA)中溫育2分鐘。然后，將細(xì)胞于1100RPM離心10分鐘，并在500 μ 1 peqGOLD iTriFast試劑(Axonlab)中重懸浮，用于 RNA分離。RNA提取和實(shí)時(shí)PCR使用peqGOLD Trii^ast試劑依照制造商的指令(Axonlab)從培養(yǎng)的細(xì)胞分離總RNA0 使用隨機(jī)引物和 Superscript II(Invitrogen)來(lái)從 0. 5 μ g 總 RNA 合成第一鏈 cDNA。 使用Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem)來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。對(duì)小鼠基因使用下列引物SEQ ID NO. 9(Plac8-正向)、SEQ ID NO. 10 (Plac8_反向)、SEQ ID NO. 11 (PPAR γ 2_F)、 SEQ ID NO. 12(PPPARy 2-R) , SEQID NO. 13 (Ap2_F)、SEQ ID NO. 14 (Ap2_R)、SEQ ID NO. 15(親環(huán)蛋白A-F)、SEQ ID NO. 16 (親環(huán)蛋白A-R)。對(duì)人基因使用下列引物SEQ ID NO. 17 (hPlac8-F)、SEQ ID NO. 18 (hPlac8_R)、SEQ ID NO. 19 (h 親環(huán)蛋白 A-F)和 SEQID NO. 20 (h親環(huán)蛋白A-R)。Northern 印跡使用peqGOLD TriFast試劑依照制造商的指令(Axonlab)來(lái)分離來(lái)自各種小鼠組織的總RNA。將總RNA(8 μ g)在1，2%瓊脂糖/甲醛凝膠上分開(kāi)，并過(guò)夜轉(zhuǎn)染至尼龍膜。為了作為RNA數(shù)量加載的對(duì)照，用亞甲藍(lán)對(duì)膜染色，之后進(jìn)行隨后的雜交。對(duì)于檢測(cè)PlacS信號(hào)， 使用來(lái)自全長(zhǎng)cDNA小鼠質(zhì)粒的探針(Open Biosystem)。通過(guò)用[α -32p] dCTP (Amersham) 進(jìn)行隨機(jī)啟動(dòng)來(lái)標(biāo)記探針。使用Quiclchib方法依照制造商的指令(Stratagene)來(lái)實(shí)施雜交和清洗。將印跡于_80°C暴露于Hyperfilm ECL(Amersham)達(dá)1天或數(shù)天，這取決于信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果實(shí)施例1 微陣列結(jié)果對(duì)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析以鑒定滿足下列三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的基因(i)受到高脂肪飲食的調(diào)節(jié)，(ii)在內(nèi)臟和皮下脂肪兩者中的表達(dá)受到高脂肪飲食相似的調(diào)節(jié)和 (iii)其表達(dá)通過(guò)利莫那班處理實(shí)現(xiàn)相似的正常化(圖1)。在所使用的CDNA微陣列上存在的約17，000種基因靶物中，34種基因滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，其列于表1中。顯著地，先前已知這些基因中的 10 種，即 Cavl、Fgfl、Fndc3b、Kif5b、Mest、Npr3、Pik3ca、Sparc、Vldlr、和 Wwtrl是脂肪組織發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)劑。這些基因中有一些具有與體重增加相關(guān)的表達(dá)水平(在表1中以灰色顯示)，這提示在肥胖期間在脂肪組織的增生和/或肥大中的潛在作用。這些結(jié)果證實(shí)用于為肥胖的治療性處理鑒定可能的新型靶物的辦法。最重要的是，表1中所引用的許多基因尚未在脂肪組織發(fā)育或生物學(xué)背景中進(jìn)行過(guò)研究。這些基因?qū)儆谙铝蟹N類(lèi)的功能胞外基質(zhì)/細(xì)胞相互作用、細(xì)胞骨架、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、酶、和轉(zhuǎn)錄因子/輔因子。它們有可能牽涉組織重建，且特別是脂肪細(xì)胞發(fā)育。這些基因之一，即PlacS基因及其在脂肪細(xì)胞生物學(xué)中的作用在本文中呈現(xiàn)，而且構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。如本發(fā)明中所使用的Plac8的小鼠和人序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3。
權(quán)利要求
1.用于調(diào)控脂肪生成的PlacS活性抑制劑。
2.依照權(quán)利要求1的抑制劑，其降低脂肪生成。
3.依照權(quán)利要求1或2的抑制劑，其用于治療肥胖及相關(guān)病癥。
4.依照權(quán)利要求1或2的抑制劑，其用于降低內(nèi)臟和/或皮下脂肪積累。
5.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抑制劑，其中所述抑制劑是小分子。
6.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抑制劑，其中所述抑制劑是小干擾RNA。
7.依照權(quán)利要求7的抑制劑，其中所述siRNA是具有與SEQID NO. 5或SEQID NO. 6或 SEQ ID NO. 7對(duì)應(yīng)的序列的ShRNA0
8.PlacS活性抑制劑用于制備用于調(diào)控脂肪生成的藥物的用途。
9.具有序列SEQID NO. 6或SEQ ID NO. 7的核酸。
10.作為對(duì)Plac8轉(zhuǎn)錄抑制特異性的siRNA的核酸。
11.用于篩選PlacS活性抑制劑的方法，包括a)用包含與報(bào)告基因連接的PlacS啟動(dòng)子的報(bào)告構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；b)在容許所述報(bào)告基因表達(dá)的條件中培養(yǎng)所述細(xì)胞系；c)將候選化合物添加入所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，并d)將抑制劑化合物鑒定為是那些具有降低或抑制所述報(bào)告基因表達(dá)的能力的化合物。
12.包含PlacS活性抑制劑和至少一種藥學(xué)可接受賦形劑的組合物。
13.依照權(quán)利要求12的組合物，其用于治療肥胖及相關(guān)疾病。
14.依照權(quán)利要求12的組合物，其用于降低內(nèi)臟和/或皮下脂肪積累。
15.調(diào)控脂肪生成的方法，其在于對(duì)有所需要的患者施用PlacS抑制劑以調(diào)控脂肪生
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注Plac8，即一種牽涉脂肪生成調(diào)控的新型靶物。使用siRNA方法，發(fā)明人證明了前脂肪細(xì)胞和脂肪組織中Plac8活性的降低誘導(dǎo)脂肪生成的降低。如此，本發(fā)明涉及Plac8活性的調(diào)控劑以及用于鑒定此靶物活性的調(diào)控劑的篩選測(cè)試，及其調(diào)控脂肪生成并且如此治療肥胖及相關(guān)病癥的用途，尤其在藥物組合物中。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102203128SQ200980144014
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者伯納德·索倫斯, 卡林·波辛, 瑪麗亞·吉門(mén)內(nèi)茲, 迪亞納·霍爾 申請(qǐng)人:賽諾菲-安萬(wàn)特