專利名稱：具有抗流感病毒的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及系列的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，特別是涉及對流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病有治療和預防作用的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，以及用人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸治療和預防由流感病毒引起的人流感等呼吸道感染技術方法和技術設想。
背景技術：
流感病毒是引起人流感的病原體。在1918-1919年，全世界有兩千萬人死于流感病毒的流行(Patterson，K.D.& Pyle，G.F.(1991)Bull.Hist.Med.65，4-213)。流感病毒如此猛烈和和難于控制與其本身下述特點密切相關(1)在空氣傳播；(2)不斷變化抗原性(antigenic drift)逃逸已形成的保護性免疫(Parvin， J.D.，Moscona，A.，(1986)J.Virol.59，377-383；Webster，R.G.，(1982)Nature 296，115-121)(3)通過不同株流感病毒RNA可在同一感染細胞內(nèi)交互重組周期性產(chǎn)生新的突變體(Webster，R.G.，(1992)Microbiol.Rev.56，152-179)。
接種疫苗和應用抗病毒藥物是防治流感病毒的兩類主要方法(Bridges，C.B.，F(xiàn)ukuda，K.，Cox，N.J.& Singleton，J.A.(2001)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.50，1-44)，但事實證明，這兩類方法均不能有效地控制流感的流行(Webby，R.J.& Webster，R.G.(2001)Philos.Trans.R.Soc.London 356，1817-1828)。在易感人群，接種疫苗的短期(半年)保護率約為39％(Fukuda，K.，N.J.(1999)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.48，1-28，Castle，S.C.(2000)Clin.Infect.Dis.31，578-585)。由于流感病毒抗原[血細胞凝集素(HA)和神經(jīng)酰胺酶(NA)]性不斷變化，現(xiàn)行的疫苗幾乎每年都要重新改構。由于副作用較大和新的抗藥流感病毒株不斷出現(xiàn)，一些獲準抗流感病毒藥物的效果也不理想(Luscher-Mattli，M.(2000)Arch.Virol.145，2233-2248)。
近年來的研究表明，多種具有CpG結(jié)構的細菌和病毒DNA對人的免疫系統(tǒng)均為危險的信號，可激活多種免疫細胞啟動機體的抗病毒機制。CpG是由胞嘧啶和鳥嘌呤通過磷酸連接成的二核苷酸，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，p代表磷酸。進一步的研究表明，含CpG的人工合成的脫氧核糖核酸寡核苷酸(CpG ODN)也可激活多種免疫細胞啟動機體的抗病毒機制。
在小鼠和豚鼠陰道應用CpG ODN可提高小鼠抵御致死量HSV-2病毒攻擊的能力(Richard B.Pyles et al.Journal of Virology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11387-11396)。給小鼠應用CpG ODN可減少其呼吸道合胞病毒(RSV)的荷量(Cho JY，et al.JAllergy Clin Immunol 2001 Nov；108(5)697-702)。給感染弗蘭德病毒(一種鼠類白血病病毒)的小鼠應用CpG ODN可明顯減低小鼠血中的病毒載量(Anke R.M.Olbrich，et al.Journal ofVirology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11397-11404)。給正常C57BL/6小鼠于病毒攻擊前2天靜脈注射CpG ODN，然后用正常致死量的單純皰疹病毒2型(HSV-2)靜脈攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpG ODN可使小鼠陰道分泌物中病毒滴度明顯降低并刺激生殖道粘膜快速產(chǎn)生的IFN-γ、IL-12和IL-18等保護性細胞因子(Harandi AM，et al.J Virol 2003；77(2)953)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供系列人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸特別是對可刺激人外周血細胞產(chǎn)生抗流感病毒的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。它們由含一個或多個CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構成，其磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。優(yōu)選地，本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-5所示的序列。
本發(fā)明的目的之二是提供本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用。
本發(fā)明的目的之三是提供本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸對流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的治療和預防的作用。
本發(fā)明的目的之四是提供用人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸治療和預防由流感病毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的技術方法和設想。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎上，本發(fā)明的其它具有實質(zhì)性特點的方面和創(chuàng)造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是可以直接推知的。
具體實施例方式
在本發(fā)明的上下文中，所使用的術語除非另外說明，一般具有本領域的普通技術人員通常理解的含義。特別地，下列術語具有如下的含義優(yōu)選地，本發(fā)明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有如下所示的序列DVAX-15’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’DVAX-35’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’DVAX-45’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’DVAX-55′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′DVAX-65′-ggATCgATCgATCgATgggggg-3′其中的磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本發(fā)明的CpG單鏈脫氧核苷酸可通過已知的方法生產(chǎn)，例如采用固相亞磷酰胺三酯法進行生產(chǎn)。以下的實施例詳細地例舉了一種生產(chǎn)本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的方法。
在預防和治療由SARS病毒感染引起的人流感等呼吸道的傳染性疾病時，這些人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的一次用藥劑量為1-5000微克。
本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的使用方式包括單獨應用、兩種或兩種以上聯(lián)合應用、與治療或預防流感病毒引發(fā)的感染性疾病的藥物或疫苗混合使用、與治療和預防由流感病毒感染病毒引起的感染性疾病的藥物或疫苗通過交聯(lián)劑共價偶聯(lián)使用。
應用方式包括粘膜(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)表面應用，滴眼，皮下、肌肉注射應用，胃腸應用，腹腔應用，靜脈注射等常用的方式應用。
下面結(jié)合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照附圖
進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法，例如合成采用固相亞磷酰胺三酯法。在如下實施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標明一次。在其后所用相同試劑如無特殊說明，不再贅述上述內(nèi)容。實施例1人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的制備采用固相亞磷酰胺三酯法合成人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。
1、試劑和材料三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化劑、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四種核苷酸單體、ABI DNA合成儀、高效液相色譜層析儀等2、方法脫保護基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脫去連結(jié)在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保護基團二甲氧基三苯甲基(DMT)，獲得游離的5′-羥基端，以供下一步縮合反應。
活化將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3′-端已被活化，但5′-端仍受DMT保護)，此中間體將與可控多孔玻璃上的已脫保護基的核苷酸發(fā)生縮合反應。
連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到可控多孔玻璃上已脫保護基的核苷酸時，將與其5′-羥基發(fā)生親合反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。
封閉縮合反應后為了防止連在可控多孔玻璃上的未參與反應的5′-羥基在隨后的循環(huán)反應中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
氧化縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在可控多孔玻璃上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到可控多孔玻璃的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5′-羥基上的保護基團DMT后，重復以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到一DNA片段粗品。最后對其進行切割、脫保護基(一般對A、C堿基采用苯甲?；Ｗo；G堿基用異丁?；Ｗo；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護)、純化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實驗要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG單鏈脫氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成儀上合成；全硫化及部分硫化CpG單鏈脫氧寡核苷酸的合成采用置換法，在ABI 394 DNA合成儀上合成。
實施例2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用1、人外周血單個核細胞的分離儀器設備和器材低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養(yǎng)瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規(guī)格的吸管、加樣器、滴管、血球計數(shù)板、水平式離心機等。
試劑和材料肝素抗凝的人全血來自兩個正常獻血員。
長春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎國生物技術有限公司。
IMDM培養(yǎng)液1000ml含慶大霉素10萬單位。0.22微米的濾膜抽濾除菌、分裝。方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分層液分離人外周血的單個核細胞。分層液與肝素抗凝外周血的體積比約為2∶1。水平離心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含單個核細胞的液帶，置入另離心管中。加入等體積的無血清培養(yǎng)基。1,000g離心15min，棄上清。重復洗滌兩次。棄上清，用2ml培養(yǎng)基重懸細胞。計細胞數(shù)。
2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸抗流感病毒作用的測定用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液調(diào)人外周血單個核細胞的終濃度為3×106個/毫升。加此細胞懸液于12孔培養(yǎng)板，每孔2ml。加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸(6.25μg/ml)。
設DVAX-1對照加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸(5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’)；培養(yǎng)液對照不加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。37℃，5％二氧化碳孵箱培養(yǎng)48小時，收集上清，檢測其抗流感病毒的活性。
用5％胎牛血清IMDM調(diào)節(jié)生長狀態(tài)良好的Vero細胞(ATCC)濃度至3×105個/ml。將細胞接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100μl。將含CpG單鏈脫氧寡核苷酸CpG刺激上清用5％胎牛血清IMDM稀釋10倍后，加樣，每孔加入100μl(此時，每孔體積200μl，即100μl細胞懸液+100μl稀釋后的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸CpG刺激人上清上清或?qū)φ丈锨?。設干擾素對照，流感病毒對照和正常Vero細胞對照。37℃ 5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時。吸棄上清，每孔加入2％FBS IMDM稀釋的流感病毒液(長春生物制品研究所)200μl，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。待病毒對照孔細胞80-100％發(fā)生病變，而細胞對照孔細胞狀態(tài)良好時，終止培養(yǎng)，用結(jié)晶紫染色的方法判定細胞病變的程度。吸棄培養(yǎng)液。每孔加200μl 0.5％結(jié)晶紫染液，37℃，15分鐘。流水沖掉結(jié)晶紫染液。0.5％結(jié)晶紫染液結(jié)晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50毫升無水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸餾水。照相記錄結(jié)果。按圖-1所示加樣，結(jié)晶紫染色后的結(jié)果見圖2。
圖-1、96孔板加樣表注釋DVAX-1對照人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，其序列為5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’培養(yǎng)液對照未加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的培養(yǎng)上清正常Vero細胞未加流感病毒流感病毒未加細胞培養(yǎng)上清，加流感病毒DVAX1，3，4，5，6分別代表加代號為DVAX1，3，4，5，62，3人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸IFN干擾素α，長春生物制品研究所C，D，E 1-10；F，G，H3-4為一獻血員的外周血單個核細胞誘導上清。
C，D，E 11-12；F，G，H5-12為另一獻血員的外周血單個核細胞誘導上清。
圖-2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸刺激人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清對流感病毒攻擊Vero細胞的保護作用結(jié)果表明，人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQ ID NO1-5)具有刺激人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗流感病毒物質(zhì)的作用，這些物質(zhì)對流感病毒攻擊Vero細胞具有明確的的保護作用；人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQ ID NO1-5)對流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的治療和預防的作用。
SEQUENCE LISTING<110>長春華普生物技術有限公司<120>具有抗流感病毒的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸<160>6<210>1<211>26<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>1TcgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg 26<210>2<211>20<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>2TCgTCgTTTCgTCgTTgggg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>artigicial<220>
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<210>4<211>23<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>4TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC23<210>5<211>21<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>4TCggggACgATCgTCgggggg 21<210>6<211>22<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>6ggATCgATCgATCgATgggggg 2權利要求
1.人工合成的含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們由含一個或多個CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構成。
2.按照權利要求1所述的單鏈脫氧核苷酸，它們的磷酸二酯鍵可以是非硫化的，部分硫化的，也可以是完全硫化的。
3.按照權利要求1所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們具有SEQ ID NO1-5任一所示的序列。
4.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于誘生細胞產(chǎn)生抗流感病毒物質(zhì)的用途。
5.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病。
6.用人工合成的含CpG單鏈脫氧核苷酸治療和預防由流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病的技術方法和設想。
全文摘要
本發(fā)明提供了系列的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，它們由含一個或多個CpG的脫氧寡核苷酸單鏈DNA分子構成，能夠刺激人外周血單個核細胞(PBMC)產(chǎn)生抗流感病毒的物質(zhì)，這些物質(zhì)可作用于細胞使其抵抗流感病毒的攻擊；提供了人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用和對流感病毒引起的人流感等呼吸道感染治療和預防作用。
文檔編號A61K31/7088GK1569881SQ0314615
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權日2003年7月25日
發(fā)明者王麗穎, 包木勝, 于永利 申請人:長春華普生物技術有限公司