一種抑制腸道病毒71的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，具體地，涉及一種抑制腸道病毒71的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病在世界多個(gè)地區(qū)，尤其是亞洲爆發(fā)并流行，且其感染率和死亡率逐年 增高，危害十分嚴(yán)重。腸道病毒71 (Enterovirus 71，EV71)是手足口?。℉and, foot, and mouth disease，HFMD)的主要病原體，以感染嬰幼兒為主，其感染常伴隨神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥， 嚴(yán)重可導(dǎo)致兒童死亡。目前，雖有一些針對(duì)EV71復(fù)制周期抗病毒藥物、EV71的疫苗開發(fā)、 RNA等方面的報(bào)道，但迄今為止，還沒有找到行之有效的預(yù)防措施及治療方法。
[0003] 為了找到EV71感染的有效治療方法，目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在藥物研發(fā)方面已經(jīng)取 得了一些研宄成果。一是利用現(xiàn)有的抗病毒藥物治療手足口?。欢且罁?jù)EV71的分子生物 學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成現(xiàn)有抗病毒藥物的衍生物；三是篩選新的抗EV71的藥物。但是現(xiàn)今取得 的抗EV71成果大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，能否被應(yīng)用于臨床治療，還有待深入的研宄。目前 抗EV71的藥物主要包括以下幾種：受體結(jié)合阻斷劑、病毒衣殼阻斷劑、酶抑制劑和核苷類 似物等。研宄發(fā)現(xiàn)EV71的受體不只一種，包括清道夫受體B2 (Human scavenger receptor class B, member 2, SCARB2)、P 選擇素糖蛋白配體（Human P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1/CD162)等?？筍CARB2抗體和可溶的SCARB2結(jié)合劑能夠阻止EV71的侵 入。可溶性的PSGL-I單克隆抗體和純化的唾液酸多糖也能阻斷EV71的感染。但在EV71 滴度較高的情況下，這些受體結(jié)合阻斷劑都不能有效的抑制感染，這可能與EV71存在多 種細(xì)胞受體有關(guān)。因此，只針對(duì)一種受體的抑制劑不能徹底抑制病毒的感染。
[0004] 普拉康納利（Pleconaril)是一種病毒衣殼阻斷劑，能夠通過與病毒的蛋白衣殼 結(jié)合而干擾病毒的吸附和脫殼，是一類廣譜的抗微小核糖核酸病毒藥物。其咪唑啉酮衍生 物，能夠抑制EV71在橫紋肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RD)細(xì)胞中引起的病變效應(yīng)且細(xì)胞毒 性較低。
[0005] 蛋白酶是微小核糖核酸病毒屬病毒復(fù)制所必需的特異蛋白酶之一。蘆平曲韋 (Rupintrivir)是根據(jù)鼻病毒3C結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的抗病毒物質(zhì)。Kuo等根據(jù)蘆平曲韋設(shè)計(jì)了一系 列衍生物，作為EV71蛋白酶3C抑制劑進(jìn)行了驗(yàn)證。最終發(fā)現(xiàn)，其衍生物IOb是一種有前景 的抑制劑，并且沒有明顯的細(xì)胞毒性，但其在體內(nèi)是否仍然具有抗病毒活性有待于進(jìn)一步 驗(yàn)證。
[0006] 隨著EV71分子生物學(xué)研宄的深入，已經(jīng)針對(duì)EV71復(fù)制過程中不同靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了諸 多抗病毒藥物，但對(duì)其在體內(nèi)的抗病毒效應(yīng)及不良反應(yīng)等大多還需進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)和 臨床驗(yàn)證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制腸道病毒71的藥物。
[0008] 兩性霉素 B (Amphotericin B)，是從鏈霉菌中分離而來的一種多稀類抗真菌抗生 素，其結(jié)構(gòu)中含有一羧基和一氨基，故兼有酸堿兩性，對(duì)多種真菌如新型隱球酵母、皮炎芽 酵母、巴西芽酵母、莢膜組織胞漿菌、申克氏側(cè)孢霉、白假絲酵母和若干諾卡氏菌等有顯著 的抑菌作用。被稱為治療深部真菌感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"，耐藥率低、抗菌譜廣。該藥物已廣泛應(yīng) 用于抗真菌感染的臨床治療中。
[0009] 本發(fā)明經(jīng)過大量試驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)臨床上用于治療真菌感染的兩性霉素 B具有抑制 腸道病毒71的作用。
[0010] 因此本發(fā)明提供一種抑制腸道病毒71的藥物，含有多烯類抗真菌抗生素。
[0011] 進(jìn)一步，所述多烯類抗真菌抗生素為兩性霉素 B或其衍生物。
[0012] 本發(fā)明提供的抑制腸道病毒71的藥物還含有藥學(xué)上可接受的輔料。
[0013] 上述藥物與醫(yī)學(xué)上可接受的載體或賦形劑制成的藥物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0014] 所述制劑為片劑、膠囊劑、粉針劑、噴霧劑或顆粒劑。
[0015] 本發(fā)明還提供了兩性霉素 B或其衍生物在制備抑制或治療腸道病毒71藥物中的 應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明通過藥物毒性試驗(yàn)、藥物對(duì)病毒的抑制試驗(yàn)、病毒斑塊形成試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) 0· 5 μ M的兩性霉素 B可明顯抑制EV71在293中的感染，在293細(xì)胞中兩性霉素 B抵抗EV71 的半數(shù)抑制濃度為〇. 32 μ M ;2 μ M的兩性霉素 B可抑制EV71在RD細(xì)胞中的感染，在RD細(xì) 胞中兩性霉素 B抵抗EV71的半數(shù)抑制濃度為1. 74 μ Μ。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩性霉素 B是通 過影響EV71病毒的吸附起到抵抗該病毒感染的作用。本發(fā)明為腸道病毒71的預(yù)防和治療 提供了新的藥物，具有較好的市場(chǎng)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為EV71感染兩性霉素 B處理的RD細(xì)胞后病毒蛋白的表達(dá)情況，持家基因 Ac t i η的表達(dá)作為對(duì)照。
[0018] 圖2為EV71感染兩性霉素 B處理的293細(xì)胞后病毒蛋白的表達(dá)情況，持家基因 Ac t i η的表達(dá)作為對(duì)照。
[0019] 圖3為EV71感染兩性霉素 B處理的RD細(xì)胞的不同時(shí)間后病毒蛋白的表達(dá)情況， 用針對(duì)EV71的抗體及病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl的抗體指示病毒蛋白的表達(dá)情況，持家基因 Actin 的表達(dá)作為對(duì)照。
[0020] 圖4為EV71感染兩性霉素 B處理的293細(xì)胞的不同時(shí)間后病毒蛋白的表達(dá)情況， 用針對(duì)EV71的抗體及病毒蛋白VPl的抗體指示病毒蛋白的表達(dá)情況，持家基因 Actin的表 達(dá)作為對(duì)照。
[0021] 圖5為兩性霉素 B處理影響EV71的吸附。用針對(duì)EV71VP1的特異性引物指示病 毒的吸附及進(jìn)入量，持家基因 GAPDH的表達(dá)作為對(duì)照。圖5Α為PCR結(jié)果，圖5Β為實(shí)時(shí)定量 PCR的結(jié)果。
[0022] 圖6為RD細(xì)胞中不同濃度兩性霉素 B抑制EV71感染的情況。
[0023] 圖7為293細(xì)胞中不同濃度兩性霉素 B抑制EV71感染的情況。
[0024] 圖8為RD細(xì)胞中不同濃度兩性霉素 B的細(xì)胞毒性。
[0025] 圖9為293細(xì)胞中不同濃度兩性霉素 B的細(xì)胞毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0027] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的兩性霉素 B，購(gòu)自Sigma公司，溶于DMSO中。EV71病毒株 為安徽阜陽株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研宄所分離得到，將病毒在人惡性胚胎橫紋 肌肉瘤細(xì)胞（RD)中擴(kuò)增，取上清，分裝后_70°C保存。RD細(xì)胞及感染用293細(xì)胞用含10% 胎牛血清、l