專利名稱：含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物用于抗病毒等藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域。
文獻Walter Karrerr，Birkhauser Verlag，Bassel undstuttgart(1958)，P.652，NO1640公開了二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)式， 但是沒有對二氫楊梅素的活性進行研究。楊梅素是一種已知的化合物，其結(jié)構(gòu)式是 迄今為止沒有人公開過含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物及其用途。
本發(fā)明的目的是提供一種新的組合物，其含有二氫楊梅素和楊梅素，其中二氫楊梅素含量是20％至98％重量比，楊梅素含量是2％至80％重量比。本發(fā)明組合物中還可以含有一種或幾種選自下面的成分楊梅甙，沒食子酸和/或茶多酚。楊梅甙的含量優(yōu)選占二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，沒食子酸的含量優(yōu)選是占二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，茶多酚的含量優(yōu)選是占二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％。
本申請人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物在制藥領(lǐng)域和保健品領(lǐng)域具有廣泛的用途。
本發(fā)明的含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物具有廣譜抗病毒作用，特別是抗乙肝病毒、流感病毒和/或冠狀病毒。含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物可以直接用作抗病毒藥物，還可以與藥學(xué)可接受載體或賦形劑混合制成廣譜抗病毒藥物組合物，藥物組合物中含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物的量可以是2-98％重量比。
本發(fā)明的含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物具有降血糖和降血脂作用，可以制備成降血糖藥和降血脂藥。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備本發(fā)明含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物的方法。本發(fā)明的組合物可以通過將所述組分單體按比例混合制備，也可以從蛇葡萄屬植物中提取。所述蛇葡萄屬植物包括粵蛇葡萄，棟葉玉葡萄，顯齒蛇葡萄，大葉蛇葡萄，白蘞，東北蛇葡萄和山葡萄。所述提取方法可以是通過各種溶劑(水和/或有機溶劑)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液經(jīng)濃縮冷卻，靜置過夜，檢測沉淀與上清的藥效成分，取具有活性的沉淀和/或經(jīng)進一步硅膠吸附后得到本發(fā)明組合物。煎煮所用的溶劑優(yōu)選水，醇類，酯類，酮類，醚類和強極性有機溶劑，更優(yōu)選低級鏈烷醇，低級脂肪酸酯，具有3-12個碳原子的酮和醚和/或水，最優(yōu)選甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇，正丁醇，異丁醇，仲丁醇，叔丁醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯，甲酸乙酯，丙酮，甲基乙基酮，乙醚，甲基乙基醚，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二甲亞砜，N，N-二甲基甲酰胺和/或水等等。分離使用的吸附劑可以是硅膠。
本發(fā)明的原理是通過建立藥理篩選模型追蹤含有二氫楊梅素和楊梅素組合物藥效活性，找到其藥用用途。體外抑菌試驗和抗病毒試驗表明本發(fā)明組合物具有抗菌消炎和廣譜抗病毒作用，特別是抗乙肝病毒、流感病毒和/或冠狀病毒。試驗還證明本發(fā)明的含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物具有降血糖和降血脂作用，具有預(yù)防和/或恢復(fù)酒精性肝損傷的功能，具有保肝護肝，增強免疫系統(tǒng)免疫力的功能。
本發(fā)明的含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物可以通過藥物領(lǐng)域常規(guī)配制技術(shù)和載體，配制成藥物組合物，藥物組合物中含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物的量可以是2-98％重量比。本發(fā)明組合物可以制備成片劑，顆粒劑，膠囊，外用藥。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)需要用本領(lǐng)域公知的技術(shù)和載體配制成其它劑型。優(yōu)選活性成分對人施用的劑量是0.01-5克/千克體重/天，但是也可以根據(jù)具體情況而定，不局限于此范圍。
通過下面的實施例詳細說明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解這些實施例只是說明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
實施例1從二氫楊梅素和楊梅素晶體制備本發(fā)明組合物取二氫楊梅素80g，楊梅素20g，上述組分在混合機中混合后得混合物?；蛘呷《錀蠲匪?8g，楊梅素2g，上述組分在混合機中混合后得混合物?；蛘呷《錀蠲匪?0g，楊梅素80g，上述組分在混合機中混合后得混合物。
實施例2從二氫楊梅素和楊梅素晶體制備本發(fā)明組合物取二氫楊梅素20g，楊梅素80g，楊梅甙2.5g，沒食子酸2.5g，茶多酚2.5g，上述組分在混合機中混合得混合物?；蛘呷《錀蠲匪?8g，楊梅素2g，楊梅甙2.5g，沒食子酸2.5g，茶多酚2.5g，上述組分在混合機中混合得混合物?；蛘呷《錀蠲匪?5g，楊梅素15g，楊梅甙25g，沒食子酸2g，上述組分在混合機中混合得混合物?；蛘呷《錀蠲匪?0g，楊梅素50g，楊梅甙25g，茶多酚2.5g，上述組分在混合機中混合得混合物。或者取二氫楊梅素70g，楊梅素30g，楊梅甙5g，上述組分在混合機中混合得混合物。
實施例3從二氫楊梅素和楊梅素晶體制備本發(fā)明組合物分別取實施例1的第一種組合物(或?qū)嵤├?的第三種組合物)30g，乳糖53g，羧甲基纖維素鈉1.5g，硬脂酸鎂0.5g，50％乙醇5ml，上述組分在混合機中混合后壓制成片。
實施例4從二氫楊梅素和楊梅素晶體制備本發(fā)明組合物取二氫楊梅素115g，楊梅素15g，糖粉345g，糊精145g，乙醇5ml，上述組分混合后干燥，得到?jīng)_劑。
實施例5從顯齒蛇葡萄植物制備本發(fā)明組合物取顯齒蛇葡萄干燥嫩莖葉2kg，用95％乙醇(醫(yī)用乙醇)回流提取兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，蒸發(fā)至干，加入1200毫升85℃熱水，使浸膏充分溶解，濾去黑色不溶物，濾液中加入硅膠(100目)200g，將濾液加熱至60℃，乘熱過濾，將濾液冷卻至室溫，沉淀，靜置過夜，得到黃色沉淀，產(chǎn)率11.2％。其中二氫楊梅素含量74.8％重量比，楊梅素含量21.1％重量比，楊梅甙的含量是2.8％重量比，沒食子酸的含量是1.3％重量比。薄層色譜分析用聚酰胺薄層層析，規(guī)格8×8cm，展開劑甲醇，顯色劑4％三氯化鐵-乙醇溶液，Rf沒食子酸＝0.72，Rf楊梅甙＝0.54，Rf二氫楊梅素＝0.50，Rf楊梅素＝0.21。
或者取顯齒蛇葡萄干燥嫩莖葉2kg，用95％乙醇(醫(yī)用乙醇)回流提取兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，蒸發(fā)至干，加入1200毫升85℃熱水，使浸膏充分溶解，濾去黑色不溶物，濾液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯溶液，蒸發(fā)至干，得到黃色沉淀，產(chǎn)率10.25％。其中二氫楊梅素含量76％重量比，楊梅素含量18％重量比，楊梅甙的含量是3.0％重量比，沒食子酸的含量是2％重量比，其余為顯齒蛇葡萄植物中Rf5＝0.41的成分。薄層色譜分析用聚酰胺薄層層析，規(guī)格8×8cm，展開劑甲醇，顯色劑4％三氯化鐵-乙醇溶液，Rf沒食子酸＝0.72，Rf楊梅甙＝0.54，Rf二氫楊梅素＝0.50，Rf楊梅素＝0.21，Rf5＝0.41。
實施例6從東北蛇葡萄植物制備本發(fā)明組合物室溫下，將收集來的東北蛇葡萄1000克洗去塵土，加入4000毫升水，超聲提取0.5小時，過濾，殘渣再加入1000毫升丙醇，再超聲提取0.5小時，再過濾，濾液合并，濃縮至2毫升，加入500毫升100℃熱水，冷卻到60℃，靜置，過濾，。濾液用硅膠(100目)100g吸附，將濾液加熱至70℃，乘熱過濾，將濾液冷卻至室溫，沉淀，靜置過夜，得到黃色沉淀，產(chǎn)率10.3％。其中二氫楊梅素含量58％重量比，楊梅素含量14l重量比，楊梅甙的含量是1.4％重量比，沒食子酸的含量是1.7％重量比，其余為東北蛇葡萄植物中Rf5＝0.43的成分。薄層色譜分析用聚酰胺薄層層析，規(guī)格8×8cm，展開劑甲醇，顯色劑4％三氯化鐵-乙醇溶液，Rf沒食子酸＝0.76，Rf楊梅甙＝0.55，Rf二氫楊梅素＝0.54，Rf楊梅素＝0.22，Rf5＝0.43。
實施例7含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物體外抗乙肝病毒的藥效試驗選擇乙型肝炎病毒(HBV)DNA轉(zhuǎn)染的2215細胞株，以其培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的滴度作為評價抗HBV效果的指標(biāo)，研究本發(fā)明實施例5的第一種組合物的抗HBV作用。本試驗還采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析法檢測藥物對細胞的毒性，選用阿昔洛韋作為陽性對照物。
1.材料與方法1.1活性成分1.1.1本發(fā)明實施例6得到的組合物1.1.2陽性藥物甘泰或注射用阿昔洛韋(Acyclovir for Injection)，批號20000409 2，湖北潛江制藥股份有限公司生產(chǎn)，鄂衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1991)第000354號。
1.2細胞與試劑2215細胞出本實驗室保存，培養(yǎng)液為DMEM(Gibco公司)，培養(yǎng)液中含10％胎牛血清，38ug/mlG418(Geneticin，Gibco公司)，0.03％L-谷胺酰胺(華美進口分裝)，青、鏈霉素各式各1000iu/ml。
MTT(瑞士Fluka公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Serva公司)HBsAg、HBeAg試劑盒由上海實業(yè)華生科技有限公司提供。批號08-2000-03，06-2000-021.3細胞培養(yǎng)與實驗分組2215細胞按常規(guī)方法以103-104個/孔的濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，5％CO2、37℃培養(yǎng)24h后移去培養(yǎng)液，按成含藥物的培養(yǎng)液，其中實施例5的第一種組合物設(shè)6個濃度95ug/ml，195ug/ml，385ug/ml，750ug/ml，1500ug/ml，3100ug/ml，阿昔洛韋設(shè)6個濃度，即62.5ug/ml、125ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、1mg/ml、2mg/ml，每個濃度設(shè)5個平行孔，同時設(shè)不加藥物孔為對照組，培養(yǎng)5天后收獲上清液。
1.4藥物的細胞毒性測定用藥5天后，吸凈各孔上清液，培養(yǎng)孔重新加入含MTT的培養(yǎng)液，使MTT最終濃度為0.5mg/ml、37℃培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100ulDMSO，振蕩10min，酶標(biāo)儀上490nm測定OD值，與相應(yīng)對照孔的吸光度值(存活細胞為100％)比較，計算存活細胞百分比，確定藥物對細胞的最大無毒劑量濃度。
1.5檢測根據(jù)藥物對細胞的最大無毒劑量濃度向前推出4-5個劑量級，收獲各級上清液用于HBsAg和HBeAg的檢測，檢測按操作說明書進行。
1.6藥物抗HBV的評價方法用藥物對HBsAg或HBeAg的抑制率進行評價 2.結(jié)果2.1藥物對細胞的毒性結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著用藥濃度的提高，其對細胞的毒性增加，對細胞的最大無毒濃度(存活細胞在90％以上的藥物濃度)為750ug/ml，陽性藥阿昔洛韋為500ug/ml(表1)。
2.2藥物抗HBV效果本發(fā)明實施例6的第一種組合物及陽性藥對2215細胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制結(jié)果見表2，從表中可以看出，在本試驗所用的濃度下本發(fā)明實施例6的第一種組合物對HBsAg、HBeAg的抑制率分別在15.68±3.723％-54.65±9.067％和25.84±1.705-45.38±8.705％之間，隨著藥物濃度的增加其抑制率逐漸增大，當(dāng)藥物濃度達750ug/ml時，對HBsAg的抑制率大于50％。
陽性藥物阿昔洛韋對HBsAg、HBeAg的分泌抑制率分別為19.48±9.86％-51.86±7.14％和20.42±1.52％-28.44±5.15％之間，當(dāng)藥物濃度為500ug/ml時，對HBsAg的抑制率大于50％。
表1本發(fā)明實施例6的第一種組合物對細胞的毒性藥物名稱 濃度(ug/ml) 存活細胞(％M±S)310052.38±1.20本發(fā)明 150088.40±2.11實施例 750 92.60±1.825得到的 385 93.31±5.45組合物 195 95.68±4.7895 99.70±1.28200076.64±4.96阿 100087.40v1.51昔 500 92.54±1.76洛 250 92.76±8.84韋 125 92.06±4.8762.596.48±4.04表2本發(fā)明實施例6得到的組合物的體外抗HBV試驗結(jié)果藥物名稱 濃度(ug/ml) HbsAg抑制率 HBeAg抑制率(％M±S)(％M±S)本發(fā)明 95 15.68±3.72325.84±1.705實施例 195 23.68v2.213 28.39±7.0875得到的 385 35.48±8.70531.49±4.689組合物 750 54.65±9.06745.38±8.705阿 62.5 19.48±9.86 20.42±1.52昔 125 25.88±11.0920.94±10.55洛 250 44.44±5.94 21.62±19.95韋 500 51.86±7.14 28.44±5.15以上結(jié)果表明本發(fā)明實施例6的組合物在體外具有一定的抗乙肝病毒活性。用本發(fā)明實施例5的組合物、實施例1的第一種組合物或?qū)嵤├?的第三種組合物進行試驗，也得到了基本相同的結(jié)果，這些組合物在體外都具有抗乙肝病毒活性。
實施例8含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物在鴨體內(nèi)對鴨乙型肝炎病毒感染的治療效果在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)進行治療試驗，觀察本發(fā)明實施例1，2，5和6得到的組合物是否抑制鴨乙型肝炎病毒。
實驗采用一日齡北京鴨靜脈注射鴨乙型肝炎病毒，7天后開始給鴨口服本發(fā)明實施例1，2，5得到的組合物3個劑量組1.25，2.5和5.0g/kg，1天2次，給藥10天(Bid×10)，觀察藥物對鴨的毒性和鴨血清鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影響，并與拉米夫定比較。
實驗表明，本發(fā)明實施例1，2，5得到的組合物大劑量組5.0g/kg口服，1天2次10天，無毒性，第一批實驗，按配對統(tǒng)計，5.0g/kg組，給藥后第5，10天和停藥后3天治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著下降，(P＜0.01)。按成組統(tǒng)計與各自對照組比較，給藥后第5天，第10天和停藥后3天，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著下降，(P＜0.01)。2.5g/kg組，給藥后第5，10天和停藥后3天治療組鴨血清DHBV-DNA有顯著和非常顯著下降，(P＜0.05-0.01)。按成組統(tǒng)計與各自對照組比較，給藥后第10天和停藥后3天，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著下降，(P＜0.05)。1.25g/kg組，給藥后第5天，按配對統(tǒng)計，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著下降，(P＜0.01)。按成組統(tǒng)計，給藥后第5天，治療組鴨血清DHBV-DNA有顯著下降，(P＜0.05)。第二批實驗5.0g/kg組，按配對統(tǒng)計，給藥后第5天，第10天和停藥后3天治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著和顯著下降，(P＜0.01-0.05)。按成組統(tǒng)計與各自對照組比較，給藥后第5天，第10天，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著和顯著下降，(P＜0.01-0.05)。2.5g/kg組，按成組統(tǒng)計與各自對照組比較，給藥后第10天，治療組鴨血清DHBV-DNA有顯著下降，(P＜0.05)。1.25g/kg組，無抑制作用。第三批實驗5.0g/kg，配對統(tǒng)計，給藥后第5、10天，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著和顯著效果。(P＜0.01-0.05)。按成組統(tǒng)計與各自對照組比較，給藥后第5天，治療組鴨血清DHBV-DNA有非常顯著下降，(P＜0.01)。2.5g/kg組，按配對統(tǒng)計，給藥后第5、10天和停藥后3天，治療組鴨血清DHBV-DNA有顯著和非常顯著下降，(P＜0.05，0.01，0.05)。成組統(tǒng)計，給藥后第5天，第10天，治療組鴨血清DHBV-DNA有顯著和非常顯著下降，(P＜0.05-0.01)。1.25g/kg組，無抑制作用。拉米夫定對照組，有非常顯著效果，說明實驗可信。提示本發(fā)明實施例1，2，或5得到的組合物在3.4-10.0g/kg組對鴨乙型肝炎病毒感染有效。
材料和方法(一)藥物本發(fā)明實施例5得到的組合物，用生理鹽水配制。
陽性藥物拉米夫定由葛蘭素威康制藥公司產(chǎn)品，用生理鹽水配制。
(二)病毒鴨乙型肝炎病毒 鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強陽性血清，采自上海麻鴨，-70℃保存。
(三)動物1.日齡北京鴨，購自北京前進種鴨場動物飼養(yǎng)場。
(四)試劑α-32P-dCTP購自北京福瑞生物技術(shù)工程公司。缺口翻譯藥盒購自普洛麥格公司(Promega Co.)；Sephadex G-50，F(xiàn)icoll PVP購自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司產(chǎn)品；魚精DNA、牛血清白蛋白為中國科學(xué)院生物物理所產(chǎn)品；硝酸纖維素膜0.45um Amersham公司產(chǎn)品。
(五)實驗方法1.鴨乙型肝炎病毒感染1日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分離血清，-70℃保存待檢。
2.藥物治療試驗DHBV感染雛鴨7天后隨機分組進行藥物治療試驗，每組6只，給藥組分3個劑量組，分別為1.25，2.5，5.0g/kg組，口服，1天2次，10天。設(shè)病毒對照組(DHBV)，以生理鹽水代替藥物。陽性藥用拉米夫定，口服給藥50mg/kg，1天2次，10天。在感染后第7天即用藥前(T0)，用藥第5天(T5)，用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。
3.檢測方法取上述待檢鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平的動態(tài)，按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，在酶標(biāo)檢測儀測定OD值(濾光片為490nm)，計算血清DHBV-DNA密度，以雜交斑點OD值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。
(六)藥效計算1.計算每組鴨不同時間血清DNA OD值的平均值(X±SD)，并將每組鴨用藥后不同時間(T5、T10)和停藥后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平與同組給藥前(T0)OD值比較，采用配對t檢驗，計算t1、P1值。分析差異的顯著性，判斷藥物對病毒感染的抑制效果。
2.計算每組鴨用藥后不同時間(T5、T10)和停藥第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作圖，比較各組鴨血清DHBV-DNA抑制率的動態(tài)。
結(jié)果(一)1日齡北京鴨感染DHBV后，血清DHBV-DNA動態(tài)DHBV-DNA感染鴨口服生理鹽水后DHBV-DNA斑點雜交結(jié)果見表3。三批實驗感染78只血清DHBV-DNA全部陽性。病毒對照組18只雛鴨感染后第7天血清DHBV-DNA全部陽性，三批實驗全程21天內(nèi)血清DHBV-DNA水平感染后基本平穩(wěn)。
(二)陽性藥拉米夫定對DHBV感染鴨血清DHBV-DNA的影響DHBV感染鴨口服陽性藥拉米夫定50mg/kg，1天2次，10天。結(jié)果見表3、表4。配對分析，給藥第10天(T10)與給藥前(T0)的OD值比較，下降有非常顯著性(P＜0.01)，給藥后對血清DHBV-DNA抑制率與病毒對照組，成組分析給藥第10天(T10)有非常顯著性差異，(P＜0.01)。停藥后3天(P3)無統(tǒng)計學(xué)意義。有反跳現(xiàn)象。
(三)本發(fā)明實施例5的第一種組合物在DHBV感染鴨體內(nèi)對鴨血清DHBV-DNA的影響三批實驗結(jié)果表明
1.第一批實驗選用3個劑量組，見表3，

圖1。分別為1.25，2.5和5.0g/kg組，在給藥前(T0)與給藥后第5天(T5)、10天(T10)及停藥后3天(P3)，取鴨血，分離血清，檢測DHBV-DNA OD值，作自身比較。結(jié)果表明5.0g/kg組在給藥第5天(T5)、第10天(T10)，和停藥后第3天(P3)，鴨血清DHBV-DNAOD值與給藥前(T0)比較，配對分析，有非常顯著的抑制作用。(P＜0.01)。成組分析，給藥第5天，10天(T10)，和停藥后第3天(P3)，給藥組與對照組比較，有非常顯著的抑制作用。(P＜0.01)。2.5g/kg組，在給藥第5天(T5)、第10天(T10)，和停藥后第3天(P3)，鴨血清DHBV-DNA OD值與給藥前(T0)比較，配對分析，有顯著和非常顯著的抑制作用。(P＜0.05-0.01)。成組分析，給藥第10天(T10)，和停藥后第3天(P3)，給藥組與對照組比較，有顯著的抑制作用。(P＜0.05)。1.25g/kg組，鴨血清DHBV-DNA OD值與給藥前(T0)比較，配對分析，在給藥第5天(T5)，有顯著的抑制作用。(P＜0.05)。成組分析，給藥第5天(T5)，給藥組與對照組比較，有顯著的抑制作用。(P＜0.05)。
2.第二批實驗結(jié)果表明見表3，4，圖2。5.0g/kg組在給藥后不同時間，鴨血清DHBV-DNA，OD值與給藥前(T0)比較，給藥后第5天(T5)、10天(T10)，和停藥后第3天(P3)，有非常顯著和顯著抑制作用，(P＜0.01-0.05)，成組分析，與對照組抑制％作對比分析，給藥第5天(T5)、第10天(T10)，有非常顯著和顯著抑制作用，(P＜0.01-0.05)。2.5g/kg組，配對分析，給藥后第10天(T10)，有非常顯著抑制作用，(P＜0.01)，成組分析，與對照組抑制％作對比分析，給藥第10天(T10)，有顯著抑制作用，(P＜0.05)。1.25g/kg組，抑制作用不明顯。
3.第三批重復(fù)實驗結(jié)果表明見表3，4，圖3。5.0g/kg組給藥后第5，10天，DHBV-DNA與給藥前比較，配對分析，有非常顯著和顯著抑制作用，(P＜0.01-0.05)，成組分析，與對照組抑制％作對比分析，給藥第5天(T5)，有非常顯著抑制作用，(P＜0.01)。2.5g/kg組，配對分析，與給藥前比較，給藥第5天(T5)、第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，有非常顯著和顯著抑制作用，(P＜0.05，0.01，0.05)。成組分析，與對照組抑制％作對比分析，給藥第5天(T5)、第10天(T10)，有顯著和非常顯著抑制作用，(P＜0.05-0.01)。1.25g，抑制作用不明顯。
表3本發(fā)明實施例5的第一種組合物在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA OD值比較實驗 劑量 鴨數(shù)(只) 鴨血清DHBV-DNA OD490值(X±SD)P3組別批次 g/kg bid×10 T0T5 T10生理鹽水 60.958±0.06 0.926±0.07 0.930±0.07 0.910±0.07本發(fā)明實施 1.25 60.938±0.09 0.738±0.10**0.836±0.13 0.783±0.19I例5的第一 2.5 60.918±0.06 0.775±0.09* 0.675±0.08** 0.698±0.05**種組合物5.0 61.291±0.21 0.985±0.23**0.916±0.16** 0.943±0.09**生理鹽水 60.549±0.05 0.528±0.04 0.514±0.03 0.515±0.03本發(fā)明實施 1.25 60.638±0.15 0.529±0.09 0.526±0.08 0.546±0.09II例5的第一 2.5 60.731±0.05 0.665±0.09 0.576±0.04** 0.656±0.06種組合物5.0 61.251±0.38 0.675±0.26**0.758±0.28** 0.810±0.24*生理鹽水 60.802±0.05 0.795±0.06 0.755±0.02 0.776±0.08本發(fā)明實施 1.25 60.989±0.05 0.985±0.20 0.955±0.21 0.896±0.09III 例5的第一 2.5 61.383±0.23 1.005±0.10* 0.985±0.09** 0.995±0.13*種組合物5.0 61.385±0.09 0.679±0.32**0.915±0.39* 1.230±0.293TC 0.05 61.554±0.17 1.195±0.62 0.657±0.20** 1.742±0.14統(tǒng)計處理t1，P1給藥組不同時間(T5、T10，P3)鴨血清DHBV-DNA OD值與感染前(T0)OD值比較(配對t檢驗)。*p1＜0.05，**p1＜0.01。
表4.在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)口服本發(fā)明實施例5的第一種組合物治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的比較實驗 劑量 鴨數(shù) 抑制率(％)藥物(只) T5 P3批次 g/kg bid×10 T10病毒對照 63.32 2.91 4.90本發(fā)明實施例5的1.25 621.25* 10.25 16.18I 第一種組合物 2.5 615.25* 25.97 23.78*5.0 623.13**29.15** 26.35**病毒對照 63.51 5.86 5.62本發(fā)明實施例5的1.25 616.96* 17.58 14.25II 第一種組合物2.5 69.12 21.50*10.265.0 646.09**38.80*35.27*病毒對照 60.88 5.65 2.99本發(fā)明實施例5的1.25 60.41 3.18 9.25第一種組合物III2.5 627.21* 28.69** 27.865.0 650.98**33.98 11.563TC50mg/kg 623.88 56.67** -13.16病毒對照 63.32 2.91 4.90本發(fā)明實施例5的1.25 619.57* 8.31 14.80I 第一種組合物2.5 613.52 23.68 22.03*5.0 619.39**26.76** 23.96**II 病毒對照 63.51 5.86 5.62
本發(fā)明實施例5的1.25610.50 6.687.06第一種組合物2.5 66.8617.02* 6.165.0 636.35** 26.80* 20.01病毒對照 60.885.652.99本發(fā)明實施例5的1.256-5.34 0.235.94第一種組合物III2.5 619.93* 26.39** 23.565.0 650.82** 32.87 9.533TC 50mg/kg 623.88 56.67** -13.16統(tǒng)計處理t2，P2給藥組不同時間(T5、T10，P3)鴨血清DHBV-DNA水平與感染前(T0)比較的抑制％與病毒對照組抑制％比較(成組t檢驗)。
*p2＜0.05，**p2＜0.01，***p2＜0.001。
總結(jié)本發(fā)明實施例5的第一種組合物在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)治療實驗，三批實驗結(jié)果表明鴨乙型肝炎病毒感染鴨在感染后第7天口服本發(fā)明實施例5的第一種組合物治療，5.0g/kg一天2次10天對感染鴨血清DHBV-DNA水平的抑制效果有非常顯著性作用，(P＜0.01)，無毒性反應(yīng)；2.5g/kg組在實驗中給藥第5，10天，具有一定的抑制作用。有顯著和非常顯著性作用，(P＜0.05，0.01)。實驗中1.25g/kg組，無明顯抑制作用。陽性藥拉米夫定口服對DHBV-DNA的抑制作用，有非常顯著的抑制作用。與以往多次實驗結(jié)果一致。以上實驗結(jié)果表明本發(fā)明實施例5的第一種組合物治療鴨乙型肝炎病毒感染鴨有效，有效劑量為2.5-5.0g/kg，一天2次10天。
用實施例1的組合物、實施例2組合物和實施例6的組合物進行上述試驗，也得到了基本相同的結(jié)果，說明這些組合物治療鴨乙型肝炎病毒感染鴨有效。
實施例9含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物的抗流感病毒實驗流感病毒的分離和鑒(滴)定目前常用雞胚進行分離進行流感病毒，接種途徑為雞胚的尿囊腔，3天后出現(xiàn)后雞胚死亡的病變特征和出現(xiàn)血凝素，對此，我們采用此方法進行對本發(fā)明實施例1，2或5得到的組合物的鑒定。我們采用一定濃度的提取液和4個血凝單位的流感病毒1∶1混合，讓二者于室溫作用20分鐘后再注射雞胚，注射量為每胚0.2ml。實驗采用9至11日齡的雞胚，進行尿囊腔接種，培養(yǎng)48小時后，于4℃放置過液，然后無菌取其尿液，經(jīng)1000rpm離心10分鐘后取上清，分裝，-20℃存放，備檢測之用，尿液的檢測分血凝和血抑兩種，使用的紅細胞是來亨公雞，方法為常規(guī)法。
抗病毒實驗用不同濃度的本發(fā)明實施例5，6，1或2得到的組合物在雞胚中進行抗病毒實驗表5流感病毒血凝抑制試驗血清稀釋度原液 10× 20× 40× 80× 160× 320× 640× 1280×樣品濃度原液1 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++++++原液2 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++++++原液3 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++原液4 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-5a++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++++++10-5b++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++++++10-5c++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-5d++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-6a++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-6b++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-6c++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-6d++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++備注1、原液指初始濃度的二氫楊梅素4mg/ml2、10-5與10-6指從本發(fā)明實施例5的第一種組合物原液進行藥的稀釋度3、判定結(jié)果時按血凝強度分別以++++、+++、++、-表示以50％紅細胞出現(xiàn)凝集++的血凝稀釋度為其血凝下降紅細胞呈細沙粒樣無效主孔(管)底者為+++，即100％凝集；紅細胞均勻鋪于孔(管)底，但邊緣不整而稍向孔(管)底集中者為+++，即75％凝集；紅細胞于孔(管)底形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++，即50％凝集；紅細胞于孔(管)底形成圓團，但邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊者為+，即25％凝集；紅細胞于孔(管)底形成圓團，邊緣光滑整齊者為一，即無凝集。
上述實驗數(shù)據(jù)證明含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物具有抗流感病毒作用。
實施例10本發(fā)明的含有含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物增強免疫系統(tǒng)免疫力的功能的試驗1.含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響1.1實驗?zāi)康挠^察含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠吞噬功能的影響。
1.2受試藥物名稱含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物溶劑熱雙蒸水用量0.5ml/20g小鼠1.3對照樣品聯(lián)苯雙酯；上海天平制藥廠，滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第3765號-0111.4動物小鼠，昆明種，雄性，19～21g。
雞紅細胞5％濃度1.5方法昆明種小鼠，隨機分為5組，即對照組、含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物75、150、300mg/kg、聯(lián)苯雙酯150mg/kg，對照組給予生理鹽水，給藥組均口服給藥，每日1次，共6次，末次給藥同時腹腔注射0.5％水解乳蛋白1.5ml/只，24小時后腹腔注射5％雞紅細胞0.1ml，30分鐘后斷頭放血，用生理鹽水沖洗腹腔，收集腹腔巨噬細胞37℃孵育半小時，離心，沉淀物涂片，染色，油鏡下計數(shù)細胞，以下列公式計算，并與對照組比較。
1.6結(jié)果結(jié)果見表6，含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物低、中、高劑量均能促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞及增加吞噬指數(shù)，聯(lián)苯雙酯150mg/kg劑量組也能促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能。
表6.含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(±SD)
**P＜0.01與模型對照組比較2.含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響2.1實驗?zāi)康挠^察含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。
2.2受試藥物名稱含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物溶劑熱雙蒸水用量0.5ml/20g小鼠2.3對照樣品聯(lián)苯雙酯；上海天平制藥廠，滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第3765號-0112.4動物小鼠，C57BL/6，♂，19～21g。
2.5其他材料刀豆球蛋白(ConA)Sigma產(chǎn)品，50μg/ml濃度3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml培養(yǎng)基RPMI-1640，內(nèi)含15％小牛血清、巰基乙醇、Hepes等2.6方法C57BL/6小鼠，隨機分為5組，即正常對照組、含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物75、150、300mg/kg、聯(lián)苯雙酯150mg/kg，每天口服給藥1次，連續(xù)7天，給藥結(jié)束后，處死動物無菌條件下取脾，計數(shù)脾細胞，并調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，在96孔細胞培養(yǎng)板上每孔加細胞懸液100μl，ConA 50μl，和培養(yǎng)液，各組均設(shè)三復(fù)管，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48小時，加入3H-TdR 0.5μci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，用多頭細胞收集器收集細胞，在液閃儀上測CPM值，并與對照組比較，結(jié)果見表7。
2.7結(jié)果表7.含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響
*P＜0.05**P＜0.01與對照組比較結(jié)果表明，含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物有明顯的促進小鼠脾淋巴細胞增殖的作用，并以低劑量作用較其它兩組強。
用實施例1、實施例2和實施例6的組合物進行試驗，得到了大致相同的試驗結(jié)果，說明這些組合物都有增強免疫力的功能。
權(quán)利要求
1.含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物在制備廣譜抗病毒藥物組合物和/或提高免疫力藥物組合物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，特征在于其中所述含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物中含有20％至98％重量比的二氫楊梅素和2％至80％重量比的楊梅素。
3.權(quán)利要求1或2的用途，特征在于其中所述組合物還含有一種或幾種選自下面的成分楊梅甙，沒食子酸和/或茶多酚。
4.權(quán)利要求3的用途，特征在于其中楊梅甙的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，沒食子酸的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，茶多酚的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％。
5.權(quán)利要求1-4任一項的用途，特征在于其中所述組合物是從蛇葡萄屬植物中提取的。
6.權(quán)利要求5的用途，特征在于其中所述蛇葡萄屬植物包括粵蛇葡萄，棟葉玉葡萄，顯齒蛇葡萄，大葉蛇葡萄，白蘞，東北蛇葡萄或山葡萄。
7.權(quán)利要求1-4任一項的用途，特征在于其中所述組合物是所述單體按照所述比例混合得到的。
8.權(quán)利要求1至7之一的用途，其中所制備的藥物所抗病毒是乙肝病毒、流感病毒和/或冠狀病毒。
9.一種廣譜抗病毒藥物組合物，特征在于其含有抗病毒有效量的含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，特征在于其中所述含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物中含有20％至98％重量比的二氫楊梅素和2％至80％重量比的楊梅素。
11.權(quán)利要求9或10的組合物，特征在于其中所述組合物還含有一種或幾種選自下面的成分楊梅甙，沒食子酸和/或茶多酚。
12.權(quán)利要求11的組合物，特征在于其中楊梅甙的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，沒食子酸的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％，茶多酚的含量是二氫楊梅素和楊梅素總重量的0-50wt％。
13.權(quán)利要求9至12之一的組合物，其中所述抗病毒是抗乙肝病毒、流感病毒和/或冠狀病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物在制備廣譜抗病毒藥物和制備提高免疫力藥物中的用途，其中所述含有二氫楊梅索和楊梅素的組合物中二氫楊梅素含量是20％至98％重量比，楊梅素含量是2％至80％重量比，所述藥物組合物所抗病毒是乙肝病毒、流感病毒和/或冠狀病毒。
文檔編號A61K31/353GK1605335SQ03123879
公開日2005年4月13日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者任啟生, 宋新榮 申請人:任啟生, 宋新榮