專利名稱：甾體皂甙類化合物及制備方法和含該化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于甾體皂甙類化合物，還涉及該化合物的制備方法，以及該化合物為活性成分的藥物組合物，以及它們在治療淺表真菌和深部真菌感染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌感染是一種常見的多發(fā)病。由于近年來臨床上廣譜抗生素、化療藥物和免疫抑制劑大量應(yīng)用，艾滋病患者、放射治療的癌癥患者以及器官移植病人的增加，使真菌感染尤其是深部真菌感染大幅上升。深部真菌感染主要是機(jī)遇型致病真菌引起的，主要是白色念珠菌(Candida albicans)、絲狀真菌(filamentous fungus)、曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、隱球酵母菌(Cryptococcus)、鐮刀霉菌(Fusarium)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、組織胞漿菌(Histoplasma).根霉菌(Rhizopus)等，其中白色念珠菌是最主要的機(jī)遇型致病真菌，有研究數(shù)據(jù)表明，約有一半的腫瘤患者感染上了白色念珠菌(Andriole VT.Current and future antifungaltherapynew target for antifungal agents，J Antimicrob Chemther.1999，44151-162)。另外白色念珠菌還可以引起陰道炎、龜頭炎、鵝口瘡、灼傷病人的炎癥以及腦膜炎等疾病(GloriaMolero et al Candida albicansgenetics，dimorphism and pathogenicity.Internatl Microbio1.1998，195-106)。
目前臨床上常用的抗真菌藥物有兩大類一類干擾真菌細(xì)胞膜脂質(zhì)合成，如兩性霉素B(Amphotericin B)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(ltraconazole)和特比萘酚(terbinafin)；另一類干擾真菌核酸合成，如5-氟胞嘧啶(flucytosine)。然而，兩性霉素B由于具有腎毒性而大大限制了其應(yīng)用；氟康唑和伊曲康唑雖然毒性較小，但是它們易產(chǎn)生耐藥性而使治療指數(shù)大為降低；5-氟胞嘧啶也存在著抗菌譜窄，復(fù)發(fā)率高等問題；而特比萘酚對深部真菌感染無效。因此臨床上迫切需要開發(fā)出高效、低毒、廣譜的新型抗真菌藥物(。目前普遍認(rèn)為最有應(yīng)用前景的抗真菌藥物是未經(jīng)修飾的天然產(chǎn)物及半合成的類似物。
皂甙是一類極性較強(qiáng)的大分子化合物，不容易結(jié)晶，易溶于水和醇，難溶于有機(jī)溶劑。皂甙分甾體皂甙和三萜類皂甙兩類。甾體皂甙(Steroidal saponins)是植物中一類重要的生物活性物質(zhì)，它主要有兩部分結(jié)構(gòu)組成即糖和甙元。甾體皂甙的甙元是含有27個(gè)碳原子的螺甾醇或呋甾醇。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已研究了近150種植物中的約200多種天然甾體皂甙，大多存在于單子葉植物的百合科、石蒜科和薯蕷科等植物中。常用中藥知母、天門冬、麥門冬、七葉一枝花等都含有大量甾體皂甙。對于天然甾體皂甙的生物活性及其臨床應(yīng)用研究，最早如法國申請專利，報(bào)到了薯蕷皂甙元(diosgenin)及其甙具有抗關(guān)節(jié)炎作用。前蘇聯(lián)的科研人員發(fā)現(xiàn)高加索薯蕷中的皂甙提取物有降膽固醇的作用，臨床實(shí)驗(yàn)也有證明。80年代Ravikumer等發(fā)現(xiàn)云南白藥中的薯蕷皂甙有抗癌活性。從龍舌蘭科的植物(Dracaenaafromontan)中分離出的新甾體皂甙(afromontoside)具有抑制KB細(xì)胞的活性。另外，美國Pfizer制藥公司用替告皂甙元(tigogenin)和?？略磉霸?Hecogenin)為甾體母核所合成的纖維雙糖甙有很強(qiáng)的降血脂作用。我國也有很多有關(guān)甾體皂甙生物活性的報(bào)道。例如，從重樓屬植物中分離出的甾體皂甙，具有止血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及對心血管系統(tǒng)的作用。從叉蕊薯蕷(dioscorea colletti)中分離得到的叉蕊皂甙II有很明顯的降膽固醇活性。從穿龍薯蕷(D.nipponica)中分得的薯蕷皂甙(dioscin)有明顯的止咳、祛痰、平喘活性(丁怡，天然甾體皂甙的研究進(jìn)展，中國新藥雜志2000年第9卷第8期，p521-524)。
甾體皂甙類化合物的抗真菌活性在國外已有研究報(bào)道，如美國專利6,310,091(DeLucca，II，et al October 30，2001)表明一種來源于胡椒中的新的甾體皂甙化合物CAY-1對植物、動(dòng)物和人的不同種類的真菌感染尤其是對曲霉屬真菌(Aspergillus spp.)、白色念珠菌(Candida albicans)、卡氏肺囊蟲(Pneumocustis carinii)等具有良好的抗真菌活性，而且對哺乳動(dòng)物細(xì)胞并無毒性。這種名為CAY-1甾體皂甙化合物的分子量(mol wt)是1243.35Da，其分子結(jié)構(gòu)是由一個(gè)半乳糖和四個(gè)葡萄糖所連接成的糖甙，再與甾醇連接而成，即這種甾體皂甙化合物CAY-I是由五個(gè)糖所組成。CAY-I對白色念珠菌ATCC90028的IC90是6.2microM，相當(dāng)于7.7μg/ml，(De Lucca AJ，et al.Med Mycol.2002 Apr；40(2)131-7)，不過白色念珠菌的菌液起始濃度比較低，只有104conida/ml，培養(yǎng)條件是在30℃培養(yǎng)7.5個(gè)小時(shí)(unitedstates patent 6,310,091，De Lucca，et al)。CAY-I的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示 Fig.1 Structure of CAY-1.
其殺菌機(jī)理是破壞真菌細(xì)胞壁(Renault S，et al.Med Mycol.2003 Feb；41(1)75-81)。還有報(bào)道從仙客來植物塊莖所得的皂角苷(Calis，I.et al.，Planta Med.1997，63166-170)可抑制多種念珠菌和隱球酵母菌的生長。(Favel，A.et al.，Planta Med.1994，6050-53中的研究表明三萜類皂甙對多種病原真菌如腳癬菌、猩紅發(fā)癬菌等具有廣泛的抑菌活性。然而，并非所有的皂甙都具有抗真菌的活性，例如從蔥球莖所得的八種皂甙只有四種能抑制鏈孢菌的生(Carotenuto，A.et al.，Phytochem.，1999，511077-1082)，另一方面，目前也發(fā)現(xiàn)部分皂甙化合物對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較大，如Seo Y等從阿拉伯樹膠分離鑒定出的六種皂甙化合物就有四種對哺乳動(dòng)物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性(Seo Y.et al.J Nat Prod.2002 Feb；65(2)170-4)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類新的具有抗真菌活性的甾體皂甙類化合物，這種甾體皂甙類化合物具有高效低毒的廣譜抗真菌作用，尤其適合于深部真菌感染的治療。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種從叉蕊薯蕷中提取這類甾體皂甙類化合物的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療由白色念珠菌等引起的淺表真菌感染和深部真菌感染的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供上述化合物和組合物在制備淺表真菌感染和深部真菌感染的藥物方面的用途。
為了達(dá)到上述目的，對已分離鑒定好的三種甾體皂甙類化合物進(jìn)行了抗真菌活性研究，發(fā)現(xiàn)了從叉蕊薯蕷中分離出的兩種叉蕊皂甙化合物的抗真菌活性明顯由優(yōu)于CAY-I，從而完成了本發(fā)明，另一種從東一號劍麻汁發(fā)酵液分離出的甾體皂甙化合物因其抗真菌活性并不優(yōu)于CAY-I，所以它僅作本發(fā)明的參考。
本發(fā)明提供的藥物組合物，甾體皂甙化合物作為有效成份，并含有常規(guī)藥用載體在制備抗真菌藥品中的應(yīng)用。
下列通式(I) 其中R1由三糖所組成的直糖鏈或支鏈糖鏈，
當(dāng) 時(shí)，這種甾體皂甙化合物名為Collettinside B，又稱為叉蕊皂甙III。其具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示
當(dāng) 時(shí)，這種甾體皂甙化合物名為CollettinsideA，又稱為叉蕊皂甙IV。其具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示
為了完成本發(fā)明，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一本發(fā)明的兩種叉蕊皂甙化合物按以下方法制備分離(薯蕷屬植物化學(xué)成分的研究II.叉蕊薯蕷中甾體皂甙的分離和鑒定。劉承來等，藥學(xué)學(xué)報(bào)18(8)597～606，1983.)。
(1)叉蕊薯蕷根莖干粗粉60kg用75％的乙醇360L回流2h，過濾，提取液減壓濃縮成稀浸膏，加水30L攪勻放置4h，離心，水液用正丁醇萃取二次(每次80L，放置3h)，正丁醇液減壓濃縮得總皂甙3kg，薄層(展開劑氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)檢查，可見13個(gè)斑點(diǎn)，其中4個(gè)含量較多。見圖4。
(2)取總皂甙100g用3kg硅膠干柱層析(柱床150×7cm，展開劑氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5，顯色劑25％的磷鉬酸乙醇溶液)，展開后柱床切成25分，分別用熱乙醇洗脫。薄層(展開劑氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)檢查6～13分為Collettinside B(又稱叉蕊皂甙III)和Collettinside A(又稱叉蕊皂甙IV)。
(3)取Collettinside B(又稱叉蕊皂甙III)和Collettinside A(又稱叉蕊皂甙IV)混合皂甙4g，用200g硅膠干柱層析(展開劑氯仿-甲醇-水7∶3∶0.3)，展開后將柱床切成12分，熱乙醇洗脫后薄層(展開劑氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)檢查，4～7分為CollettinsideA(又稱叉蕊皂甙IV)，9～11分為Collettinside B(又稱叉蕊皂甙III)，回收溶劑，95％乙醇重結(jié)晶后分別得Collettinside A 200mg，Collettinside B 300mg。薄層(展開劑①氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5，②氯仿-甲醇-水7∶3∶0.3，③二氯甲烷-甲醇9∶1)均為單一色點(diǎn)。
二本發(fā)明的甾體皂甙類化合物的來源、理化常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)叉蕊皂甙III它的另一個(gè)分子名稱(Mol Name)為Collettinside B.來源(Source)叉蕊薯蕷(Dioscorea collettii Hook.f.)的根莖，Appearance白色粉末，化學(xué)分子式是C45H72O16，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為3-O-{α-L-鼠李吡喃糖(1→4)-[α-L-鼠李吡喃糖(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖}-約莫皂甙元(3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-βL-D-glucopranosyl}-yamogenin)，分子量(mol wt)是869.0660 Da，熔點(diǎn)Mp290～292℃，[α]20D-121.3°(C＝0.61，吡啶)，紅外光譜(KBr)Vmax＝3400，1040，982，915＞898，830cm-1；它的乙酸脂電子轟擊質(zhì)譜m/z 792、519、413、396、282和273。(薯蕷屬植物化學(xué)成分的研究II.叉蕊薯蕷中甾體皂甙的分離和鑒定。劉承來等，藥學(xué)學(xué)報(bào)18(8)597～606，1983.)。
叉蕊皂甙IV它的另一個(gè)分子名稱(Mol Name)為Collettinside A.也來源(Source)于叉蕊薯蕷根莖(Dioscorea collettii Hook.f.)，Appearance白色無定形固體(Amorphous solid)，化學(xué)分子式是C45H72O17，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為3-O-{β-D-葡萄吡喃糖(1→3)-[α-L-鼠李吡喃糖(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖}-約莫皂甙元(3-O-{β-D-glucopranosyl(1→3)-[α-L-rhamnopyranos yl(1→2)]-β-D-glucopranosyl}-yamogenin)，分子量(mol wt)是885.0654 Da，熔點(diǎn)Mp284～285℃，[α]20D-91.5°(C＝0.40，吡啶)，紅外光譜(KBr)Vmax＝3380，1040，980，910＞890，830cm-1；它的乙酸脂電子轟擊質(zhì)譜m/z 849、519、413、396、331、282和273。(薯蕷屬植物化學(xué)成分的研究II.叉蕊薯蕷中甾體皂甙的分離和鑒定。劉承來等，藥學(xué)學(xué)報(bào)18(8)597～606，1983.)。
三東一號劍麻汁殘?jiān)l(fā)酵液中甾體皂甙的分離提取(Two new steroidal saponins from driedfermented residues of leaf-iuices of Agave sisalans forma Dong No.1，Ding Y.et al.ChemPharm Bull(Tokyo).1993 Mar；41(3)557-60.)。
(1)干燥的東一號劍麻汁發(fā)酵殘?jiān)?Kg用汽油在60-80℃溫度下回流后，再將不溶于汽油的殘?jiān)眉状驾腿〕樘?，甲醇抽提物?jīng)減壓蒸發(fā)得774g殘?jiān)?br> (2)再將殘?jiān)?00-200網(wǎng)眼得柱層析、氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)硅膠干柱層析，氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)薄層層析得到幾個(gè)片斷。
(3)將高極性的片斷重復(fù)以上步驟后，用甲醇結(jié)晶得五種甾體皂甙化合物110mg皂甙化合物1(dongnoside E)，1.25g皂甙化合物2(dongnoside D)，186mg皂甙化合物3(dongnoside C)，1.3g皂甙化合物4(dongnoside B)，3.6g皂甙化合物5(dongnosideA)。
四Dongnoside A的來源、理化常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)Dongnoside A.來源(Source)東一號劍麻汁發(fā)酵液(Agave sisalana Dong No.1)，Apperance白色粉末(white powder)，化學(xué)分子式是C62H102O31，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為替告皂甙元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-[β-D-木吡喃糖(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖(1→3)]-β-D-葡萄吡喃糖(1→4)-β-D-半乳吡喃糖苷(tigogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopranosyl(1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→3)-β-D-glucopranosyl(1→3)]-β-D-glucopranosyl(1→4)-β-D-galacto pyranosid).分子量(mol wt)是1343.4856 Da，熔點(diǎn)Mp265～270℃，[α]D-51.5°(C＝0.07，吡啶)，紅外光譜(KBr)Vmax＝3450-3470，1060-1080，985，920＜900，865，815cm-1；negative FAB-MSm/z 1341、1209、1195、1047、1033、901、739、577、413。(Two new steroidal saponins from dried fermented residues of leaf-juices of Agavesisalans forma Dong No.1，Ding Y，et al.Chem Pharm Bull(Tokyo).1993 Mar；41(3)557-60.)。其中Dongnoside A(又稱劍麻皂甙A)化學(xué)結(jié)構(gòu)為
五通過下面的試驗(yàn)說明本發(fā)明的甾體皂甙化合物的抗真菌活性。
檢測樣品將本發(fā)明的叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV，以及DongnosideA三種甾體皂甙化合物溶解于二甲亞砜(DMSO)，濃度為1mg/ml。再將三種甾體皂甙化合物用0.9％的生理鹽水稀釋至100μg/ml。
試驗(yàn)真菌白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1(由加拿大的Montreal university的G.Lemay教授惠贈(zèng))(啤酒酵母a161 I°II°，由武漢大學(xué)張翼老師提供。
白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1是在YPD培養(yǎng)基(酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)上培養(yǎng)，啤酒酵母a161 I°II°是在YPAD培養(yǎng)基(酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.004％)上培養(yǎng)，這三種菌株都在30℃培養(yǎng)。
試驗(yàn)方法從平板中挑取這三種菌株的單菌落，轉(zhuǎn)到分別含有YPD和YPAD培養(yǎng)液的三角瓶中，在200r/min的搖床上于30℃過夜培養(yǎng)13個(gè)小時(shí)后，測三種菌株在OD580nm值，將三種菌液的起始OD580nm值用新鮮的相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋。于96孔板中，加入以上100μg/ml的三種甾體皂甙類化合物各10μl，和稀釋后的三種真菌菌液90μl，每個(gè)孔共加入100μl，使三種菌液在每個(gè)孔的起始OD580nm值均為0.1時(shí)(大約106cfu/ml)，三種甾體皂甙類藥物的最終濃度則是10μg/ml，并設(shè)不加藥物的空白對照(即90μl菌液+10μl生理鹽水)。于溫度為30℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)六個(gè)小時(shí)后，測它們的OD580nm值，通過以下公式計(jì)算其抑菌效率 其中B3表示空白(不加藥物的菌液)在培養(yǎng)終點(diǎn)的OD580nm值，B1表示空白在培養(yǎng)起點(diǎn)的OD580nm值；而S3表示含10μg/ml藥物的菌液在培養(yǎng)終點(diǎn)的OD580nm值，相應(yīng)地，S1表示它在培養(yǎng)起點(diǎn)的OD580nm值。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種甾體皂甙類化合物對三種真均有抑菌效果。
表1甾體皂甙類化合物在10μg/ml的濃度時(shí)，對三種真菌(起始菌液濃度的OD580nm值為0.1，大約106cfu/ml)的抑菌效率表。

Dongnoside A的結(jié)構(gòu)與CAY-I的化學(xué)結(jié)構(gòu)很相近，區(qū)別在于Dongnoside A的替高皂甙元的2位碳原子上是兩個(gè)氫原子，不同于CAY-I的甾體皂甙元的2位碳原子上含一個(gè)羥基和氫原子，Dongnoside A含六個(gè)糖連，CAY-I五個(gè)糖連，Dongnoside A的分子量為1343道爾頓，CAY-I的分子量為1243道爾頓。所以推測CAY-I的抑菌活性比Dongnoside A可能略強(qiáng)一些。所以Dongnoside A不納入本發(fā)明的申請范圍之內(nèi)，僅作參考。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供，這兩個(gè)叉蕊皂甙類化合物(叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV)具有毒副作用小的特點(diǎn)，尤其適合治療由白色念珠菌引起的淺表真菌感染如鵝口瘡、陰道炎、龜頭炎、灼傷病人傷口感染等，和系統(tǒng)性深部真菌感染如艾滋病人、器官移植病人、化療病人等的白色念珠菌感染。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn)1這類叉蕊皂甙類化合物的分子量(分別為869道爾頓和885道爾頓)小于美國專利中的抗真菌甾體皂甙化合物CAY-I(它的分子量為1243道爾頓)，因此更易于真菌感染病人的吸收。
2最主要的是，這類叉蕊皂甙類化合物的抗真菌性能優(yōu)于CAY-I。
3這類叉蕊皂甙類化合物來源于在我國具有悠久入藥歷史的叉蕊薯蕷，因此也具有毒副作用小的特點(diǎn)，更適合于系統(tǒng)性深部真菌感染的治療；CAY-I來源于胡椒。
4本發(fā)明的叉蕊皂甙類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與CAY存在一定的差異，無論是其皂甙元結(jié)構(gòu)還是糖鏈結(jié)構(gòu)。


圖1表示Collettinside B(又稱叉蕊皂甙III)在濃度分別為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml時(shí)，對白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。
圖2表示Collettinside A(又稱叉蕊皂甙IV)在濃度分別為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml時(shí)，對白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。
圖3表示Dongnoside A在濃度分別為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml時(shí)，對白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。
在圖1、圖2、圖3這三個(gè)圖中，它們的縱坐標(biāo)都表示甾體皂甙化合物對三種真菌的抑菌率(％)，橫坐標(biāo)表示甾體皂甙化合物的藥物的濃度梯度(μg/ml)。三種真菌的起始菌液濃度的OD580nm值為0.1，相當(dāng)于106cfu/ml。培養(yǎng)條件都是在溫度為30℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)六個(gè)小時(shí)。從以上三個(gè)圖中可以看出，在抗真菌效率方面Collettinside B＞Collettinside A＞Dongnoside A圖4表示叉蕊薯蕷中的總皂甙薄層層析圖譜。其中I代表叉蕊皂甙I，II代表叉蕊皂甙，III代表叉蕊皂甙III，IV代表叉蕊皂甙IV.
具體實(shí)施例方式
1本發(fā)明的兩種叉蕊皂甙(Collettinside B、Collettinside A)和CAY-I的比較抗白色念珠菌活性的比較詳細(xì)分析CAY-I和本發(fā)明的兩種叉蕊皂甙(Collettinside B、Collettinside A)對白色念珠菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)在30℃靜止培養(yǎng)7.5個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)條件下，CAY-I對白色念珠菌ATCC90028的IC90是6.2microM，相當(dāng)于7.7μg/ml，不過白色念珠菌ATCC90028的菌液起始濃度比較低，只有104cfu/ml(De Lucca AJ，et al.Med Mycol.2002 Apr；40(2)131-7)。而在本發(fā)明的抑菌實(shí)驗(yàn)中，所采用的菌液起始濃度大約是它的100倍，即106cfu/ml，但兩種叉蕊皂甙的抑菌效率依然很高。所以本發(fā)明的兩種叉蕊皂甙的抗白色念珠菌活性明顯優(yōu)于CAY-I。
結(jié)構(gòu)比較本發(fā)明的叉蕊皂甙類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與CAY存在一定的差異，表現(xiàn)在(一)，叉蕊皂甙的甾環(huán)與CAY-I的甾環(huán)不同。Collettinside B和Collettinside A這兩種叉蕊皂甙的皂甙元都是約莫皂甙元，其甾環(huán)的5位和6位C原子是C＝C雙鍵連接，而CAY-I甾環(huán)的5位和6位C原子是C-C單鍵連接；并且CAY-I甾環(huán)的2位C原子連有羥基，而叉蕊皂甙的甾環(huán)的2位C原子所連的不是羥基，而是兩個(gè)氫原子；還有叉蕊皂甙的甾環(huán)的27位的-CH3的構(gòu)象與CAY-I的甾環(huán)的27位的-CH3的構(gòu)象不同。(二)兩種叉蕊皂甙的糖甙與CAY-I的糖甙不同，本發(fā)明中兩種叉蕊皂甙的糖甙是由三個(gè)單糖組成兩種不同的糖鏈，而CAY-I是由五個(gè)糖組成的糖鏈。
2 兩種叉蕊皂甙化合物的毒副作用極小本發(fā)明的兩種甾體皂甙化合物Collettinside B(叉蕊皂甙III)和Collettinside A(叉蕊皂甙IV)都來自在我國有悠久入藥歷史的中藥叉蕊薯蕷。叉蕊薯蕷又稱粉萆薢，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已被中國藥典收入(《現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典》人民衛(wèi)生出版社，下冊)。從叉蕊薯蕷中所提的四種含約莫皂甙元的叉蕊皂甙化合物中，有藥理實(shí)驗(yàn)已證明，這四種叉蕊皂甙化合物均有消炎和降血糖活性(李雪征，萆薢的研究進(jìn)展，中國野生植物資源，2001年第21卷第5期)，并報(bào)道叉蕊皂甙II具有明顯的降膽固醇活性(丁怡，天然甾體皂甙的研究進(jìn)展，中國新藥雜志2000年第9卷第8期，p521-524)，(中國專利，1243129A)也表明其毒副作用都極小。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV具有明顯的抗真菌活性，而且叉蕊皂甙III的抗真菌活性優(yōu)于叉蕊皂甙IV。即發(fā)現(xiàn)這兩種叉蕊皂甙化合物的抗真菌新用途。因此，本發(fā)明中的甾體皂甙類化合物除了可以治療由白色念珠菌引起的表面真菌感染之外，尤其適用于由白色念珠菌引起的深部真菌感染(血液循環(huán)中的白色念珠菌感染)的治療，比如艾滋病人、器官移植病人、灼傷病人、化療病人以及進(jìn)行大量外科手術(shù)病人的白色念珠菌感染等。
3 兩種叉蕊皂甙和Dongnoside A的廣譜抗真菌實(shí)驗(yàn)從平板中挑取白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°這三種菌株的單菌落，分別于YPD和YPAD培養(yǎng)液中在200r/min的搖床上于30℃過夜培養(yǎng)13個(gè)小時(shí)后，測三種菌株在OD580nm值，將三種菌液的起始OD580nm值用新鮮的相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋，用移液槍轉(zhuǎn)移至96孔板中，并加入不同藥物濃度的叉蕊皂甙III和IV以及Dongnoside A，使三種菌液的起始濃度的OD580nm值都為0.1(大約106cfu/ml)，并設(shè)不加藥物的空白對照，在溫度為30℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)六個(gè)小時(shí)后，測它們的OD580nm值，通過以下公式計(jì)算其抑菌效率 其中B3表示空白(不加藥物的菌液)在培養(yǎng)終點(diǎn)的OD580nm值，B1表示空白在培養(yǎng)起點(diǎn)的OD580nm值；而S3表示含藥物的菌液在培養(yǎng)終點(diǎn)的OD580nm值，相應(yīng)地，S1表示它在培養(yǎng)起點(diǎn)的OD580nm值。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄并作兩種叉蕊皂甙以及Dongnoside A的量效曲線圖。結(jié)果見說明書附圖。發(fā)現(xiàn)Collettinside B和Collettinside A對三種真菌都呈現(xiàn)很強(qiáng)的抗真菌活性，而Dongnoside A的抗真菌活性一般，僅作本發(fā)明的參考。
由于白色念珠菌可以在淺表引起鵝口瘡、陰道炎、龜頭炎等，在深部可以引起腦膜炎、循環(huán)中的血液真菌感染，如艾滋病人、器官移植病人、灼傷病人、化療病人以及進(jìn)行大量外科手術(shù)病人的白色念珠菌感染等，所以本發(fā)明為這些真菌感染性疾病提供了一類新的治療藥物。
4本發(fā)明中的甾體皂甙類化合物作為抗真菌劑的應(yīng)用形式由本發(fā)明的甾體皂甙類化合物作為抗真菌藥物時(shí)，通常以與制藥載體(例如填料、疏松填料、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑或賦性劑)配制。藥物制劑可以根據(jù)感染部位和治療目的從各種給藥劑型中選擇，一般的給藥劑型包括片劑、軟膏劑、丸劑、栓劑、粉劑、膠囊、顆粒劑、粉末制劑、注射用制劑(例如溶液劑、乳劑、懸浮劑等)。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥善瑒?，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如結(jié)晶纖維素、乳糖、羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、高嶺土、碳酸鈣、淀粉等；粘合劑如水、淀粉溶液、羧甲基纖維素等；崩解劑如干燥淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉、單硬脂酸甘油脂等；濕潤劑如甘油、淀粉等；吸附劑如淀粉、乳糖等；潤滑劑如聚乙二醇、滑石等；片劑可根據(jù)需要制成糖胞衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片。
實(shí)施例1甾體皂甙類化合物50mg，結(jié)晶性纖維素50mg，乳糖50mg，羥丙基纖維素18mg，硬脂酸鎂2mg共170mg按照本領(lǐng)域已知的方法配制成片劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥绍浉鄤?，可以選用由水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、石蠟、液體石蠟、樹脂、高級醇、塑料、表面活性劑組成的疏水性基質(zhì)或親水性基質(zhì)等在內(nèi)的添加劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥赏鑴?，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如作為賦性劑的乳糖、可可脂、高嶺土、滑石等，作為粘合劑的粉末狀阿拉伯膠、明膠、乙醇等，作為崩解劑的褐藻淀粉、瓊脂等。
實(shí)施例2甾體皂甙類化合物50mg，淀粉100mg，蔗糖100mg，滑石100mg，凈化水，聚乙二醇，乙醇，羥丙基纖維素50mg按照本領(lǐng)域已知的方法配制成丸劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥伤▌?，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如聚乙二醇、可可脂、高級醇、明膠、半合成甘油酯等。
實(shí)施例3甾體皂甙類化合物50mg，淀粉50mg，硬脂酸鎂8mg，碳酸氫鈉20mg，適量約6％乙醇做濕潤劑，壓入模內(nèi)制成栓劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥赡z囊，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如乳糖、淀粉、滑石、沉淀的硅酸酐等。
實(shí)施例4甾體皂甙類化合物50mg，沉淀的硅酸酐25mg，乳糖100mg，淀粉50mg，滑石25mg共250mg按照本領(lǐng)域已知的方法配制成膠囊制劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥深w粒制劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如乳糖、玉米淀粉、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素等。
實(shí)施例5甾體皂甙類化合物50mg，乳糖600mg，玉米淀粉200mg，羧甲基纖維素鈉20mg，羥丙基纖維130mg共1000mg按照本領(lǐng)域已知的方法配制成顆粒制劑。
將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥煞勰┲苿梢詮V泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體，如乳糖、淀粉、沉淀的硅酸酐、沉淀的碳酸鈣等。
實(shí)施例6甾體皂甙類化合物50mg，沉淀的硅酸酐20mg，沉淀的碳酸鈣10mg，乳糖250mg，淀粉70mg共400mg按照本領(lǐng)域已知的方法配制成粉末制劑將給藥單元?jiǎng)┬椭瞥勺⑸渲苿?，可以廣泛使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇等，須先將溶液劑、乳劑和懸浮劑滅菌，而且這些制劑最好制備成是與血液等滲的，可以向注射用制劑中添加適量氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的溶解添加劑、緩沖劑、局部麻醉劑等。
實(shí)施例7甾體皂甙類化合物20mg，，丙二醇60mg，葡萄糖50mg，注射用蒸餾水和生理鹽水至1ml按照本領(lǐng)域已知的方法配制成注射制劑。
本發(fā)明作為抗真菌制劑時(shí)給藥方法沒有限制，可以根據(jù)具體的劑型、病人的年齡、性別和身體狀況的差異、真菌感染的部位及嚴(yán)重程度等進(jìn)行分類給藥。例如，鵝口瘡可以采用噴霧劑或口服給藥，淺表白色念珠菌感染如陰道炎可采用栓劑、軟膏劑給藥，龜頭炎等可采用軟膏劑、酊劑，而深部真菌感染可以采取片劑、丸劑、顆粒劑和膠囊等進(jìn)行口服給藥，或者用注射用制劑可以單獨(dú)(或與常規(guī)的輸液用溶液如葡萄糖、氨基酸、氯化鈉、甘油等混合)進(jìn)行靜脈血管內(nèi)給藥，也可以采取肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)給藥。
權(quán)利要求
1.一種下列通式(1)甾體皂甙類化合物 其中R1由三糖所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。
2根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種甾體皂甙化合物，其特征在于其中R1表示
3根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種甾體皂甙化合物，其特征在于其中R1也表示
4藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的甾體皂甙化合物作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。
5根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種甾體皂甙化合物在制備治療淺表真菌和深部真菌感染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的甾體皂甙類化合物，其中R1是有三糖所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，和以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及本發(fā)明化合物的藥用組合物在制備治療淺表真菌感染和深部真菌感染的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/10GK1563074SQ200410013058
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者張翼, 杜冠華, 蔣笑艷, 丁怡 申請人:武漢大學(xué), 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所