專利名稱：利用基于α病毒且靶向高親和性層粘連蛋白受體的載體進(jìn)行腫瘤治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的病毒載體療法，特別是相對于體內(nèi)的正常細(xì)胞來說，可以一種特異性方式來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
背景技術(shù)：
癌癥基因治療在很大程度上受益于一種載體(vector)的提供，這種載體具有一種高效率的基因表達(dá)能力并且具有靶向腫瘤細(xì)胞的能力。已經(jīng)開發(fā)了大量的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來傳遞異源基因進(jìn)入體內(nèi)腫瘤以研究癌癥基因治療，但是所有這些系統(tǒng)都有局限性。例如，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體可以介導(dǎo)穩(wěn)定的基因傳遞，同時可能具有低的免疫原性，所以它們已經(jīng)被用作基因傳遞；然而，它們的傳遞效率相對較低(見，例如，Di Ianni等J.Hematother.Stem.Cell Res.，1999，8645-652；Morling等，Gene Ther.，1995，2504-508；Lam等，Hum.Gene Ther.，1996，71415-1422；Kume等，Stem Cells，1999，17226-232)，而且微生物系變異也是一個潛在的問題(見Thompson，Science，1992，2571854)。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(只有少數(shù)例外)易被人類血液中的血清組分裂解(見Miyao等，Hum Gene Ther，1997，81575-1583；Russell等，Hum Gene Ther，1995，6635-641和Rother等，J Exp Med，1995，1821345-55)。這一點(diǎn)很大程度地限制了它們在體內(nèi)的應(yīng)用。腺病毒載體似乎可以更有效地進(jìn)行體內(nèi)基因的傳遞，但是這些載體只能以一種局限性的方式應(yīng)用，這是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈νㄟ^血流被傳遞的能力(見Duncan等，J GenVirol.，1978，4045-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81 Pt 112605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18723-727)，并且由于腺病毒蛋白的高免疫原性而可能會對病人造成毒性(見Ginsberg，Bulletin ofthe New York Acad.Med.，1996，7353-58和Sparer等，J.Virol.，1997.712277-2284)。
盡管有上述這些進(jìn)展，但是癌癥仍舊是一個需要新的解決方案的主要的公共健康問題。目前，發(fā)展治療載體的努力在于解決載體安全性和治療基因表達(dá)有效性的問題。
α病毒載體的許多性質(zhì)使它們成為其它正在開發(fā)的病毒衍生的基因傳遞系統(tǒng)的所希望的替代選擇，這些性質(zhì)包括如下能力(i)快速地設(shè)計表達(dá)構(gòu)建物，(ii)生產(chǎn)高效價感染粒子原種，(iii)感染不分裂細(xì)胞，和(iv)獲得高水平的表達(dá)(Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58491-562；Liljestrm等，Biotechnology 1991，91356-1361；Bredenbeek等，Semin.Virol.1992，3297-310；Xiong等，Science 1993，2431188-1191)。缺陷型的辛德比斯病毒載體已經(jīng)用來保護(hù)哺乳動物免受原生寄生蟲，蠕蟲寄生蟲，體外寄生蟲、真菌、細(xì)菌和病毒損害(PCT公開號WO 94/17813)。
對于一種編碼委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)的cDNA和制備減毒的外衣病毒的方法已有描述(美國專利號5,185,440)。缺陷型辛德比斯病毒載體已經(jīng)通過將異源序列插入到基因組的結(jié)構(gòu)區(qū)域中制備得到了(美國專利號5,217,879)。另外，基于具有異源序列的新德比斯缺陷型干擾(DI)粒子的RNA載體也已有描述(美國專利號5,091,309)。α病毒，特別是塞姆利基森林病毒，被用于醫(yī)療中來傳遞編碼外源性RNA的異源基因，例如，一種抗原的抗原決定部位或決定簇(PCT公開號WO 95/27069和WO95/07994)。也已經(jīng)公開了從一個α病毒堿基序列的下游異源序列的增強(qiáng)的表達(dá)載體(PCT公開號WO 95/31565)?；讦敛《镜妮d體也用于免疫蛋白產(chǎn)生或蛋白序列表達(dá)(PCT公開號WO 92/10578)。一種用于α病毒載體的cDNA構(gòu)建物可以被引入并在動物或人類細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄(PCT公開號WO95/27044)。
辛德比斯病毒是α病毒屬中的一員，自其發(fā)現(xiàn)以來從1953年開始在世界各地對其已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究(見Taylor等，Egypt.Med Assoc.，1953，36489-494；Taylor等，Am.J.Trop.Med Hyg，1955，4844-862和Shah等，Ind.J.Med.Res，1960，48300-308)。像許多其它α病毒一樣，辛德比斯病毒可以通過蚊向脊椎動物宿主傳遞。α病毒體由一種殼核組成，里面包裹著一脂質(zhì)雙層，在其上具有包膜蛋白。包膜蛋白是與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的媒介，由此導(dǎo)致病毒體的胞吞作用。胞吞后，殼核(衣殼蛋白和染色體組病毒RNA的一種復(fù)合物)沉積入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。辛德比斯病毒基因組是一種11703n的單鏈49S RNA(Strauss等，1984，Virology，13392-110)，在5’末端蓋帽并在3’末端聚腺苷?；；蚪MRNA是(+)-義的并具傳染性，在受感染的細(xì)胞中作為mRNA。基因組RNA的翻譯產(chǎn)生了非結(jié)構(gòu)蛋白，nsP1，nsP2，nsP3和nsP4，它們被生產(chǎn)作為聚蛋白并且是經(jīng)過蛋白水解加工的。感染早期，非結(jié)構(gòu)蛋白，可能與宿主一起利用基因組(+)-義RNA作為模板來生成一個全長的、互補(bǔ)(-)鏈RNA。(-)鏈?zhǔn)呛铣扇L基因組RNA的模板。(-)鏈上的一個內(nèi)部啟動子被用于亞基因組的26S mRNA的轉(zhuǎn)錄，此mRNA和三分之一的基因組RNA的3’末端是共線性的。這一26S亞基因組mRNA被翻譯來產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)聚蛋白，它經(jīng)歷共翻譯和翻譯后裂解來生產(chǎn)結(jié)構(gòu)蛋白C(殼體)，E2和E1(包膜)。殼體蛋白C使基因組RNA包殼來形成殼核。這些與細(xì)胞表面結(jié)合病毒包膜蛋白的胞漿功能域相互作用，導(dǎo)致了殼核包裹入包含包膜蛋白的膜雙層和病毒體后代從受感染細(xì)胞出芽。辛德比斯病毒感染已經(jīng)顯示在宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Levine等，Nature，1993，361；739-742；Jan AND GRIFFIN，J.Virol.，1999，7310296-10302)。
雖然基于辛德比斯病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)在體外已經(jīng)有了很好的研究(見Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58491-562；Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822；Gwag等，Mole.Brain Research.，1998，6353-61；Bredenbeek等，J Virol，1993，67；6439-6446；Liljestrom等，Biotechnology，1991，91356-1361；Piper等，Meth.Cell Biol.，1994，4355-78和Grusby等，Proc Natl.Acad.Sci U S A.，1993，903913-3917)，并且有許多關(guān)于在體內(nèi)辛德比斯病毒轉(zhuǎn)移入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的報道(Duncan等，J Gen Virol.，1978，4045-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81 Pt 112605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18723-727)和抗原呈遞細(xì)胞(見Tsuji等，J Virol，1998，726907-6910；Hariharan等，J Virol，1998，72950-958；Pugachev等，Virology，1995，212587-594和Xiong等，Science，1989，2431188-1191)的報告，但是在體內(nèi)辛德比斯病毒系統(tǒng)的應(yīng)用很受限制。
然而，基于辛德比斯病毒的載體的應(yīng)用的一個主要的缺點(diǎn)在于這些載體被認(rèn)為缺乏有用的靶細(xì)胞特異性(在本發(fā)明之前)。對于哺乳動物細(xì)胞而言，至少一種辛德比斯病毒受體是一種先前被認(rèn)為是高親和性的層粘連蛋白受體(HALR)的蛋白，它的廣分布和高保存性可能是病毒有廣泛宿主范圍的部分原因(Strauss and Strauss，1994，supra；Wang等，J.Virol.1992，664992-5001)。因此人們考慮希望能通過改變辛德比斯病毒載體的向性來達(dá)到向特定靶細(xì)胞類型的基因傳遞的特異性(見PCT公開號WO 98/44132)。這種向性的改變暗示著需要內(nèi)源性的病毒向性的消融和新向性的引入，例如，通過設(shè)計一個包括一個蛋白A的IgG結(jié)合域的嵌合的病毒包膜蛋白。
在成熟的辛德比斯病毒體內(nèi)，一個(+)-義病毒基因組RNA和殼體蛋白C復(fù)合來形成被有兩個整體膜糖蛋白的脂質(zhì)雙層包圍的二十面體的殼核，E1和E2埋置在其中(Strauss and Strauss，1994，supra)。雖然E1和E2形成了一個作為一個單元起作用的異質(zhì)二聚體，但是E2結(jié)構(gòu)域似乎對于與細(xì)胞的結(jié)合尤其重要。能夠中和病毒感染性的單克隆抗體(mAbs)通常是E2種特異性的，在E2中，而不是在E1中的突變通常與改變的宿主范圍和毒性有關(guān)(Stanley等，J.Virol.1985，56110-119；Ohnsted等，Virology1986，148245-254；Polo等，J.Virol.1988，6221242133；Lustig等，J.Virol.，1988，622329-2336)。一種辛德比斯病毒突變體也被鑒別了出來，它包含一個在E2中的插入部分并顯示與哺乳動物細(xì)胞的缺陷型結(jié)合(Dubuisson等，J.Virol.1993，673363-3374)。
總而言之，在此領(lǐng)域仍需要有效的癌癥治療方法。特別是，此領(lǐng)域需要一種有效的治療，它特異性地靶向并破壞腫瘤細(xì)胞而對于正常細(xì)胞沒有重大的不利的后果。本發(fā)明滿足了此領(lǐng)域的所有這些及其它需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療患腫瘤的哺乳動物(例如人類)的新方法，與具有相同品系的正常細(xì)胞相比，此腫瘤表達(dá)較高水平的高親和性層粘連蛋白受體(HAIR)。本發(fā)明的方法包括向患此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種載體以治療腫瘤，其中的載體同HALR具有一種優(yōu)先的親和性。優(yōu)選地，此載體是一種基于病毒的載體。當(dāng)在這里公開時，用在本發(fā)明方法中的優(yōu)選的基于病毒的載體是一種基于α病毒的載體(例如，一種復(fù)制缺陷型基于α病毒的載體)，更優(yōu)選地，一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體。
當(dāng)在這里公開時，除了同HALR具有天然親和性和天然細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)功能的基于α-病毒的載體，本發(fā)明的載體可以從任何能被有效改造成與HALR具有一種優(yōu)先的親和性和具有抗腫瘤活性的粒子或病毒衍生而來。因此，在一個單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，利用與HALR具有一種優(yōu)先親和性并編碼一個抗腫瘤基因的載體。在這里公開時，這種抗腫瘤基因可以是自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因或一種細(xì)胞因子編碼基因。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種利用基于α病毒的載體治療一種患腫瘤的哺乳動物(例如人類)的方法，其中載體沒有被修飾來特異性地靶向腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選基于α病毒的載體是一種辛德比斯病毒載體，更優(yōu)選是一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體。在這里公開時，基于α-病毒的載體可以被修飾來編碼一種異源抗腫瘤基因。
本發(fā)明也包括一種利用被修飾為靶向一特定腫瘤的基于α病毒的載體來治療患腫瘤哺乳動物的方法。因此，當(dāng)在這里公開時，本發(fā)明方法中使用的載體可以被修飾來編碼一種分子，此分子特異性地與腫瘤細(xì)胞中的配體相互作用。根據(jù)具體的實(shí)施方案，載體可以被改造來編碼，例如，包含一個腫瘤特異性受體結(jié)合序列的嵌和的包膜蛋白，與腫瘤特異性結(jié)合位點(diǎn)有親和性的肽模擬物，識別一種腫瘤特異性抗原的免疫球蛋白分子或它的片段，或可與抗病毒受體(例如，抗-HALR)抗體一同施用的蛋白A的IgG-結(jié)合域。
本發(fā)明的方法可以被用來治療各種腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，這一點(diǎn)在發(fā)明詳述和實(shí)施例部分說明。在一特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用來治療實(shí)體瘤，特別是肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤(例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、卵巢腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
按照本發(fā)明，抗腫瘤載體優(yōu)選地通過胃腸外途徑施用給哺乳動物，例如，腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了證據(jù)，即如果接受治療的哺乳動物具有至少部分的免疫系統(tǒng)功能，則此公開的治療腫瘤的方法(特別是用α病毒載體)是特別有效的。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在功能性自然殺傷(NK)細(xì)胞的存在下利用基于辛德比斯病毒的載體的治療腫瘤的方法更有效的證據(jù)。
本發(fā)明還提供殺死腫瘤細(xì)胞的方法(體內(nèi)或體外)，包括使腫瘤細(xì)胞和殺死腫瘤細(xì)胞有效量的載體接觸，其中的載體與HALR具有優(yōu)先的親和性并且可以或可以不編碼一種異源抗腫瘤基因。優(yōu)選地，載體是一種復(fù)制缺陷型基于α病毒的載體，更優(yōu)選地是一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體。
此外，本發(fā)明還有利地提供了治療患腫瘤的哺乳動物用的藥物組合物，包括一個載體和一種藥學(xué)上可接受的媒介物(carrier)(為了便于區(qū)別，在本文中，將vector譯作載體，而將carrier譯作媒介物)或稀釋劑，其中的載體具有同HALR優(yōu)先的親和性并能有效地殺死腫瘤，前提是，如果載體是一種基于α病毒的載體，它沒有被修飾用來靶向一種腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。這些藥物組合物可被用來治療與具有相同品系的正常細(xì)胞相比表征為提高的水平的HALR表達(dá)的各種腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤。在這里公開時，本發(fā)明的載體可以從與HALR無天然親和性的粒子或病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)衍生得到，通過修飾它們的靶向分子使其包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR結(jié)合域?？蛇x擇的，載體可以是一種基于α病毒的載體，更優(yōu)選的是一種復(fù)制缺陷型辛德比斯病毒的載體，它具有天然靶向性，并且沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
本發(fā)明的藥物組合物中使用的載體可以被修飾來包含一種異源抗腫瘤基因，例如但不限于自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因或一種細(xì)胞因子編碼基因。
本發(fā)明的組合物可以被用來治療各種實(shí)體瘤，特別是肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤(例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、卵巢的惡性腺瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
在一個獨(dú)立的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物，特別是包含α病毒載體的組合物，如果施用給具有至少一種部分的免疫系統(tǒng)功能的哺乳動物(例如通過胃腸外途徑)會特別有效，優(yōu)選包含功能性天然殺傷(NK)細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明達(dá)到了發(fā)明的這些和其它的目標(biāo)，這一點(diǎn)在發(fā)明詳述和實(shí)施例(包括附圖)中會更詳細(xì)地描述。


圖1.基于辛德比斯病毒表達(dá)和輔助載體的代表圖示。SinRep/LacZ是一種基于辛德比斯病毒的表達(dá)載體，它包括包裝信號、用于復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄物的非結(jié)構(gòu)蛋白基因和LacZ基因。DH-BB是一個親本的輔助質(zhì)粒，它包括用來包裝辛德比斯病毒基因組必需的結(jié)構(gòu)蛋白(殼體、E3、E2、6K和E1)的基因?？s寫詞PSG，辛德比斯病毒亞基因組啟動子；C，殼體；NSP1-4，非結(jié)構(gòu)蛋白基因1-4；POLY A，聚腺苷酸化信號。沒有顯示的是SinRep/Luc和SinRep/IL12載體，它們與SinRep/LacZ基本相似。SinRep/Luc包括一個編碼螢火蟲熒光酶基因(Luc)而不是LacZ的DNA片段(亞克隆至SinRep載體的Xba I位點(diǎn))。SinRep/IL12包含鼠的IL12α-亞單位和β-亞單位基因(亞克隆至在Sph I位點(diǎn)下游的Mlu I位點(diǎn)和Stu I位點(diǎn))和一個位于Sin Rep/LacZ原始亞基因組啟動子下游的第二亞基因組啟動子DNA。
發(fā)明詳述本發(fā)明有利地利用簡單的α病毒載體和現(xiàn)有的抗腫瘤載體來進(jìn)行有效的抗腫瘤治療。本發(fā)明部分是基于這樣一個意想不到的發(fā)現(xiàn)，即一種復(fù)制缺陷型α病毒載體是一種有效的抗癌治療劑。因此，本發(fā)明提供一種利用一種基于α病毒的載體治療患腫瘤哺乳動物(如人類)的方法，其中的載體沒有被修飾去特異性地靶向腫瘤。優(yōu)選地，基于α病毒的載體是一種基于辛德比斯病毒的載體，更優(yōu)選地，是一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體。
特別地，本發(fā)明部分是基于這樣一個對一種復(fù)制缺陷型辛德比斯病毒載體的觀察，它其中的結(jié)構(gòu)基因被刪除并被例如與一種鄰近編碼序列5’末端的辛德比斯病毒亞基因組和一種在編碼序列3’末端的多聚腺苷酸化信號操作性地相聯(lián)系的一種異源報告基因(例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶)所替代，它能夠有效地在體內(nèi)靶向腫瘤細(xì)胞。已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)未被進(jìn)行關(guān)于靶向的修飾的辛德比斯載體，顯示與體外或體內(nèi)生長的腫瘤細(xì)胞的高親和性并且能夠有效地誘導(dǎo)導(dǎo)致腫瘤衰退的它們的死亡，并使試驗(yàn)的患腫瘤的動物具有長的存活期(甚至在缺少任何異源抗腫瘤基因有效負(fù)荷的情況下)。
在這方面，本發(fā)明提供一種出乎意料地有效的利用病毒載體與標(biāo)準(zhǔn)基因治療相違背的方法。在基因治療中，載體是一種輸送治療基因的介質(zhì)。在癌癥基因治療的情況下，治療基因?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。用于癌癥基因治療的典型治療基因(“腫瘤治療基因”)的例子包括但不限于，腫瘤抑制基因(如p53和RB)；抗致癌基因細(xì)胞內(nèi)抗體(如抗-Ras和抗-Raf抗體)；一種能夠酶促地將一種前藥轉(zhuǎn)化成對腫瘤細(xì)胞有毒的一種化合物的蛋白(如單純皰疹病毒胸苷激酶[HSV-tk]，它與更昔洛韋形成一種毒素)；水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶[VZV-tk]，它與6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷形成一種毒素；或一種細(xì)菌的胞嘧啶脫氨酶，它與5-氟胞嘧啶形成一種毒素)；或一種能夠提高抗腫瘤免疫性的免疫刺激蛋白(如FLT-3配體、GM-CSF、II-2、IL-7、IL-12和IL-13)。雖然本發(fā)明載體中的任何這種“腫瘤治療基因”的存在都能夠提高抗腫瘤作用(如通過比較一種編碼一種標(biāo)記基因[LacZ]的載體和一種編碼一種細(xì)胞因子基因[IL12]的載體所示；見實(shí)施例1，下文)，但是在此公開時如果載體是一種天然凋亡的α(病毒載體，則這種基因的存在對于獲得治療有效性不是必需的。因此，本發(fā)明的基于辛德比斯病毒的載體根本不需要攜帶任何異源編碼序列。然而，在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的用于治療的活性辛德比斯病毒載體編碼一種異源標(biāo)記基因，如β-半乳糖苷酶、熒光素酶或潮霉素-EGFP。在另一個實(shí)施方案中，這些載體編碼一種異源抗腫瘤治療基因，例如一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因或一種細(xì)胞因子編碼基因。
本發(fā)明第一次利用一種α病毒(特別是辛德比斯病毒)對腫瘤細(xì)胞(特別是與具有相同品系的正常細(xì)胞相比表達(dá)更高水平高親和性層粘連蛋白受體(HALRs)的腫瘤細(xì)胞)的天然親和性。術(shù)語“高親和性層粘連蛋白受體”即“HALR”具有本領(lǐng)域所知的普通含義，即可以作為辛德比斯病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體的Mr67,000層粘連蛋白受體(見Wang等，J.Virol.1992，664992-5001；Strauss等，Arch.Virol.Suppl.1994，9473-84)?；谶@一發(fā)現(xiàn)，很清楚的是修飾任何載體使其靶向HALR都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明提供治療患腫瘤的哺乳動物(如人類)的方法，在該患者中，與相同品系的正常細(xì)胞相比，表達(dá)高水平高親和性層粘連蛋白受體(HALR)。所述方法包括給予患腫瘤的哺乳動物治療腫瘤有效量的載體，其中所述載體優(yōu)先親合HALR。該載體衍生自被有效改性而對HALR具有優(yōu)先親合性并具有抗腫瘤活性的任何粒子或病毒。
盡管，不被任何具體的理論所限制，但是先前沒有一同考慮的三項(xiàng)觀察，可以說明本發(fā)明的基于辛德比斯載體治療的顯著的抗腫瘤效果的原因。第一，HALR可以作為辛德比斯病毒進(jìn)入多數(shù)物種細(xì)胞的受體(Wang等，J.Virol.，1992，664992-5001；和Strauss等，Arch.Virol.Suppl.，1994，9473-484)。第二，廣泛認(rèn)為HALR(Mr 67,000)的表達(dá)在多種癌癥中有顯著地提高(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)。實(shí)際上，在提高的Mr 67,000 HALR表達(dá)與多種癌癥相關(guān)乳腺癌(Menard等，1998，supra；Paolo Viacava等，J.Pathol.，1997，18236-44；Martignone等，J.Natl.Cancer Inst.，1993，85398-402)、甲狀腺癌(Basolo等，Clin.CancerRes.，1996，21777-1780)、結(jié)腸癌(Sanjuan et al，J Pathol.，1996，179376-380)、前列腺癌(Menard S等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)、胃癌(de Manzoni等，Jpn J Clin.Oncol.，1998，28534-537)、胰腺癌(Pelosi et aL，J Pathol.，1997，18362-69)、卵巢癌(Menard等，BreastCancer Res.Treat，1998，52137-145和Van den Brule等，Eur J Cancer，1996，32A1598-1602.)、黑素細(xì)胞癌(Taraboletti等，J Natl.Cancer Inst.，1993，85235-240)、肺癌(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)、肝癌(Ozaki等，Gut，1998，43837-842)、子宮內(nèi)膜癌和子宮癌(van den Brule等，Hum Pathol，1996，271185-1191)。實(shí)際上，超過4000例的通過免疫組織化學(xué)研究的不同器官中不同腫瘤的數(shù)據(jù)表明都與HALR在侵入、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長中的作用相符(Menard等，Breast Cancer Res.Treat.，1998，52137-145)。天然的血液生成的辛德比斯載體能夠容易地在血液循環(huán)中移動，并是表達(dá)提高了的水平的HALR的生長和轉(zhuǎn)移腫瘤的發(fā)源地。最后，眾所周知辛德比斯病毒能使哺乳動物細(xì)胞更高程度的凋亡(Levine等，Nature 1993，739-742；Jan等J Virol.，1999；10296-10302；Jan等J Virol.，2000 6425-6432)。細(xì)胞死亡在感染幾小時后開始，事實(shí)上到48-96小時所有被感染細(xì)胞都死亡了(Sawai等，Mol Genet Metab.1999，6736-42；Griffin等，Ann.Rev.，1997，Microbiol.51565-592)。
雖然HALR參與以辛德比斯病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞感染中的證據(jù)有些牽強(qiáng)，但是本發(fā)明的基于辛德比斯病毒的載體和其它基于α病毒的載體與其它腫瘤特異性細(xì)胞內(nèi)決定簇(例如受體)相互作用卻是可能的。換句話說，盡管公開的載體優(yōu)先靶向表達(dá)增強(qiáng)水平的HALRs的腫瘤細(xì)胞，但這可能反映出細(xì)胞的一種特征，而不一定是載體感染細(xì)胞的機(jī)制。本發(fā)明包含任何這種涉及以α病毒介導(dǎo)的感染和腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性的機(jī)制。
如上所述，如果需要的話，本發(fā)明的載體也可以攜帶一種或多種能夠用來提高細(xì)胞毒性的基因的有效負(fù)荷。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用載體來傳遞抗腫瘤治療基因。
重要的是，與腫瘤細(xì)胞相比，本發(fā)明的載體(特別是辛德比斯載體)，好像在體內(nèi)不會感染正常細(xì)胞至相同的程度。這一點(diǎn)允許了在載體治療中的不同的效應(yīng)，例如，被辛德比斯載體感染產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞死亡會導(dǎo)致腫瘤消失，但對于被治療者的其它組織和器官沒有明顯的有害作用。這一現(xiàn)象可以通過此觀察解釋，即與正常細(xì)胞相對比腫瘤細(xì)胞中增高數(shù)量的HALR導(dǎo)致在腫瘤細(xì)胞上有高數(shù)量的暴露的即未占據(jù)的受體(Liotta，L.A.CancerResearch，1986，461-7；Aznavoorian等，1992，Molecular Aspects ofTumor Cell Invasion and Metastasis，pp.1368-1383)。例如，已經(jīng)證明與良性損傷相比，乳腺癌和結(jié)腸癌組織包括更高數(shù)量的暴露的(未占據(jù)的)HALR受體(Liotta等，1985，Exp.Cell Res.，156117-26；Barsky等，Breast CancerRes.Treat.，1984，4181-188；Terranova等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80444-448)。這些在正常細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的、多余的未占據(jù)的HALR受體可以被用來與辛德比斯病毒結(jié)合感染和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
公認(rèn)具有未修飾的細(xì)胞特異性的復(fù)制缺陷型辛德比斯病毒載體具有內(nèi)在的抗腫瘤活性，這允許利用辛德比斯載體的大量的其它的重要性質(zhì)。因此，辛德比斯載體顯示基因傳遞的極高的有效性。它們是(+)-鏈RNA病毒，通過一個在受感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)增過程，它可以在感染后的幾個小時內(nèi)表達(dá)每細(xì)胞105或更高活性的RNA種。RNA擴(kuò)增的這一水平也允許傳遞的基因產(chǎn)品的非常高水平的表達(dá)，這將依次導(dǎo)致不是病毒的凋亡性質(zhì)的延長的表達(dá)(Levine等，1993，Nature，361739-742；Jan等，JVirol.，1999，7310296-10302；Jan等，J Virol.，2000，746425-6432；Balachandran等，J.Virol.，2000，741513-1523)?；谠趯?shí)驗(yàn)室中處理α病毒和其它蟲媒病毒的推薦(The Subcommittee on Arbovirus LaboratorySafety of the American Committee on Arthropod-Borne Viruses.Am.J.Trop.Med.Hyg，1980，291359-1381)，辛德比斯被認(rèn)為是相當(dāng)安全的。大多數(shù)α病毒需要3級規(guī)范和防范和/或接種疫苗，然而辛德比斯只需要2級規(guī)范和防范，這歸因于那些感染不致病或?qū)е伦晕蚁拗菩约膊〉牟《?。這里舉例說明的從辛德比斯衍生得到的復(fù)制缺陷型辛德比斯載體更安全，這是因?yàn)樗鼈兏腥竞蛷?fù)制引起病毒血或疾病的能力實(shí)際上是不存在的。感染和復(fù)制引起病毒血的能力只能通過重組獲得，它能被縮小和監(jiān)控。辛德比斯載體也避免了與染色體整合相關(guān)的潛在的并發(fā)癥(Xiong等，Science，1989，2431188-1191)。近來的方法中使設(shè)計新的能夠非復(fù)制感染的辛德比斯載體更加容易并進(jìn)一步提高了載體的安全性(Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58491-562，1994)。因?yàn)樾恋卤人共《臼且环N產(chǎn)自血液的病毒(Turrell，1988，CRC Press，Inc.Boca Raton，F(xiàn)L)并且可以穿過血腦屏障((Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822)，因此基于這種病毒的載體是少數(shù)可獲得的能夠在血流中移動至機(jī)體的各種細(xì)胞的載體之一。在這方面，它們具有優(yōu)于許多其它載體的重要優(yōu)點(diǎn)并且例如可以被用來治療腦惡性腫瘤(例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)神經(jīng)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦脊膜瘤)。
除了“天然靶向”的基于α病毒的載體之外，本申請也公開了誘導(dǎo)腫瘤壞死的基于α病毒的載體，它攜帶更多特異性的腫瘤靶向分子，例如，包括一種腫瘤特異性受體結(jié)合序列的嵌合的包膜蛋白，與腫瘤特異性結(jié)合位點(diǎn)具有親和性的肽模擬物，識別腫瘤特異性抗體的免疫球蛋白分子/片段或可與抗病毒受體(例如抗-HALR)抗體一同施用的蛋白A的IgG結(jié)合域。在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基于辛德比斯的載體，由于經(jīng)修飾的嵌合的E2包膜蛋白的存在此載體特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，例如包括五種高同源58氨基酸長蛋白A的Fc IgG結(jié)合域中的一種或多種，即域E、D、A、B、C或域Z，一種設(shè)計的B域的類似物，包括兩個氨基酸替代Alal-＞Val和Gly29-＞Ala(見共同擁有的PCT公開號WO98/44132；Uhlen等，J.Biol.Chem.，1984，2591695；Moks等，Eur.J.Biochem.，1986，156637-43)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括嵌合的包膜蛋白的基于辛德比斯病毒的載體，它被修飾成包括一個能夠結(jié)合其它種類的在靶腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)高水平的決定簇的區(qū)域(例如，EGF受體在許多癌癥細(xì)胞上超表達(dá)或αvβ3整聯(lián)蛋白在黑素瘤細(xì)胞上超表達(dá)，見Dmitriev等，J.Virol.，2000，6875-84；Bonnie等，Virol.，2000，269717)，或可選擇的，一個與在特異性癌細(xì)胞類型(例如，乳腺癌中的導(dǎo)管上皮細(xì)胞)上在一個相對較高的水平上表達(dá)的受體相互作用的區(qū)域。因此，在一個具體的實(shí)施方案，本發(fā)明提供包括通過α和β-hCG序列的插入修飾的嵌合的E2包膜蛋白的基于辛德比斯病毒的載體(被本發(fā)明的發(fā)明人在Sawai和Meruelo公開，1998，Biochem.Biophys.Res.Com.，248315-323)，并且具有選擇性地感染和向絨膜癌細(xì)胞以及其它具有LH/CG受體的腫瘤細(xì)胞(但是不向缺乏這些受體的細(xì)胞)傳遞一種報告基因的能力。
與許多其他包含嵌合的靶向分子的病毒載體相反，本發(fā)明的包含嵌合的E2蛋白的基于α病毒的載體對于插入到E2嵌合的蛋白中的異源靶向片段的特異性結(jié)構(gòu)和/或尺寸是高度耐受的。這一性質(zhì)似乎歸因于E2和E1蛋白在細(xì)胞靶向和融合中功能角色的分離。特別的，已經(jīng)建立了更廣泛的試驗(yàn)表明E2蛋白主要與病毒和細(xì)胞表面受體的結(jié)合有關(guān)，然而病毒的侵入則主要與低pH值誘導(dǎo)在E1中的融合域的暴露，然后是和內(nèi)體的膜融合、胞吞入披網(wǎng)格小泡并轉(zhuǎn)移入核內(nèi)體有關(guān)(Hoekstra等，Biosci Rep.，1989，9273-305；Kielian and Helnius，pp.91-119，In S.Schlesinger and M.J.Schlesinger(ed.)，The Togaviridae and Flaviviridae.Plenum PublishingCorp.，New York，1986；Kielian等，J.Virol.，1990，644614-24；Marsh，Biochem J.，1984，2181-10；Stegmann等，Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.，1989，18187-211；Helenius et aL，J.Cell Biol.，1980，84404-20；Marsh等，Cell，1983，32931-940)。
本發(fā)明的嵌合的包膜蛋白載體的腫瘤特異性靶包括但不限于任何腫瘤細(xì)胞特異性蛋白、肽、低聚核苷酸、脂類、多糖和小分子量配體。
最重要的是，本發(fā)明并不限于天然靶向的α病毒衍生的抗腫瘤載體。如在這里說明的那樣，使用本領(lǐng)域公知的方法，本發(fā)明的載體可以從病毒衍生得到(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、與腺相關(guān)的病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒等等)或與HALR不具有天然親和性的非病毒顆粒(例如脂質(zhì)體、微球體、蛋白基體等)，通過修飾它們的靶向分子來包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR結(jié)合域(優(yōu)選的是E2的HALR結(jié)合域)，或識別HALR的免疫球蛋白片段，或可以與抗-HALR抗體一同施用的蛋白A的IgG結(jié)合域，或?qū)诱尺B蛋白(或其中的HALR結(jié)合部分)。例如，在一個具體的實(shí)施方案中，發(fā)明提供一種抗腫瘤的基于腺病毒的載體，該載體中的編碼殼體蛋白纖維的末端結(jié)的序列被刪除以除去與CAR和其它腺病毒受體的天然結(jié)合性，而同時地插入負(fù)責(zé)與HALR結(jié)合的序列(見，例如Alemany等，Nat.Biotechnol.，2000，18723-727)。在另一個可選擇的實(shí)施方案中，腫瘤特異性基于腺病毒的載體同一種重組生產(chǎn)的雙特異性雜合銜接蛋白一同施用，此蛋白包括CAR蛋白氨基末端的細(xì)胞外域(見例如Dmitriev等，J.Virol.，2000，746875-84；Ebbinghaus等，J.Virol.，2001，75480-489)和一個辛德比斯病毒E2的HALR結(jié)合域，或一個識別HALR的免疫球蛋白片段，或可以和抗-HALR抗體一同施用的蛋白A的IgG結(jié)合域。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明相似地提供了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗腫瘤載體，由于用HALR結(jié)合域替代了env蛋白(例如在基于鼠的白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(MLV)的載體的env的N-末端區(qū)域)的受體結(jié)合域此載體已經(jīng)改變了靶向性質(zhì)(見e.g.，Ohno and Meruelo，Biochem.Mol.Med.，1997，62123-127)。
總的來說，本發(fā)明有利地提供了一種治療患腫瘤哺乳動物的方法，其中腫瘤細(xì)胞與具有相同品系的正常細(xì)胞相比表達(dá)更高水平的HALR。不同水平的HALR導(dǎo)致靶介導(dǎo)的傳遞，就是說本發(fā)明載體與腫瘤細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合?！案咚健钡谋磉_(dá)在這里通常指被腫瘤細(xì)胞(與非腫瘤細(xì)胞相比)表達(dá)的水平和產(chǎn)生的這種優(yōu)先的結(jié)合，例如至少高3倍的結(jié)合，優(yōu)選至少高30倍結(jié)合，最優(yōu)選的至少高300倍的結(jié)合。腫瘤細(xì)胞表達(dá)增高的水平可以用一個絕對尺度來評價，就是說，相對于任何其它所述的表達(dá)HALR的非腫瘤細(xì)胞，或以一種相對的尺度，就是說相對于與轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞有相同品系的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的表達(dá)水平(例如，在黑素瘤情況下的黑素細(xì)胞，在肝癌情況下的肝細(xì)胞，在卵巢腺癌情況下的卵巢內(nèi)皮細(xì)胞，在腎癌情況下的腎內(nèi)皮細(xì)胞或腎上皮細(xì)胞)。
一般定義術(shù)語“載體”，“克隆載體”，“表達(dá)載體”和“輔助載體”指這樣的載體，即通過將一種DNA或RNA序列(例如一種外源基因)引入一種宿主細(xì)胞，以便促進(jìn)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)引入的序列。載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。在關(guān)于本發(fā)明的病毒載體描述中使用的，“表達(dá)載體”最通常是一般被用作指一種能夠感染宿主細(xì)胞的載體，然而術(shù)語“輔助載體”被用來指能夠介導(dǎo)“表達(dá)基因”適當(dāng)包裝入病毒類顆粒的載體。
在此使用的術(shù)語“異源序列或基因”指一種核酸(RNA或DNA序列)，它沒有被發(fā)現(xiàn)與特定分子的核酸序列(例如一種α病毒基因組)有天然的聯(lián)系。相似的，術(shù)語“異源蛋白或肽”指一種沒有天然存在于α病毒基因組中的編碼的蛋白、肽和/或核酸序列。在本發(fā)明的含義內(nèi)，一種包含在基于α病毒的載體中的異源基因典型地是一種非病毒的基因。然而，此術(shù)語也包括α病毒序列，此序列已經(jīng)被用來引起核酸一級序列的變化(例如核酸缺失、替換和/或增加)和/或在天然的(例如自然發(fā)生)病毒分子上的定位的人工處理改變了。本發(fā)明優(yōu)選的異源基因包括但不限于報告基因(例如β-半乳糖苷酶和熒光素酶基因)、抗腫瘤基因(例如自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列)和編碼腫瘤靶向分子的基因(例如編碼包含一種腫瘤特異性受體結(jié)合序列的嵌合的包膜蛋白的基因、編碼與腫瘤特異性結(jié)合位點(diǎn)具有親和性的肽模擬物的序列、編碼識別腫瘤特異性抗原的免疫球蛋白分子/片段的基因，或編碼可以和抗病毒的受體[如抗-HALR]抗體一起施用的蛋白A的IgG結(jié)合域的基因)。
在此使用的術(shù)語“感染的”，當(dāng)用來描述一種基于α病毒的RNA分子時，是指一種自我復(fù)制并在宿主細(xì)胞中提供轉(zhuǎn)錄的RNA分子。術(shù)語“復(fù)制”，當(dāng)與一種α病毒基因組RNA或一種重組的基于α病毒的載體RNA分子一同使用時，指利用(-)-鏈RNA作為模板產(chǎn)生(+)-鏈RNA全長等同物。
在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”被理解為包括任何例如但不限于吸附、微量注射、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染等將一種外源核酸分子引入一個宿主細(xì)胞的方法。術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”，當(dāng)用來描述一種細(xì)胞時，指一種包括一個外源引入的核酸分子的細(xì)胞和/或一種遺傳組成已經(jīng)通過引入一種外源核酸分子改變的細(xì)胞。
在此使用的術(shù)語“優(yōu)先的結(jié)合”或“優(yōu)先的親和性”指病毒載體與一種給定的細(xì)胞受體(例如HALR)相互作用的能力，由此導(dǎo)致表達(dá)這種受體的細(xì)胞的感染增加。接下來，本發(fā)明的載體與HALR受體具有優(yōu)先的親和力，將會特別有效地感染表達(dá)增加數(shù)量的HALR的腫瘤細(xì)胞。
在此使用的術(shù)語“腫瘤”指一種包括生長失控的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的一種惡性的組織。腫瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤和其它類似瘤；和實(shí)體瘤。本發(fā)明可以治療的實(shí)體瘤的實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、表皮樣癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽導(dǎo)管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。如上所述，本發(fā)明的方法依賴于治療靶向的腫瘤細(xì)胞的HALR表達(dá)。
術(shù)語“腫瘤特異性細(xì)胞決定簇”或“腫瘤特異性靶”在這里被用來廣義的定義一種腫瘤細(xì)胞表面的任何分子，此分子可以被本發(fā)明的載體用來選擇性的或優(yōu)先的靶向此細(xì)胞。本發(fā)明載體對應(yīng)的腫瘤特異性細(xì)胞決定簇包括但不限于任何腫瘤細(xì)胞表面蛋白、肽、低聚核苷酸、脂類、多糖和一種小分子配體。本發(fā)明優(yōu)選的腫瘤特異性細(xì)胞決定簇是腫瘤特異性細(xì)胞膜蛋白例如ErbB受體、Melan A[MART1]、gap100、酪氨酸酶、TRP-1/gp75和TRP-2(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱、頭部、頸部和非小細(xì)胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在子宮頸癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中)；前列腺特異性抗原[PSA](在前列腺癌中)；胚胎癌抗原[CEA](在結(jié)腸癌、乳腺癌和胃腸道癌中)、LH/CG受體(在絨膜癌中)和這種共有的腫瘤特異性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1、2、8、CAGE-3到7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV和TRP2-INT2等。與相同品系的正常細(xì)胞相比在特定的腫瘤細(xì)胞表面被在較高的水平表達(dá)的HALR和其它決定簇(e.g.，EGF受體或αvβ3整聯(lián)蛋白)也包括在術(shù)語“腫瘤特異性細(xì)胞決定簇”中。
在此使用的術(shù)語“哺乳動物”具有它普通的含義，并且特別地包括靈長類，更特別地包括人類。其它可以被治療的患腫瘤的哺乳動物包括但不限于犬、貓、嚙齒動物(racine、鼠科動物、狼等)、馬、牛、綿羊、山羊和豬類。
術(shù)語“患者”在這里使用時指一種脊椎動物，優(yōu)選一種哺乳動物(例如嚙齒動物如鼠)。特別的，此術(shù)語指人類。
術(shù)語“約”或“大約”通常指對于測定的數(shù)值和方法的類型而言在一個可接受的誤差范圍內(nèi)。例如，它可指在一個給定值或范圍的20％內(nèi)，更優(yōu)選在10％內(nèi)，最優(yōu)選在5％內(nèi)。可選擇的，尤其在生物體系中，術(shù)語“約”指約在一個對數(shù)值(即數(shù)量級)內(nèi)，優(yōu)選在給定值的上下100％內(nèi)(within afactor of two of a given value)。
術(shù)語“治療”當(dāng)用在這里時指緩解或減輕患者的疾病的至少一種癥狀。在本發(fā)明的含義內(nèi)，術(shù)語“治療”也可以指延長潛伏期，即一種疾病在感染和臨床表現(xiàn)之間的時期。術(shù)語“保護(hù)”當(dāng)用在這里時指適當(dāng)?shù)念A(yù)防或治療(或它們兩者)一患者的疾病的發(fā)展或繼續(xù)。在本發(fā)明的含義內(nèi)，疾病是癌癥。
短語“藥學(xué)上可接受的”，當(dāng)述及本發(fā)明的組合物使用時指這種組合物的分子實(shí)體和其它組份，當(dāng)施用給人時它們是生理上可耐受且通常不產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。優(yōu)選在這里使用時，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指聯(lián)邦或國家政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或列在美國藥典中或其它公認(rèn)的藥典中的用于哺乳動物(更特別是人類)的。
術(shù)語“治療有效的”應(yīng)用于劑量或量時指一種化合物或藥物組合物的量，當(dāng)施用于需要此化合物或藥物組合物的哺乳動物時，此量足夠產(chǎn)生所需的活性。在當(dāng)關(guān)于本發(fā)明的病毒載體描述中使用的術(shù)語“治療有效量/劑量”指當(dāng)施用于哺乳動物時，載體或包括載體的藥物組合物足夠產(chǎn)生有效的抗腫瘤反應(yīng)的量/劑量。
術(shù)語“抗體”使用其最廣的含義，并且具體不僅涵蓋單獨(dú)的天然抗體也涵蓋單克隆抗體(包括激動劑和拮抗劑抗體)和具有多表位特異性的抗體組合物和抗體片段(例如Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)，只要它們具有所需的生物活性即可。
術(shù)語“先天免疫”或“天然免疫”指先天的免疫應(yīng)答，它不被與抗原的在先接觸所影響。先天的免疫的保護(hù)機(jī)制之二包括，天然殺傷(NK)細(xì)胞，它破壞微生物和特定的腫瘤細(xì)胞并攻擊特定的病毒感染細(xì)胞，和炎性反應(yīng)，它動用白細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和樹枝狀的細(xì)胞)來吞噬侵入者。
載體本發(fā)明最優(yōu)選的載體是基于α病毒的載體，特別是復(fù)制缺陷型天然靶向的基于辛德比斯病毒的載體，本發(fā)明在體外、體內(nèi)和離體的其它優(yōu)選的載體是病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、皰疹病毒、腺病毒、與腺相關(guān)的病毒、痘苗病毒、乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、桿狀病毒和其它具有或被修飾成有所需的細(xì)胞向性(就是說優(yōu)先地與高親和性層粘連蛋白受體(HALR)結(jié)合)的重組體病毒。
在現(xiàn)有技術(shù)中已知構(gòu)建和利用病毒載體的方法(見，例如Miller andRosman，Bio Techniques 1992，7980-990)。根據(jù)本發(fā)明，在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)可以應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)，微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)是公知的并且在文獻(xiàn)中已經(jīng)說明的很充分。見如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在此稱″Sambrook等，1989.″)；DNA克隆一種實(shí)踐途徑，卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；低聚核苷酸合成(M.J.Gait ed.1984)；核酸雜交[B.D.Hames & S.J.Higginseds。(1985)]；轉(zhuǎn)錄和翻譯[B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；動物細(xì)胞培養(yǎng)[R.I.Freshney，ed.(1986)]；固定細(xì)胞和酶[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，分子生物學(xué)流行草案，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
各種公司生產(chǎn)商用病毒載體，包括但不限于Avigen公司(Alameda，CA；AAV載體)，細(xì)胞Genesys(Foster City，CA；逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV載體和慢病毒載體)，Clontech(逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒載體)，Genovo公司.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV載體)，Genvec(腺病毒載體)，IntroGene(萊頓，荷蘭；腺病毒載體)，分子醫(yī)學(xué)(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV和皰疹病毒載體)，Norgen(腺病毒載體)，牛津生物醫(yī)學(xué)(牛津，英國；慢病毒載體)和轉(zhuǎn)基因(斯特拉斯堡，法國；腺病毒、牛痘、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒載體是復(fù)制缺陷型，就是說，它們不能在靶細(xì)胞中自主地復(fù)制。優(yōu)選地，復(fù)制缺陷型病毒是一種極小的病毒，也就是它只保留了它的基因組的序列，此序列對于靶細(xì)胞識別和病毒基因組的殼體化是必需的。復(fù)制缺陷型病毒在引入一個細(xì)胞以后是不感染的。復(fù)制缺陷型病毒載體的使用允許在一個特定的，固定的區(qū)域施用給細(xì)胞，而不必?fù)?dān)心載體是否會感染其它細(xì)胞。因此，一個具體的組織能被特定的靶向。除了復(fù)制缺陷型α病毒載體外，特定載體的實(shí)例包括但不限于缺陷型皰疹病毒載體(見例如Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.1991，2320-330；專利公布RD 371005 A；PCT公開號WO 94/21807和WO 92/05263)，缺陷型腺病毒載體(見例如Stratford-Perricaudet等，J.Clin.Invest.1992，90626-630；La Salle等，Science 1993，259988-990；PCT公開號WO94/26914，WO 95/02697，WO 94/28938，WO 94/28152，WO 94/12649，WO95/02697和WO 96/22378)和缺陷型與腺有關(guān)的病毒載體(Samulski等，J.Virol.1987，613096-3l01；Samulski等，J.Virol.1989，633822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.1988，83988-3996；PCT公開號WO91/18088和WO 93/09239；美國專利號4,797,368和5,139,941；歐洲專利公開號EP 488 528)。
這一點(diǎn)在上面已說明，可以實(shí)施各種策略來將載體靶向到HALR，包括但不限于通過將一個HALR結(jié)合序列(例如一種辛德比斯病毒E2蛋白)引入病毒來做病毒載體的假型；通過修飾病毒的殼體或包膜蛋白來包括一個HALR結(jié)合序列；通過利用一個可以與載體和HALR結(jié)合的雙特異的試劑；或利用這些途徑的結(jié)合。
基于腺病毒的載體。腺病毒是真核DNA病毒，它可以被修飾成能有效地將本發(fā)明的一種核酸傳遞給多種類型的細(xì)胞。存在各種血清型的腺病毒。在這些血清型中，在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)先選擇利用2型或5型人類腺病毒(Ad 2或Ad 5)或動物來源的腺病毒(見PCT公開號W094/26914)。這些可以用在本發(fā)明范圍內(nèi)的動物來源腺病毒包括犬的、牛的、鼠的(例如Mavl[Beard等，Virology，1990，7581])綿羊的、豬的、鳥的和猿源(例如SAV)的腺病毒。優(yōu)選動物來源的腺病毒是一種犬的腺病毒，更優(yōu)選的是一種CAV2腺病毒(例如曼哈頓或A26/61株[ATCC保藏號VR-800])。各種的復(fù)制缺陷型腺病毒和最小的腺病毒載體已有描述(PCT公開號WO94/26914、WO95/02697，WO94/28938，WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組腺病毒可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)方法來制備(Levrero等，Gene，1991，101195；EP公開號185 573；Graham，EMBO J.，1984，32917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659)。利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)回收和純化重組的腺病毒，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是眾所周知的。
基于與腺有關(guān)的病毒的載體。與腺有關(guān)的病毒(AAV)是具有相對較小的尺寸的DNA病毒，它能夠通過一個穩(wěn)定且位點(diǎn)特異性的方式整合入它們感染的細(xì)胞的基因組。它們能夠感染廣譜的細(xì)胞而對細(xì)胞生長、形態(tài)學(xué)和分化不產(chǎn)生任何誘導(dǎo)作用，并且它們似乎與人類病理學(xué)無關(guān)。AAV基因組已經(jīng)被克隆，排序和表征。用來在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的由AAV衍生的載體的利用已有描述(見PCT公開號WO 91/18088和WO 93/09239；美國專利號4,797,368和5,139,941；EP公布號488 528)。本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組AAV可以通過將一個包含目標(biāo)核酸序列(此序列側(cè)面與兩個AAV反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)域連接)的質(zhì)粒和一個攜帶AAV殼體化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入一個被一種人類輔助病毒(如一種腺病毒)感染的細(xì)胞系來制備。然后將生產(chǎn)的AAV重組體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如，在Mann等，Cell 1983，33153；美國專利號4,650,764，4,980,289，5,124,263和5,399,346；Markowitz等，J.Virol.1988，621120；EP公布號453 242和178 220；Bernstein等Genet.Eng.1985，7235；McCormick，BioTechnology 1985，3689；和Kuo等，1993，Blood，82845中描述的。逆轉(zhuǎn)錄病毒是整合病毒，它感染分化的細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括兩個LTR，一個殼體化的序列和三個編碼區(qū)域(gag、pol和env)。復(fù)制缺陷型非感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被操縱以破壞病毒包裝信號，但是保留需要用來包裝共引入病毒的結(jié)構(gòu)基因，此病毒被設(shè)計包含異源基因和包裝信號。因此，在重組的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常被全部或部分的刪除并且被一個目標(biāo)異源核酸序列取代。這些載體可以從不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒來構(gòu)建，例如HIV(人免疫缺陷病毒)、MoMuLV(鼠莫洛尼白血病病毒)、MSV(鼠莫洛尼肉瘤病毒)、HaSV(哈維肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(魯斯氏肉瘤病毒)和弗羅德病毒。適合的包裝細(xì)胞系已經(jīng)在先前的技術(shù)中描述了，特別是，細(xì)胞系PA 317(美國專利號4,861,719)；PsiCRIP細(xì)胞系(PCT公開號WO 90/02806)和GP+envAm-12細(xì)胞系(PCT公開號WO 89/07150)。另外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以包含在用來抑制轉(zhuǎn)錄活性的LTR的修飾和可能包含部分gag基因的廣泛的殼體化序列(Bender等，J.Virol.1987，611639)。重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來純化。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也能被DNA病毒引入，它允許逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制一個周期和放大轉(zhuǎn)染效率(見PCT公開號WO 95/22617，WO 95/26411，WO96/39036，WO 97/19182)。
在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，慢病毒載體可以在許多組織類型中被用作直接傳遞和持續(xù)表達(dá)一種轉(zhuǎn)基因的藥物，組織類型包括腦、視網(wǎng)膜、肌肉、肝和血液。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的亞型可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)這些組織中的分化和不分化的細(xì)胞并且維持目標(biāo)基因長期表達(dá)(綜述可參見Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.1998，9457-63；Zufferey等，J.Virol.1998，729873-80)。慢病毒包裝細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是可獲得的并普遍已知的。
非病毒載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能被引入體內(nèi)的非病毒載體，只要這些載體包括特異性地結(jié)合HALR的靶向的肽、蛋白、抗體等即可。例如，合成的陽離子脂類(能被用來制備在體內(nèi)轉(zhuǎn)染一個攜帶一種抗腫瘤治療因子的載體的脂質(zhì)體)的組合物在Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，847413-7417；Felgner and Ringold，Science 1989，337387-388；Mackey，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988，858027-8031和Ulmer等，Science 1993，2591745-1748中已有描述。用來傳遞核酸的有用的脂類化合物和組合物已有描述，例如在PCT公開號WO 95/18863和WO96/17823中和在美國專利號5,459,127中。靶向肽(例如，層粘連蛋白或HALR結(jié)合層粘連蛋白肽)和蛋白(例如抗-HALR抗體)或非肽分子可以和脂質(zhì)體共價地(例如，將肽與磷脂或膽固醇接合，也見Mackey等，supra)或非共價地(例如經(jīng)由一個膜結(jié)合域或部分插入到雙層膜中)偶合。
α病毒載體，特別是辛德比斯病毒載體α病毒在本領(lǐng)域是眾所周知的，其包括但不限于馬腦炎病毒、塞姆利基森林病毒和相關(guān)的種屬；辛德比斯病毒和重組體或未分組的種屬(見Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58491-562，Table 1，p.493)。
優(yōu)選本發(fā)明的α病毒被作為一個復(fù)制缺陷型病毒來制備。當(dāng)在這里使用時，術(shù)語“復(fù)制缺陷型病毒”具有它通常的含義，就是說由于它的基因組被修飾，所以此病毒是繁殖機(jī)能不全的。因此，一旦這種重組的病毒感染一個細(xì)胞，其結(jié)果只能是表達(dá)任何包括在它的基因組中的病毒和異源蛋白，并且在辛德比斯和其它α病毒的情況下，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一個具體的實(shí)施方案下，本發(fā)明的復(fù)制缺陷型基于α病毒的載體包括編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因并且對于RNA轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)是自給自足的。然而，這些載體缺乏編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因，因此一種輔助基因組是必需的以使它們被包裝入傳染的顆粒。除了提供治療學(xué)上安全的載體，結(jié)構(gòu)蛋白的移去增加了這些載體并入超過6kb的異源序列的能力。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的繁殖機(jī)能不全的α病毒載體被間接地得到，例如通過移除包裝信號，從而使結(jié)構(gòu)蛋白被包裝入從包裝細(xì)胞系釋放的病毒體。
因?yàn)樾恋卤人共《静粫鹬卮蟮慕】滴：Γ运部梢砸苑敝硻C(jī)能不全的形式使用。換句話說，不像大部分病毒載體，使辛德比斯病毒載體有缺陷或復(fù)制機(jī)能不全不是必需的，雖然對于嚴(yán)格的安全原因來說這是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明既包括復(fù)制缺陷型又包括有繁殖能力的辛德比斯病毒載體。
如上所述，α病毒，特別是辛德比斯病毒載體，天然地可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也叫作“程序性細(xì)胞死亡”。細(xì)胞凋亡是一種內(nèi)在的細(xì)胞過程，它導(dǎo)致核的破壞、DNA消化和最終的細(xì)胞壞死和消融。本發(fā)明的有促使細(xì)胞凋亡潛力的載體可以利用在組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞來試驗(yàn)(例如，任何在實(shí)施例1中討論的宿主細(xì)胞，下文)。
各種用來制備本發(fā)明α病毒載體的方法都是本領(lǐng)域已知的。在基于辛德比斯病毒載體的情況下，一般而言，載體制備包括一種具有包含辛德比斯非結(jié)構(gòu)基因的蓋帽mRNA的包裝細(xì)胞系以及，可選擇的，一種在辛德比斯亞基因組啟動子控制下的異源基因和一個表達(dá)辛德比斯結(jié)構(gòu)基因的輔助質(zhì)粒載體的共轉(zhuǎn)染(見圖1)。蓋帽mRNA可以通過體外轉(zhuǎn)錄來生產(chǎn)。
各種細(xì)胞系可以被用作包裝細(xì)胞。這些包括哺乳動物的細(xì)胞系例如CHO(中國倉鼠卵巢)、BHK(嬰兒倉鼠腎臟)、HuH7(人類肝細(xì)胞癌)等。這些細(xì)胞系的一個缺點(diǎn)是辛德比斯病毒載體的生產(chǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，結(jié)果是在共轉(zhuǎn)染后的幾小時或幾天內(nèi)包裝細(xì)胞破壞。因此，新的包裝細(xì)胞必須在一個正在進(jìn)行的(ongoing)基礎(chǔ)上制備。另外，由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的基于辛德比斯病毒的載體似乎能有效地與帶陰電荷的葡糖胺聚糖硫酸乙酰肝素相互作用導(dǎo)致增加的病毒清除和下降的感染性(見，如Byrnes and Griffin，2000，J.Virol.，74644-651)。
為了避免這些問題，目前的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)展了一種從昆蟲細(xì)胞衍生的辛德比斯病毒包裝細(xì)胞系，優(yōu)選C6/36蚊細(xì)胞(共同擁有懸而未決的PCT申請?zhí)朠CT/US02/，[代理人內(nèi)部參考號5986/2H995-WO0]，與此申請?jiān)谕蝗掌谔峤?，題目為“用作α病毒載體連續(xù)生產(chǎn)的包裝細(xì)胞系”，基于美國臨時專利申請序列號60/279,048，2001年3月27日提交，它們都特別在這里全文并入?yún)⒖?。為了產(chǎn)生昆蟲包裝細(xì)胞系，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)穩(wěn)定地將C6/36細(xì)胞用兩個DNA載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，一個編碼用來復(fù)制病毒RNA的非結(jié)構(gòu)基因nsp 1-4，另一個(輔助)編碼結(jié)構(gòu)蛋白(殼體蛋白C、E1、E2、E3和6K)和包裝信號。本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，這些昆蟲衍生的包裝細(xì)胞基本上能抵抗辛德比斯載體的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的性質(zhì)并且能被設(shè)計來建立長期的產(chǎn)生載體的培養(yǎng)物，這些培養(yǎng)物產(chǎn)生始終如一的高病毒滴度。除了C6/36蚊細(xì)胞外，用在本發(fā)明中的其它昆蟲細(xì)胞系的非限制實(shí)例包括u4.4細(xì)胞、HiRh FiveTM細(xì)胞、施奈德氏果蠅細(xì)胞系2、Spodoptera frugiperda SF9細(xì)胞和C7-10細(xì)胞。
在各種情況下，通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，可以從包裝細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中收獲包含復(fù)制缺陷型病毒基因組的α病毒、特別是辛德比斯病毒體，將其濃縮并純化。這些技術(shù)包括但不限于離心和超速離心；在離子交換、分子排阻、疏水相互作用和親水相互作用或其它類型柱上的色譜法；過濾和超濾；親合純化或本領(lǐng)域已知的各種其它技術(shù)。本發(fā)明的分離的病毒體可以保存在溶液中或優(yōu)選凍干并以粉末形式保存。
抗腫瘤治療基因本發(fā)明的治療載體可以攜帶一種抗腫瘤治療基因，這一點(diǎn)在這里公開。特別是，因?yàn)楸景l(fā)明的α病毒載體，尤其是辛德比斯病毒載體能攜帶一種治療基因有效負(fù)載，所以它們可以被修飾來包含任何如下所述的基因療法。
在這里使用的術(shù)語“抗腫瘤基因治療”指靶向一種腫瘤的基因治療，這會引起腫瘤壞死、凋亡、生長調(diào)節(jié)，也就是腫瘤衰退或抑制。抗腫瘤基因治療的實(shí)例包括但是決不限于一種自殺基因的引入、一種凋亡基因的引入、一種腫瘤抑制基因的引入和一種致癌基因拮抗基因的引入。優(yōu)選的抗腫瘤基因由免疫刺激基因補(bǔ)充來增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞(包括動員樹狀細(xì)胞)對腫瘤的募集和活化。
因此，“基因治療”特別地指傳遞一種編碼效應(yīng)分子的基因進(jìn)入細(xì)胞，在此情況下，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。
自殺基因療法。編碼能夠給予腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療物質(zhì)敏感性的酶的基因(自殺基因)的引入已經(jīng)被證明是一種有效地抗腫瘤基因療法。本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，部分地通過引入一個基因載體，編碼一個能夠酶促地轉(zhuǎn)化一種前藥(一種無毒的化合物)成一種有毒的化合物的蛋白。在本發(fā)明的方法中，治療用的核酸序列是一種編碼一個產(chǎn)物的核酸，其中產(chǎn)物在它自己或其它藥物的存在下引起細(xì)胞死亡。這種治療用的核酸的一個有代表性的例子是一種編碼單純皰疹病毒(HSV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶的核酸。另外的例子是水痘帶狀皰疹病毒(UZV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶和細(xì)菌的基因胞嘧啶脫氨酶。
本發(fā)明方法中有用的前藥是任何可以被轉(zhuǎn)化為一種有毒的產(chǎn)品的物質(zhì)，也就是對腫瘤細(xì)胞有毒的那些。這種前藥的有代表性的例子是更昔洛韋，它在體內(nèi)被HSV-tk轉(zhuǎn)化成一種有毒的化合物(Chen等，Cancer Res.1996，563758-3762)。其它有代表性的前藥的實(shí)例包括無環(huán)鳥苷，F(xiàn)IAU[1-(2-脫氧-2-氟-p-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘代尿嘧啶]，6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷(被VZV-tk轉(zhuǎn)化)和5-氟胞嘧啶(通過胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)化)。
前藥，可以被具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)生容易地施用給患者。利用本領(lǐng)域已知的方法，這些醫(yī)生也將能夠決定施用前藥的最合適的劑量和途徑。例如，更昔洛韋優(yōu)選地以約1-20mg/天/kg體重的劑量施用；阿昔洛韋以約1-100mg/天/kg體重的劑量施用，F(xiàn)IAU以約1-50mg/天/kg體重的劑量施用。
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、抗致癌基因和腫瘤抑制基因療法。在許多癌癥類型中腫瘤的發(fā)生和惡化都與致癌基因(例如ras、myc)和腫瘤抑制基因(Rb、p53)的突變有關(guān)。許多途徑正在追蹤，利用包括單克隆單鏈抗體、反義低聚核苷酸、核糖酶、類似物和免疫原性肽的抗致癌基因和/或腫瘤抑制效應(yīng)分子(Chen，Mol.Med.Today 1997，3160-167；Spitz，等，Anticancer Res.1996，163415-3422；Indolfi等，Nat.Med.1996，2634-635；Kijima等，Pharmacol.Ther.1995，68247-267；PCT公開號WO 94/24297和WO97/16547；法國專利申請?zhí)朏R 08729)。這些分子特異性地抑制腫瘤生長和增加腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率。它們的作用機(jī)制需要抑制或抗致癌基因分子的持續(xù)存在以持續(xù)的應(yīng)答，然而，它們還沒有顯示出會誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫，它具有必須用來保護(hù)抵抗疾病的復(fù)發(fā)的記憶潛力。這些腫瘤生長特異性策略與免疫刺激療法的結(jié)合將會在細(xì)胞衰退和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答上產(chǎn)生協(xié)同作用。
免疫刺激療法。本發(fā)明也提供免疫細(xì)胞刺激，例如一種樹狀細(xì)胞(DC)活動法，來產(chǎn)生一種強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。術(shù)語“樹狀細(xì)胞(DC)動員劑”指一種活化DC機(jī)能活動的分子。一種眾所周知的DC動員劑是flt-3配體(flt-3L)?；诳鼓[瘤的免疫治療功效能通過多種細(xì)胞因子的加入被增強(qiáng)。細(xì)胞因子例如IL-12放大抗原呈遞和DC的免疫調(diào)制的能力并且抑制腫瘤血管發(fā)生，這一點(diǎn)能連續(xù)地誘導(dǎo)腫瘤的免疫敏感性。相反的，細(xì)胞因子例如IL-7在體內(nèi)會誘導(dǎo)更強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答和有效地逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞缺陷。當(dāng)在這里公開時，其它細(xì)胞因子，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-4、TNF-α和c-kit配體也能與DC動員劑結(jié)合使用。
這些細(xì)胞因子可以以可溶的或微粒包裹的蛋白形式施用或通過將基因引入病毒或非病毒載體(包括本發(fā)明的載體)來施用。這種細(xì)胞因子的全身傳遞和局部抗腫瘤基因療法一起使用會增加這些細(xì)胞因子在腫瘤中的分布，這一點(diǎn)在T細(xì)胞缺陷的長期逆轉(zhuǎn)和有效的腫瘤應(yīng)答中可能需要。這些細(xì)胞因子，取決于施用的方式，會在用作有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答的免疫炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。
腫瘤生長抑制劑。在這里使用的術(shù)語“腫瘤生長抑制劑”指一種抑制腫瘤生長的蛋白，例如但不限于干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β和相似的細(xì)胞因子?？蛇x擇的，一種腫瘤生長抑制劑可以是一種腫瘤生長因子的拮抗劑。這種拮抗劑包括但不限于腫瘤生長因子(TGF)-β和IL-10拮抗劑。本發(fā)明包括全身地將腫瘤生長抑制蛋白給藥或可選擇地通過基因治療。
抗血管發(fā)生因子。腫瘤血管發(fā)生是腫瘤生長的一個不可缺少的部分，并且多種的靶向來抑制血管發(fā)生的治療劑作為癌癥治療劑正在開發(fā)中?？寡馨l(fā)生治療主要是逆轉(zhuǎn)了腫瘤的生長/凋亡平衡和誘導(dǎo)休眠。一旦這些治療劑給藥被停止，血管發(fā)生能夠重新開始，腫瘤生長繼續(xù)進(jìn)行。抗血管發(fā)生是一種強(qiáng)大的機(jī)制來特異地減少腫瘤的體積而不會在病人身上產(chǎn)生不利的副作用。由抗血管發(fā)生誘發(fā)的休眠治療通過減少腫瘤、改變腫瘤微環(huán)境、消除免疫抑制作用和使腫瘤對免疫調(diào)節(jié)的清除更敏感而為其它治療計劃方案的成功鋪平了道路。
“抗血管發(fā)生因子”是一種抑制血管發(fā)生的分子，特別地阻止內(nèi)皮細(xì)胞遷移。這些因子包括但不限于抑制性的血管發(fā)生蛋白的片段(例如尿激酶的氨基末端片段[PCT公開號WO 93/15199])；制管張素(O′Reilly等，Cell1994，79315-328)；內(nèi)皮生長抑素；血管發(fā)生因子受體的可溶形式，例如尿激酶受體或FGF/VEGF受體(Wilhem等，F(xiàn)EBS Letters]994，337131-134)；阻塞內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體的分子(O′Reilly等Cell 1997，88277-285；O′Reilly，Nat.Med.1996，2689-692)和Tie-1或Tie-2抑制劑。本發(fā)明包含全身地來施用抗血管發(fā)生因子或可選擇的通過基因治療。優(yōu)選用在本發(fā)明中的抗血管發(fā)生因子是一種蛋白或多肽，其被包含在本發(fā)明載體中的一個基因編碼。
載體治療如上所述，本發(fā)明的基于α病毒的載體，特別是基于辛德比斯病毒的載體可以被用來治療各種癌癥。本發(fā)明的基于非α病毒的載體也可以治療各種其腫瘤細(xì)胞表達(dá)提高的HALR水平的癌癥。
可以將如上所述得到的分離并優(yōu)選純化的病毒載體能配制進(jìn)一個藥物組合物中來施用給病人。在此使用的“藥物組合物”包活性藥物(即病毒載體)和一種藥學(xué)上可接受的媒介物(carrier)、賦形劑或稀釋劑。短語“藥學(xué)上可接受的”指分子和組合物，當(dāng)施用給人類時，該分子和組合物是生理上可耐受的并且一般不會產(chǎn)生過敏或相似的不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)(例如胃腸不適眩暈等)。優(yōu)選在此使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指由聯(lián)邦或政府部門管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或列在美國藥典或其它公認(rèn)的藥典的那些可用于動物、更優(yōu)選用于人身上的那些。術(shù)語“媒介物”指一種稀釋劑、輔料、賦形劑或用于化合物給藥的賦形劑。這些藥物媒介物可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選采用水或鹽水溶液以及葡萄糖和甘油溶液作媒介物，特別對于注射用溶液。適合的藥物媒介物在E.W.Martin著的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中有描述。
用于人類治療時，病毒載體應(yīng)依照食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)制定的生產(chǎn)規(guī)范(GMP)標(biāo)準(zhǔn)來制備。質(zhì)量保證(QA)和質(zhì)量控制(QC)標(biāo)準(zhǔn)將包括測試病毒的復(fù)制能力(如果病毒載體是復(fù)制缺陷型)、活性(病毒顆粒的集落形成單位[CFU]，通過引起細(xì)胞凋亡或致細(xì)胞病變作用(CPE)來測試，或通過一種標(biāo)記基因例如β-半乳糖苷酶的表達(dá)來測試)，毒性和其它標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。
為了治療腫瘤細(xì)胞，藥物組合物可以以任何能夠允許載體向腫瘤細(xì)胞自動導(dǎo)引的途徑給藥。優(yōu)選以胃腸外途徑給藥，包括，但不限于靜脈內(nèi)、小動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)和心室內(nèi)給藥。當(dāng)在這里公開時，病毒載體也可以通過鼻內(nèi)的或口服途徑給予患腫瘤的動物(見Hardy，InThe ArbivirusesEpidemiology and Ecology，Ch.4，pp.87-126)。然而，重要的是，與基因治療中的其它病毒載體相比，施用本發(fā)明的HALR靶向的α病毒和非α病毒載體不必定位在腫瘤上。實(shí)際上，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)中的一個即是載體對于癌細(xì)胞(甚至是對不能用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)定位或切除的微轉(zhuǎn)移瘤)的高特異性和親和性。
在本發(fā)明的療法中，一種治療學(xué)上有效量的載體被施予給一個病人。在此使用的術(shù)語“治療有效量”指足夠減少至少約15％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選預(yù)防(宿主在臨床上顯著缺乏活性、功能和應(yīng)答癥狀)的量?；蛘?，治療有效量為足以引起宿主臨床有意義的狀態(tài)的改善的量。具體而言，治療有效量為引起一種或多種下述情況的量腫瘤細(xì)胞凋亡；腫瘤細(xì)胞壞死；腫瘤轉(zhuǎn)移的消除或預(yù)防；腫瘤生長速率的降低；腫瘤大小降低或腫瘤收縮；皮膚腫瘤疤的形成；腫瘤的消除；癌癥的緩解；癌癥復(fù)發(fā)時間的延長及病人存活期的延長。載體治療的頻率和劑量可以由普通臨床醫(yī)生利用標(biāo)準(zhǔn)劑量-反應(yīng)技術(shù)來決定，但是通常在每天、每周、每兩周或每月至少兩次、并優(yōu)選至少三次給藥，每劑量106到1012病毒體。
結(jié)合療法疫苗為了增加腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答，可以在系統(tǒng)中引入定義是與腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)來特異性地增加抗原的水平。這些TAA能作為蛋白，肽或作為被本發(fā)明病毒載體編碼的異源基因被引入。用這些抗原誘導(dǎo)的免疫會在DC動員和抗腫瘤基因治療方案期間或其后出現(xiàn)。實(shí)質(zhì)上，這一策略增強(qiáng)了特異性抗原的有效的免疫應(yīng)答以及總的免疫應(yīng)答。特異性免疫會導(dǎo)致免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子的表達(dá)，它會促進(jìn)對由腫瘤壞死因子釋放的抗原的應(yīng)答。這種免疫可以與免疫激活細(xì)胞因子(蛋白或基因)結(jié)合來進(jìn)一步提高效果。
除了定義的基于抗原的疫苗，許多疫苗策略正在實(shí)驗(yàn)室和臨床開發(fā)。一個在動物模型上充分研究的策略是利用細(xì)胞因子基因(例如，IL-2、GM-CSF、IL-12、IL-4)和一些關(guān)鍵的輔助刺激分子基因(例如B7.1、B7.2)來改變同體的或異體的腫瘤細(xì)胞。這些基因改變了的腫瘤疫苗證明了利用免疫的機(jī)制來破壞外周的耐受性和無反應(yīng)性的概念(Clary等CancerGene Ther.1997，497-104；Gilboa，Semin.Oncol.1996，23101-107)。其它相似的途徑包括利用腫瘤溶胞產(chǎn)物，蛋白或RNA脈沖的DC和腫瘤細(xì)胞與DC融合來誘導(dǎo)一種有效的腫瘤免疫應(yīng)答。所有這些途徑由一個普遍的主題，就是將抗原的分子傳遞到DC來誘導(dǎo)這些抗原對T細(xì)胞的有效的處理和呈遞。由于這些主題基于DC的提供，因此，預(yù)期DC動員會增加這些途徑中觀察到的效果。
化學(xué)治療劑、輻射療法和外科手術(shù)(腫瘤切除術(shù))。雖然本發(fā)明的方法在抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移上是有效的，但是本發(fā)明的載體和方法最好與其它治療形式一起使用，包括但不限于外科手術(shù)、輻射療法、化學(xué)治療和其它基因治療。例如，本發(fā)明載體可以與一氧化氮抑制劑一同施用，這些抑制劑具有血管收縮的活性，因此可以減少血液流向腫瘤。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可以和化學(xué)治療劑一起施用，例如但不限于紅豆杉醇、泰索帝和其它紫杉類(例如在美國專利號4,857,653；4,814,470；4,924,011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493；歐洲專利號0 253 738；和PCT公開號WO 91/17976，WO 93/00928，WO 93/00929和WO 96/01815中公開的)或其它化學(xué)治療劑，例如順鉑(和其它鉑嵌入化合物)、依托泊苷和依托泊苷磷酸酯、博萊霉素、絲裂霉素C、CCNU、阿霉素、柔紅霉素、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺等。
實(shí)施例下面的實(shí)施例說明了本發(fā)明，但是不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1辛德比斯載體介導(dǎo)有效的抗腫瘤活性材料和方法細(xì)胞系。嬰兒倉鼠腎臟(BHK-21，ATCC保藏號CCL-10)和卵巢癌(ES-2，ATCC保藏號CRL-1978)細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，馬納薩斯，VA)處得到，并保存在補(bǔ)充有5％胎牛血清(FBS，GeminiBioproducts，Inc.，Calabasas，CA)的最低必需α-改良培養(yǎng)基(αMEM，JRH Bioscience，Lenexa，KS)中。一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HuH7從H.Yamamoto博士(Hyogo醫(yī)學(xué)院，日本)處得到，并保存在補(bǔ)充有10％FBS的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，JRH生物科學(xué)，Lenexa，KS)中。HT29人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(ATCC登記號HTB-38)從ATCC獲得，并保存在補(bǔ)充有10％FBS的McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Iwakata & Gracemodification，Mediatech，Inc，Herndon，VA)中。CFPAC-1胰癌細(xì)胞(ATCC保藏號CRL-1918)、SKOV-3卵巢腺癌細(xì)胞(ATCC保藏號HTB-77)和A431表皮樣癌細(xì)胞(ATCC登記號CRL-2592)從ATCC得到并保存在補(bǔ)充有10％FBS的DMEM/低改良培養(yǎng)基中。A498腎癌細(xì)胞(ATCC登記號HTB-44)、HT1197膀胱癌細(xì)胞(ATCC登記號CRL-1473)和LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞(ATCC保藏號CL-188)從ATCC得到并保存在補(bǔ)充有10％FBS含Earle′s鹽和L-谷氨酸鹽的最低必需培養(yǎng)基Eagle(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中。所有上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基都補(bǔ)充有100μg/mL的青霉素-鏈霉素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和0.5μg/ml兩性霉素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)。
載體。圖1是衍生的辛德比斯病毒的表達(dá)和輔助載體的圖示(也見Bredenbeek等，J.Virol.，1993，676439-6446，Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)。一種基于辛德比斯病毒表達(dá)載體的SinRep/LacZ編碼病毒包裝信號、復(fù)制DNA轉(zhuǎn)錄物所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1-4、用作亞基因組轉(zhuǎn)錄的病毒啟動子和LaeZ報告基因。一種輔助質(zhì)粒DH-BB編碼辛德比斯結(jié)構(gòu)基因，即殼體(C)、E3、E2、6K和E1，它們是病毒包裝所必需的。沒有顯示在圖1中的還有在本實(shí)施例中使用的兩個其它基于辛德比斯病毒的表達(dá)載體，SinRep/Luc和SinRep/IL12。為了構(gòu)建SinRep/IL12載體，一種包括螢火蟲熒光素酶基因(Luc)的DNA片段從pGL3質(zhì)粒(Promega Co.，麥迪遜，WI)Nhe I位點(diǎn)和Xba I位點(diǎn)被切離出來并被亞克隆入SinRep載體(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)的Xba I位點(diǎn)。為了構(gòu)建SinRep/IL12載體，一種包含兩個亞基因組啟動子(SinRep/2PSG)的辛德比斯載體首先是通過將第二亞基因組啟動子DNA插入到原始亞基因組啟動子的多克隆位點(diǎn)(MCS)下游來構(gòu)建。脫氧寡核苷酸包括PSG序列5′-CGCGTAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAATAGTGCATG-3′(SEQ ID NO1)在連接到用MluI和Sph I消化的SinRep質(zhì)粒之前被退火到它的互補(bǔ)序列5′-CACTATTAGGACCACCGTCGAGATGCTTTA-3′(SEQ ID NO2)。鼠IL12α-亞單位基因(mP35，ATCC保藏號87596)和IL12β-亞單位基因(mP40，ATCC登記號87595)分別被亞克隆入SinRep/2PSG的Mlu I位點(diǎn)和Stu I位點(diǎn)(Sph I位點(diǎn)下游)，最終的構(gòu)建物被命名為SinRep/IL12。
用于辛德比斯病毒生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染。用于體外轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)來制備。將質(zhì)粒DH-BB、SinRep/LacZ和SinRep/IL12利用XhoI限制性內(nèi)切酶來線性化。因?yàn)長uc基因包括一個內(nèi)在的Xho I位點(diǎn)，所以將質(zhì)粒SinRep/Luc利用NotI限制性內(nèi)切酶來線性化。線性化的質(zhì)粒進(jìn)一步用苯酚/氯仿抽提純化，然后用乙醇沉淀。在體外，從SP6啟動子開始，利用InvitroScript CapKit(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)或mESSAGE mMACHINETM高產(chǎn)量蓋帽RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion Inc.，Austin，TX)來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而生產(chǎn)大量蓋帽mRNA轉(zhuǎn)錄物。在1％瓊脂糖凝膠上檢查mRNA的質(zhì)量。對于共轉(zhuǎn)染輔助DH-BB和SinRep/LacZ、SinRep/Luc或SinRep/IL12入BHK細(xì)胞，可采用前面所述的電穿孔法(Ohno等，Nature Biotechnol.，1997，15763-767)。電穿孔細(xì)胞被轉(zhuǎn)入10mi包含5％FBS的αMEM中并溫育12小時。然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞并在1Oml不含F(xiàn)BS的Opti-MEMI培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)中溫育。在24小時后，采集培養(yǎng)物上清液并將等分試樣在-80℃儲存。
感染測定和病毒定量。病毒上清液稀釋液(300μl)被加入到在12孔板中的2×105細(xì)胞中。在室溫下溫育1小時，將細(xì)胞用PBS洗滌并在培養(yǎng)基中溫育24小時。用X-gal染色來評價病毒感染將被感染的細(xì)胞在包含0.5％戊二醛的PBS中固定20分鐘，然后用PBS洗滌三次；然后將細(xì)胞用包含1mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-β-D-呋喃半乳糖苷，F(xiàn)isher Scientific)、5mM高鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀和1mM MgSO4的PBS在37℃染色3小時。病毒滴度以每毫升LacZ集落形成單位(CFU)表示。CFU依據(jù)細(xì)胞被X-gal染為藍(lán)色的數(shù)目來定義。對于SinRep/IL12載體，相對的CFU用RT-PCR來決定，RT-PCR具有與辛德比斯基因組RNA5′-AGCTTCCCGCAATTTGAGGT-3′(序列識別號3)、5′-ACGCATGGGGCAGACACAAT-3′(序列識別號4)有特異性的引物對。病毒RNA從300μl包括SinRep/LacZ(對照)或SinRep/IL12載體和1ml TRIzolTM試劑(GIBCO BRL)的Opti-MEM培養(yǎng)基來純化。在用乙醇沉淀后，所有RNA樣品在50μl不含核糖核酸酶的水中懸浮。利用PlatinumTM定量的RT-PCR ThermoScripTM一步系統(tǒng)(GIBCO BRL)來進(jìn)行RT-PCR。相對的CFU通過比較SinRep/LacZ RNA和SinRep/IL12RNA的系列稀釋液的RT-PCR帶強(qiáng)度來獲得。然后，將RT-PCR結(jié)果與對SinRep/LacZ的X-gal染色分析結(jié)果相聯(lián)系。SinRep/Luc載體的滴度通過用300μl含病毒的Opti-MEM系列稀釋液感染BHK細(xì)胞在12孔板上分析。經(jīng)過整晚的溫育后，從各樣品中得到的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的熒光酶活性用一種LUMI-ONE手提式熒光計(Bioscan，Inc.，華盛頓，DC)測定30秒。
辛德比斯感染性體外分析。為了評價辛德比斯病毒對倉鼠和人細(xì)胞的感染性，將300μl SinRep/LacZ或SinRep/Luc病毒與2×105BHK、HuH7、LS174T、ES-2、HT29、CFPAC-1、PC-3、HuH7、SKOV-3、A498、HT1197或A431細(xì)胞一起在12孔板中溫育，MOI約為100。第二天，用X-gal染色法或Steady-GloTM熒光酶分析系統(tǒng)(Promega Co.)來分析細(xì)胞。在Steady-GloTM熒光酶分析中，將細(xì)胞吸出，并加入200μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基和200μl Steady-GloTM試劑。在輕柔搖動下將細(xì)胞溫育5分鐘直到它們從板上分離下來。然后將細(xì)胞溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到12×47mm2比色皿中(PharMingen Co.)，利用一個LUMI-ONE手提式熒光計(Bioscan，Inc.，Washington，DC)測定每一個的熒光酶活性30秒。對每個細(xì)胞系，做2-4個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
辛德比斯感染后細(xì)胞存活力分析。在第0天，將300μl包含約107SinRep/LacZ載體的培養(yǎng)基加入到2×105BHK、CFPAC-1、ES-2、HT29、LS174T或SKOV-3細(xì)胞中，并在12孔板中培養(yǎng)一個小時。將板用PBS沖洗，再加入1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基并溫育。在指定的天(第0天、1天、2天、3天、4天)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，留在板中的細(xì)胞用200μl 1×胰蛋白酶EDTA(Mediatech，Inc.)進(jìn)行胰蛋白酶化。將從培養(yǎng)基和板中獲得的細(xì)胞合并，在600rcf(相對離心力)下離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀再懸浮于100μl PBS中，將10μl懸浮液轉(zhuǎn)移到90μl臺盼藍(lán)溶液(Mediatech Inc.)中。用血細(xì)胞計數(shù)法來對10μl臺盼藍(lán)細(xì)胞混合物進(jìn)行計數(shù)并利用下列公式來計算存活力透明細(xì)胞/(透明細(xì)胞+藍(lán)細(xì)胞)×100％。
動物模型和體內(nèi)轉(zhuǎn)染。所使用的所有具有嚴(yán)重結(jié)合免疫有缺陷(SCID)的小鼠(C.B-17-SCID或C.B-17-SCID/BG)都是從TACONIC(GERMANTOWN，NY)處獲得的，并且在試驗(yàn)開始時都是6-8周齡。BHK和ES-2細(xì)胞都是作為皮下的腫瘤從5×106細(xì)胞的原始接種體生長起來的。在大約10天后，腫瘤達(dá)到至少1cm2的大小，治療開始并指定為第1天。將患腫瘤的小鼠分成三個組對照組(n＝5)，SinREP/LacZ組(n＝5)和SinREP/IL12組(n＝5)。將0.5CC包含107-108CFU的SinREP/LacZ載體或SinREP/IL13載體的OPTI-MEM皮下注射(I.P.)到各試驗(yàn)組中。對照組不進(jìn)行治療或注射PBS。每天測量腫瘤的尺寸并用公式計算(長，cm)×(寬，cm)×(高，cm)。SinREP/IL12載體制劑在OPTI-MEM中含有高水平的MIL12(10ng/ml)。
至于人類腫瘤模型，4×106腫瘤細(xì)胞例如LS174T、HT29和CFPAC-1都在治療前作為皮下腫瘤生長大約4周。將患腫瘤的小鼠分成對照組(未治療)和實(shí)驗(yàn)組(每天用0.5cc包含107-108CFU病毒的SinNREP/LacZ治療)。每天利用公式(長，cm)×(寬，cm)×(高，cm)計算腫瘤大小。LS174T試驗(yàn)和CFPAC-1試驗(yàn)在對照和試驗(yàn)組中都有4只小鼠，而HT29試驗(yàn)在對照和試驗(yàn)組中都有5只小鼠。
肝HuH7腫瘤用先前描述的方法建立(Kozlowski等，Cancer Res.，1984，443522-3529)。將SCID小鼠(6周齡；Taconic，Germantown，NY)被麻醉，并穿過皮膚和腹膜在左側(cè)橫腹部做一個橫向的切口，露出脾利用一個27.5規(guī)格的針(Becton Dickenson)通過脾門給小鼠門靜脈注射在包括10％PBS的250μl DMEM中的2×106HuH7細(xì)胞。在腫瘤注射八個星期后，當(dāng)腫瘤可觸知時，通過i.p.給小鼠注射250μl辛德比斯載體一次或連續(xù)三天。對照組小鼠采用同樣的方法注射Opti-MEM。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，在最后一次注射后的第二天，將所有小鼠處死。
β-gal免疫染色。β-半乳糖苷酶蛋白(β-gal)的免疫組織化學(xué)的檢測在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織上進(jìn)行，采用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉抗生物素辣根過氧化物酶復(fù)合物，利用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為一種發(fā)色原和一種自動化的免疫色料(NexES，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ檢測)。并采用適當(dāng)?shù)年栃詫φ?用β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系)和陰性對照。簡要地，使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系在合適的條件下生長到細(xì)胞密度約為106細(xì)胞/ml。輕輕壓擠這些細(xì)胞并重新懸浮于少量的培養(yǎng)基中。向該懸浮液中加入等比例的纖維蛋白和凝血酶，形成一種纖維蛋白/凝血酶/細(xì)胞凝塊，將其固定在10％中性緩沖的福爾馬林中。肝/腫瘤標(biāo)本被從動物中切離出來并固定在10％中性緩沖福爾馬林中。細(xì)胞凝塊和組織都在福爾馬林中固定12小時并處理用來進(jìn)行石蠟包埋。制備5μm厚的組織切片，放在靜電電荷的玻璃載玻片上并在60℃烘烤過夜。玻片用二甲苯?jīng)_洗三次脫蠟，然后用梯度乙醇(100％、90％和70％)再水合。對于每一樣品，一個玻片用蘇木精和曙紅染色，而其它的玻片通過用一種抗-β-半乳糖苷酶小鼠單克隆抗體(BIODESIGN，Kennebunk，ME)對細(xì)胞進(jìn)行染色來進(jìn)行β-gal檢測，所述抗體以1∶50稀釋溫育過夜后使用。β-gal蛋白的細(xì)胞定位在胞漿。
β-gal分析。組織中β-gal蛋白的表達(dá)利用All-in-OneTMβ-gal分析試劑盒(PIERCE，Rockford，IL)來研究。利用使用B型研杵(30擊)的玻璃Pyrex勻漿器使組織在3ml PBS中形成均勻分布的微粒。將攪勻的樣品在1000rcf 4℃離心10分鐘。收集上清液，將沉淀部分再懸浮在2ml PBS中，收集等分試樣，作為組織成分。將每份50μl的等分試樣與50μlβ-gal分析試劑在一個96孔板的孔中混合。在37℃溫育30分鐘后，利用一個分光光度計在405nm處讀取吸光度。每一蛋白濃度通過BIORAD試劑(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)來確定，每100μg蛋白校準(zhǔn)結(jié)果。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。體外感染數(shù)據(jù)利用標(biāo)準(zhǔn)學(xué)生t檢驗(yàn)來分析。從不同小鼠模型中獲得的腫瘤大小數(shù)據(jù)，利用Macintosh使用GraphPad Prism 3.0版的雙因素重復(fù)測量方差分析法來分析。每一因素變化的顯著性通過F比值來測定，F(xiàn)比值等于(特異性因素的均方)/(剩余均方)。F值以下列形式出現(xiàn)F(因素df，殘余df)，其決定F分布。P值是計算為正無窮大的F比值的特殊的F分布的積分。例如，測定如果SinRep/LacZ引起了顯著的BHK腫瘤的減少，那么因素SinRep/LacZ的F比值是F(1，32)＝5.915，并且基于F(1，32)分布的P值是0.0208，它小于0.05。因此，SinRep/LacZ在BHK腫瘤上的效果被認(rèn)為是顯著的。另一方面，因?yàn)镕(32，32)＝0.3712并且P＝0.9968，所以由不同的個體患者引起的效果是不顯著的。
兩因素之間相互作用的統(tǒng)計學(xué)分析也可以通過F比值來測定。如果從SinRep/LacZ和治療時間得到的結(jié)果是相加的，那么在這兩個因素之間沒有相互作用。如下所公開的，比較未治療動物和用SinRep/LacZ治療的動物的腫瘤大小的縮減量，在SinRep/LacZ和治療時間之間的交互作用是有顯著性差異的(F(7，32)＝5.14，P＝0.0005)。相反，當(dāng)將用SinRep/LacZ治療的動物與用SinRep/IL12治療的動物比較時，在病毒和治療時間之間沒有顯著的交互作用(F(14，60)＝0.8290，P＝0.6303)，說明腫瘤消退的相同的動力學(xué)。
結(jié)果辛德比斯載體在體外感染許多人腫瘤細(xì)胞系。基于辛德比斯病毒的載體SinRep/LacZ(圖1)(它攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ)基因)和SinRep/Luc(它攜帶螢火蟲熒光酶(Luc)基因)，有效地感染大多數(shù)試驗(yàn)的人腫瘤細(xì)胞系LS174T(結(jié)腸)、ES-2(卵巢的)、HT29(結(jié)腸)、CFPAC-1(胰腺的)、PC-3(前列腺)、HuH7(肝)和SKOV-3(卵巢的)。SinRep/Luc也顯示低、但卻是顯著的對A498(腎)和HT1197(膀胱)細(xì)胞(P＜0.0001)的感染性，并且顯示中等水平的對A431(表皮樣癌)細(xì)胞(P＜0.0001)的感染性。所有人細(xì)胞系都在約100MOI被感染并且在第二天分析在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中的標(biāo)記酶(β-gal)活性，如材料和方法部分所述。上述人腫瘤細(xì)胞系的模擬感染導(dǎo)致非常低的約150的相對熒光單位(RLU)讀數(shù)。
在腫瘤細(xì)胞感染后辛德比斯病毒誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。由于病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，哺乳動物細(xì)胞的辛德比斯病毒感染先前已經(jīng)被報道有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性(LEVINE等，NATURE，361739-742，1993；JAN AND GRIFFIN，J.VIROL.7310296-10302，1999；JAN等，J.VIRIL.，746425-6432，2000；BALACHANDRAN等，J.VIROL.，741513-1523，2000)。為了確定對于腫瘤細(xì)胞的這一觀察，本發(fā)明發(fā)明人在將不同腫瘤細(xì)胞系感染后，用臺盼藍(lán)排除分析試驗(yàn)了不同腫瘤細(xì)胞系的變化。在用約100MOI的辛德比斯載體SinRep/LacZ感染6種不同的腫瘤細(xì)胞系后，在一個5天周期(第0天-第4天)后快速細(xì)胞死亡發(fā)生。BHK細(xì)胞對于SinRep/LacZ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是非常敏感的，并且它們中的大多數(shù)在感染后兩天死亡。在ES-2細(xì)胞上觀察到了相似的結(jié)果。LS174T、CFPAC-1、HT29和SKOV-3細(xì)胞還需要兩或三天才達(dá)到在BHK細(xì)胞上觀察到的相同的細(xì)胞死亡水平。在對照試驗(yàn)中，所有細(xì)胞系都只在培養(yǎng)基中溫育，沒有顯著的細(xì)胞死亡現(xiàn)像。
在體內(nèi)辛德比斯載體顯示抗腫瘤效應(yīng)。為了評價辛德比斯載體的抗腫瘤效應(yīng)，將5×106BHK細(xì)胞皮下接種到具有嚴(yán)重混合免疫缺陷型(SCID)的小鼠(8-10周齡)的右下腹部。BHK的選擇基于它們對于辛德比斯病毒感染和辛德比斯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的高易感性。在接種10天后，BHK腫瘤通常已長到1cm2大小。然后將小鼠分成試驗(yàn)和對照組。實(shí)驗(yàn)組接受攜帶β-半乳糖苷酶報告基因的約107SinRep/LacZ載體或攜帶兩個編碼鼠IL12亞單位(mP35和mP40)基因的SinRep/IL12載體的腹腔內(nèi)(i.p.)注射，一周五次注射入左腹部(遠(yuǎn)離腫瘤的位點(diǎn))，而對照組小鼠不接受治療或被注射PBS。在治療的第12天，將所有對照組小鼠處死，因?yàn)榇藭r腫瘤負(fù)擔(dān)已開始損害它們的行走能力和其它功能。相反，實(shí)驗(yàn)組中的小鼠在治療的第6到7天開始顯示腫瘤減小。重復(fù)測定的雙向方差分析(RM雙向方差分析)表明，辛德比斯載體顯著地減小了BHK腫瘤尺寸。實(shí)際上，大多數(shù)BHK腫瘤小鼠在治療30天后都變得沒有腫瘤了。雖然SinRep/LacZ和SinRep/IL12具有抗腫瘤活性的相似的動力學(xué)，但是與SinRep/LacZ相比，SinRep/IL12對于BHK細(xì)胞具有更高的抗腫瘤活性(P＝0.0167)。
給另一組小鼠植入5×106BHK細(xì)胞，在7天后腫瘤長大至約5×5mm2。將患腫瘤的小鼠分為對照組(不治療)和實(shí)驗(yàn)組(每天用SinRep/LacZ治療)，在連續(xù)治療三天后，制備對照組和試驗(yàn)組的腫瘤切片。用蘇木精和曙紅染色表明出現(xiàn)了兩個顯著不同的腫瘤組；一組中，大約90-95％的腫瘤壞死，而另一組大約30％的腫瘤壞死(分別相應(yīng)于治療的和未治療的腫瘤)。治療的腫瘤比未治療的腫瘤小。血管供應(yīng)用對因子VIII的免疫組織化學(xué)來證明。這些血管的尺寸為中等尺寸至小尺寸，并且在存活的腫瘤區(qū)域有小尺寸的血管。壞死的腫瘤細(xì)胞被曙紅染色，并且失去了細(xì)胞組織和細(xì)胞膜。未治療腫瘤的壞死區(qū)域是集中的，然而，在被治療的腫瘤中，大多數(shù)都是存活細(xì)胞的一個邊的壞死。免疫組織化學(xué)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色只在被治療的動物和壞死區(qū)域獲得。在活的腫瘤區(qū)域沒有檢測到β-gal。另外，β-gal-陽性染色的面積相應(yīng)于因子VIII陽性染色的面積，證明辛德比斯病毒存在并通過血液通道被傳送到腫瘤。此外，壞死和β-gal的分布表明，有活力的辛德比斯病毒只存在于被治療腫瘤的周圍。在被治療的腫瘤中，強(qiáng)烈但受限的通道(Tunnel)陽性信號在被治療腫瘤的有活力區(qū)和壞死區(qū)邊緣被觀察到。在對照腫瘤中，在對照腫瘤的有活力的-壞死邊界上的凋亡信號不那么強(qiáng)烈，并且是更加彌散的。而且，大量的尖銳并清晰的凋亡體在被治療腫瘤的邊界區(qū)域被觀察到。在控制和治療腫瘤的中心壞死區(qū)域都沒有觀察到通道信號。
SinRep/IL12載體的注射也導(dǎo)致了在SCID小鼠上BHK腫瘤的減小(P＝0.0167)。
也皮下接種人腫瘤細(xì)胞LS174T(結(jié)腸)、HT29(結(jié)腸)和CFPAC-1(胰腺)，并在治療前使其生長到一定的尺寸。用SinRep/LacZ對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行治療，一周五次，對照組不接受治療或注射PBS。在具有BHK腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，在SCID小鼠中治療引起了顯著的LS174T和CFPAC-1腫瘤減小(P＜0.0001)。治療約兩周后，辛德比斯載體在LS174T和CFPAC-1腫瘤中引起顯著的腫瘤生長抑制，并且許多無腫瘤的小鼠也對治療產(chǎn)生相應(yīng)。SinRep/LacZ的抗腫瘤活性雖然較低但仍是非常有顯著性的(P＜0.0001)?；赗M雙向方差分析，所有人類腫瘤模型表明在不同的個體患者之間沒有顯著性差異。
辛德比斯病毒能夠靶向SCID小鼠肝中的HuH7腫瘤。HuH7肝腫瘤通過穿過脾門的門靜脈植入肝細(xì)胞癌HuH7細(xì)胞(2×106)來誘導(dǎo)。在大約8個星期后，腫瘤已明顯可觸及，對小鼠i.p.注射(1或3次)SinRep/LacZ載體。用SinRep/LacZ載體治療患腫瘤的小鼠一次或連續(xù)三天，在最后一次注射后的第二天，將小鼠處死。在正常肝組織和未感染的對照部分的腫瘤中沒有發(fā)現(xiàn)β-gal陽性細(xì)胞。在只用辛德比斯載體感染了一次的肝腫瘤中也沒有清晰地檢測到β-gal。然而，在連續(xù)三天感染的肝腫瘤中很容易檢測到。在用SinRep/LacZ注射三次的腫瘤中，也可以觀察到壞死。
在另一個實(shí)驗(yàn)中，在一次或三次治療后，對β-gal蛋白在各種組織中的表達(dá)進(jìn)行定量。與前面的實(shí)驗(yàn)相同，在一次感染小鼠和對照小鼠的腫瘤細(xì)胞之間沒有顯著的差異，但是接受三次治療的小鼠比對照組小鼠的腫瘤細(xì)胞上清液中顯示12到18倍高的β-gal水平，比組織樣品顯示19到38倍高的水平。無論動物是接受了一次還是三次辛德比斯載體注射，在肝、心臟、肺、腎和睪丸中β-gal的活性均沒有顯著地升高。在被注射小鼠的腦中觀察到了低但卻顯著的β-gal水平。盡管對腦細(xì)胞具有感染性，但是所有接受了一次和三次SinRep/LacZ注射的小鼠都能保持健康并且沒有異常行為。
NK細(xì)胞提高辛德比斯載體的抗腫瘤效應(yīng)。在C.B-17-SCID小鼠和C.B-17-SCID/bg小鼠中誘導(dǎo)皮下BHK腫瘤。C.B-17-SCID/bg同C.B-17-SCID類似，僅是除了缺乏T和B細(xì)胞之外，還包括beige(bg)常染色體隱性突變，它產(chǎn)生削弱的巨噬細(xì)胞趨向性和活動性，并且缺乏天然殺傷(NK)細(xì)胞。與SCID/bg相比，在SCID小鼠中用辛德比斯載體進(jìn)行的每天治療似乎更有效(P＞0.0001)。因此，只在SCID小鼠中獲得了腫瘤的完全退化。
討論在這里公開的結(jié)果表明，基于辛德比斯病毒的復(fù)制缺陷型載體(即SinRep/LacZ、SinRep/Luc和SinRep/IL12)能夠在體外和體內(nèi)感染廣譜的人腫瘤細(xì)胞。如在本實(shí)施例中公開的那樣，辛德比斯載體不但在體外在各種哺乳動物腫瘤細(xì)胞系中而且在體內(nèi)在人或嚙齒動物源的移入的腫瘤中均可以誘導(dǎo)凋亡。因此，即使不加入任何外源性基因，基于辛德比斯病毒的載體本身也能夠作為抗惡性腫瘤的治療劑。
的確，在本研究中，引入辛德比斯載體在體內(nèi)產(chǎn)生了BHK腫瘤細(xì)胞的高度凋亡和壞死并伴隨著腫瘤的完全衰退。用辛德比斯載體進(jìn)行多次注射(從三次到超過十五次)治療，對實(shí)驗(yàn)動物沒有顯現(xiàn)出毒性，這表明這些載體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的選擇性感染。實(shí)際上，在心臟、肺、正常肝臟細(xì)胞和腎中沒有觀察到顯著的感染。雖然能探測到很少量的腦感染，但是在成年(6-8周齡)實(shí)驗(yàn)小鼠中沒有引起可觀察到的臨床CNS紊亂，已知它們能抵抗辛德比斯病毒誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用(Griffin，J.Infect.Dis.，133456-464，1976)。
當(dāng)在這里進(jìn)一步公開時，在經(jīng)用SinRep/LacZ載體三次注射進(jìn)行治療后對BHK腫瘤進(jìn)行免疫染色證明，在腫瘤外圍出現(xiàn)廣泛的壞死區(qū)域。這與由缺氧和營養(yǎng)不良引起的在腫瘤中心看到的典型壞死相反，由缺氧和營養(yǎng)不良引起的在腫瘤中心看到的典型壞死可以容易地在未治療小鼠中看到。進(jìn)一步，在腫瘤中感染載體和血管的共定位證明，辛德比斯病毒的由血液而生的特征在載體運(yùn)輸中起了很重要的作用。
載體在血液中的清除率是另一個重要的因素，它決定了由載體介導(dǎo)的腫瘤靶向的成功。最廣泛使用的病毒載體，即逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體在血流中是不穩(wěn)定的(Miyao等，Hum.Gene Ther.，81575-1583，1997；Russell等，Hum.Gene Ther.，6635-641，1995，Rother等，J.Exp.Med.，1821345-1355，1995；Alemany等，J.Gen.Virol.，812605-2609，2000)。相反，由血液產(chǎn)生的α病毒，包括辛德比斯病毒和基于辛德比斯病毒的載體，在血流中是穩(wěn)定的(Byrnes and Griffin，J.Viroi.，74644-651，2000；Bernard等，Virology，27693-103，2000；Klimstra等，J.Virol.，727357-7366，1998)。
盡管體外辛德比斯在各種細(xì)胞系中誘導(dǎo)的感染性和細(xì)胞毒性是相似的，但是在體內(nèi)觀察到了抗腫瘤活性的差異。這些差異可能由腫瘤組織中血管數(shù)目和透過性的不同、HALR的水平不同和/或?qū)Σ《揪哂刑禺愋缘牧硗獾哪[瘤受體的存在所導(dǎo)致。
如下公開的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，除了辛德比斯感染誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的直接殺死外，宿主的免疫系統(tǒng)、特別是天然殺傷(NK)細(xì)胞(對于先天的免疫是很重要的)對于腫瘤消除也有貢獻(xiàn)。實(shí)際上，NK細(xì)胞對于腫瘤(Gumperzand Parham，Nature，378245-248，1995；Trinchieri，Adv.Immunol.，47187-376，1989)和被病毒感染的細(xì)胞(Biron等，Annu.Rev.Immunol.，17189-220，1999)的細(xì)胞毒性是眾所周知的。有人還認(rèn)為，當(dāng)宿主抗病毒機(jī)制被激活時，可以發(fā)出信號，例如干擾素，它導(dǎo)致NK細(xì)胞激活(Biron等，1999，supra)。NK細(xì)胞激活也可能由腫瘤細(xì)胞壞死導(dǎo)致的炎癥和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放激活。已經(jīng)表明，IL12為一種潛在的NK細(xì)胞刺激因子，并且表明，施用IL12能產(chǎn)生對抗某些實(shí)體瘤的強(qiáng)有力的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的活性(Biron等，1999，supra；Brunda等，J.Exp.Med.1781223-1230，1993；Nastala等，J.Immunol.，1531697-1706，1994；Takeda等，J.Immunol.，1563366-3373，1996；Tsung等，J.Immunol.，1583359-3365，1997)。當(dāng)在這里公開時，與不編碼IL12的辛德比斯載體(SinRep/LacZ)相比，編碼IL12的重組辛德比斯載體(SinRep/IL12)具有提高的抗腫瘤細(xì)胞毒性。因?yàn)楸景l(fā)明的辛德比斯載體在一個很高的水平上表達(dá)外源基因，所以其他抗腫瘤治療基因例如腫瘤抑制基因、細(xì)胞毒素和細(xì)胞因子基因可能是增加辛德比斯載體的抗腫瘤效力的理想候補(bǔ)物質(zhì)。
上述在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用的SCID小鼠(它缺乏B和T細(xì)胞)不能確切地證明是細(xì)胞毒性T細(xì)胞和中和抗體是增加還是降低本發(fā)明的辛德比斯載體的抗腫瘤活性。然而，即使這些免疫細(xì)胞具有負(fù)面的影響，這些影響還是可以被容易地減少。例如，先前報道的成功用基于α病毒載體的連續(xù)接種表明，載體注射后引出的中和抗體的水平可以被合適的載體設(shè)計減少(Kamrud等，Virology，263209-219，1999；Pushko等，Virology，239389-401，1997；Pushko等，Virology，239389-401，1997)。
證明基于辛德比斯病毒的載體可以天然靶向腫瘤(可能利用了在腫瘤與正常細(xì)胞中存在的HALR表達(dá)的天然差異)。除了辛德比斯載體這一天然的優(yōu)點(diǎn)外，靶向的辛德比斯載體還可以識別細(xì)胞型或腫瘤特異性細(xì)胞表面分子，它保留了高感染性和滴度，也已由本發(fā)明人開發(fā)(見例如Ohno等，Nat.Biotechnol.，15763-767，1997)，并且可能允許體內(nèi)靶向的進(jìn)一步提高。上面提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，無論是單獨(dú)還是結(jié)合其他治療形式，辛德比斯載體均是有效的癌癥基因治療的新工具。
實(shí)施例2利用辛德比斯載體來治療人類腫瘤復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體SinRep/LacZ和SinRep/IL12按照實(shí)施例1的描述來制備并對患有晚期(轉(zhuǎn)移性)黑素瘤或晚期(轉(zhuǎn)移性)腎、腦、結(jié)腸、前列腺、膀胱、肺或卵巢癌的病人靜脈內(nèi)給藥(約500μl載體制劑，107CFU/ml)。治療每周進(jìn)行5次，持續(xù)三周或更多星期。腫瘤的尺寸通過MRI和CAT掃描持續(xù)不斷的監(jiān)測，然后進(jìn)行腫瘤壞死的組織學(xué)分析和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為的活組織檢查(當(dāng)可能的時候)。
* * *本發(fā)明不限于在這里描述的具體的實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，除了在這里描述的，從前述的說明和附圖中，各種關(guān)于本發(fā)明的修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些修改也包括在權(quán)利要求范圍內(nèi)。
還可以理解，所有堿基對的大小和氨基酸的大小、合成濃度以及分子量和摩爾數(shù)值均是近似的，僅是用于說明。
所有在此引用的專利、申請、出版物、實(shí)驗(yàn)方法、文獻(xiàn)和其他材料都在此并入本文中作參考。
權(quán)利要求
1.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括向患有此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種基于α病毒的載體，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的載體是一種基于辛德比斯病毒的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的載體是一種復(fù)制缺陷型α病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的復(fù)制缺陷型α病毒是一種復(fù)制缺陷型辛德比斯病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞因子編碼基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統(tǒng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的哺乳動物是人類。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的腫瘤是一種實(shí)體瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的實(shí)體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
15.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括向患此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞因子編碼基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統(tǒng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的哺乳動物是人類。
23.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的腫瘤是一種實(shí)體瘤。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中的實(shí)體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌，腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
25.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
26.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，與具有相同品系的正常細(xì)胞相比此腫瘤表達(dá)較高水平的高親和性層粘連蛋白受體(HALR)，該方法包括向患有此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種載體，此載體同高親和性層粘連蛋白受體(HALRs)具有一種優(yōu)先的親和性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的載體是一種基于病毒的載體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中的基于病毒的載體是一種基于α病毒的載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
30.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞因子編碼基因。
34.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統(tǒng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的哺乳動物是人類。
36.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的腫瘤是一種實(shí)體瘤。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中的實(shí)體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌，腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
38.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
39.一種治療患腫瘤的哺乳動物的藥物組合物，包括一種基于α病毒的載體和一種藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的藥物組合物，其中的載體是一種復(fù)制缺陷型α病毒。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的藥物組合物，其中的復(fù)制缺陷型α病毒是一種復(fù)制缺陷型辛德比斯病毒。
42.根據(jù)權(quán)利要求39的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
43.根據(jù)權(quán)利要求39的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞因子編碼基因。
47.一種治療患腫瘤哺乳動物的藥物組合物，該組合物包括一種復(fù)制缺陷型基于辛德比斯病毒的載體和一種藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
50.一種用來治療患腫瘤的哺乳動物的藥物組合物，該組合物包括一種載體和一種藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體對HALR具有一種優(yōu)先的親和性并且能有效地殺死腫瘤，條件是如果載體是一種基于α病毒的載體，那么它不被修飾來靶向一種腫瘤特異性細(xì)胞決定簇。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的藥物組合物，其中的載體是一種基于病毒的載體。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的藥物組合物，其中的基于病毒的載體是一種基于α病毒的載體。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應(yīng)基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因。
57.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細(xì)胞因子編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用優(yōu)先地靶向腫瘤細(xì)胞的載體治療腫瘤的方法和組合物。具體而言，本發(fā)明涉及基于α病毒(優(yōu)選基于辛德比斯病毒)的載體和基于非α病毒的載體，它們對于高親和性層粘連蛋白受體(HALR)具有優(yōu)先的親和性。這些載體有效地靶向腫瘤并且具有引起腫瘤壞死的能力。
文檔編號A61K48/00GK1520303SQ02807228
公開日2004年8月11日 申請日期2002年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月27日
發(fā)明者D·梅魯埃洛, D 梅魯埃洛 申請人:紐約大學(xué)