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      使用67kDa層粘連蛋白受體篩選藥物的方法和由此獲得的藥物的制作方法

      文檔序號(hào):1091586閱讀:395來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:使用67 kDa層粘連蛋白受體篩選藥物的方法和由此獲得的藥物的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種使用67kDa層粘連蛋白受體篩選藥物的方法和由此獲得的藥物。
      背景技術(shù)
      67kDa層粘連蛋白受體(以下也稱之為“67LR”)是從編碼295個(gè)氨基酸的mRNA翻譯的37kDa前體蛋白質(zhì),在細(xì)胞內(nèi)受到脂肪酸等的酰基化聚合反應(yīng)而經(jīng)由均二聚化或者雜二聚化變成67kDa的蛋白質(zhì),它與整連蛋白類一起向細(xì)胞膜表面移動(dòng)后,才能作為層粘連蛋白受體起作用(Biochemistry,1995,3411276-11287,T.H.Landowski等;J.Cell.Biochem,1998,69244-251,S.Buto等)。而且,已知37kDa前體蛋白質(zhì)作為核糖體相關(guān)蛋白質(zhì)p40參與蛋白合成,甚至與作為多藥耐藥性相關(guān)蛋白質(zhì)(MGr1-Ag)被報(bào)道的蛋白質(zhì)相同(Cell.Mol.Life Sci.,2002,591577-1583,Y.Shi等)。該層粘連蛋白受體由于在很多癌細(xì)胞上高表達(dá)的數(shù)據(jù),被認(rèn)為是作為泛腫瘤特異性移植抗原T細(xì)胞的免疫原的瘤胎抗原(Anticancer Research,1999,195535-5542,J.H.Coggin,Jr等)。盡管層粘連蛋白受體除了67LR之外還被報(bào)道10幾種,但在其中67LR與癌的關(guān)聯(lián)被強(qiáng)烈啟示。
      根據(jù)是否在癌細(xì)胞中檢測(cè)出,67LR在很多癌中作為顯示人癌患者惡性程度的重要的預(yù)后因子為人所知(Breast CancerResearch and Treatment,1998,52137-145,S.Menard等;Clinical Cancer Research,1997,3227-231,G.Fontanini等;Clinical Cancer Research,1996,21777-1780,F(xiàn).Basolo等;J.Natl.Cancer Inst,1991,8329-36,V.Cioce等),在動(dòng)物模型等中啟示67LR參與癌細(xì)胞的增殖、移動(dòng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等。例如,有報(bào)道稱,在乳癌患者中67LR陽(yáng)性的患者的生存率比67LR陰性的患者低得多。表示出盡管作為67LR的配體的層粘連蛋白的表達(dá)對(duì)預(yù)后沒(méi)有影響,但是受體67LR的表達(dá)對(duì)預(yù)后帶來(lái)負(fù)面結(jié)果(Breast Cancer Research and Treatment,1998,52137-145,S.Menard等)。
      在這些認(rèn)識(shí)下,報(bào)道了幾個(gè)期望通過(guò)抑制67LR的表達(dá)來(lái)顯示抗腫瘤效果的實(shí)驗(yàn)。報(bào)道了將67LR的反義RNA導(dǎo)入癌細(xì)胞株制造的67LR低表達(dá)細(xì)胞株,與最初的親株細(xì)胞相比,在小鼠體內(nèi)顯著引起增殖能力的降低及轉(zhuǎn)移能力的降低,其結(jié)果改善了小鼠個(gè)體的生存率(British Journal of Cancer,1999,801115-1122,K.Satoh等)。而且,報(bào)道了低67LR表達(dá)細(xì)胞株與親株相比,腫瘤血管新生降低以及作為血管新生促進(jìn)因子的VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的產(chǎn)生本身也降低(Cancer Letters,2000,153161-168,M.Tanaka等)。同樣,在使用相對(duì)于67LR的抗體的腫瘤轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)了與反義試驗(yàn)相同的效果(Jpn.J.Cancer Res.,1999,90425-431,K.Narumi等)。
      在非腫瘤相關(guān)中,對(duì)67LR的功能也有幾個(gè)報(bào)道。已有報(bào)道在缺血?jiǎng)游锬P椭斜徽T導(dǎo)的新生血管的增生被源自與67LR結(jié)合的層粘連蛋白的肽(半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸)或者源自EGF(表皮生長(zhǎng)因子)衍生的肽(半胱氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-絲氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-半胱氨酸)所抑制(Am.J.Pathol,2002,160307-313,D.Gebarowska等)。報(bào)道了被指出與被對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化相關(guān)的eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)表達(dá)和NO產(chǎn)生,被源自與67LR結(jié)合的層粘連蛋白的五肽(酪氨酸-異白氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸)所抑制(J.Biol.Chem.,1999,27415996-16002,T.Gloe等)。
      在最近的報(bào)道中,報(bào)道了67LR作為被認(rèn)為是克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病的病因的朊病毒蛋白質(zhì)的受體作用,結(jié)合朊病毒而被內(nèi)在化,并且該結(jié)合與內(nèi)在化被缺失膜域的突變體67LR的分泌所抑制(EMBO J.2001,205863-5875,S.Gauczynski等)。
      而且,報(bào)道了67LR在作為T細(xì)胞的亞型的CD45RO+/CD45RA-的記憶細(xì)胞的CD4+CD8-或CD4-CD8+的亞型群中表達(dá),啟示出67LR對(duì)免疫系統(tǒng)的作用(J.Immunol,1999,1633430-3440,S.M.Canfield等)。
      還有幾個(gè)關(guān)于67LR的mRNA表達(dá)的報(bào)道。報(bào)道了該表達(dá)被癌抑制因子p53或抗癌因子TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IFN-γ(干擾素-γ)所抑制(Biochem.Biophys.Res.Commun.,1998,251564-569,N.Clausse等)。但是,對(duì)于被推定為與這些多用途功能相關(guān)的67LR的低分子化合物尚未被報(bào)道。
      另一方面,兒茶素類中,表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,以下也稱之為“EGCG”),是占茶的兒茶素的約50%的主要作用成分。另外含有表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素(以下也分別稱之為“EGC”、“ECG”、“EC”)等。
      茶自古以來(lái)作為藥使用具有古老的歷史,近代以來(lái)得以對(duì)其功效和成分的關(guān)系進(jìn)行分析。其中EGCG是1947年被A.Bradfield等發(fā)現(xiàn)的成分(J.Chem.Soc.,1947,322249,A.E.Bradfield等)。
      作為包括EGCG的茶兒茶素類的生理作用,已報(bào)道了抗氧化、抗癌、抑制血漿膽固醇上升、抑制血壓上升、抑制血小板凝集、抑制血糖上升、預(yù)防癡呆、抗?jié)?、抗炎癥、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌、抗齲齒、抗病毒、解毒、改善腸內(nèi)菌群、除臭等(茶的功能,村松敬一郎等編輯,學(xué)會(huì)出版中心,2002)。
      其中,抗癌作用被非常多地報(bào)道,有抗突變作用、抗致癌促進(jìn)作用、抗腫瘤增殖抑制作用、抗浸潤(rùn)/轉(zhuǎn)移抑制作用、抗血管新生抑制作用。在最近的報(bào)道中,報(bào)道了EGCG抑制白血病細(xì)胞的DNA合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Int.J.Mol.Med.,2001,7645-652,D.M.Smith等),而且EG CG抑制乳癌細(xì)胞株的增殖(J.Cell.Biochem.,2001,82387-398,K.T.Kavanagh等)。并且,還報(bào)道了與正常細(xì)胞相比,EGCG強(qiáng)烈地抑制癌細(xì)胞的增殖等(Arch.Biochem.Biophys.,2000,376338-346,N.Ahmad等)。
      關(guān)于浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移,報(bào)道了在使用人工基底膜(matrigel)的浸潤(rùn)試驗(yàn)中兒茶素類抑制高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的浸潤(rùn),并且EGCG抑制癌細(xì)胞向纖粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白的粘著(Cancer Lett.,1995,9827-31,M.Suzuka等、Cell Biol.Int.,1993,17559-564,M.Isemura等;Cancer Lett.,2001,17315-20,Y.Suzuki等)。
      而且,最近報(bào)道了這些兒茶素作用的分子水平的分析。例如,EGCG濃度依賴性地抑制被啟示與癌關(guān)聯(lián)的Her-2(人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2)抗原高表達(dá)細(xì)胞的增殖。報(bào)道其作用機(jī)理是通過(guò)抑制Her-2的磷酸化,抑制其下游信號(hào)傳送(Cancer Res.,2002,62652-655,S.Pianetti等)。
      而且,報(bào)道了EGCG等兒茶素抑制與腫瘤增殖密切相關(guān)的血管新生。顯示出其機(jī)理是兒茶素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的受體VEGFR-1的磷酸化。報(bào)道這并不依賴于兒茶素的抗氧化、抗自由基活性(Cancer Res.,2002,62381-385,S.Lamy等)。
      同樣,報(bào)道了兒茶素類抑制其它生長(zhǎng)因子PDGF-BB(血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB)引起的在血管平滑肌細(xì)胞中的PDGF-Rβ(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β)的磷酸化,從而抑制血管的肥厚(FASEB J.,2002,16893-895,A.Sachinidis等)。
      另外,報(bào)道了EGCG抑制EGF(表皮生長(zhǎng)因子)-2引起的活體內(nèi)的血管新生以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(Nature,1999,389381,Y.Cao等)。盡管報(bào)道了EGCG與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Fas(脂肪酸合成酶)蛋白質(zhì)結(jié)合(Biochem.Biop hys.Res.Commun.,2001,2851102-1106,S.Hayakawa等),但是尚不清楚上述EGCG的作用是否與Fas相關(guān),但啟示了存在其他與EGCG相互作用的因子。
      兒茶素除了抗腫瘤效果之外,其各種生理作用在分子水平上變得明確。報(bào)道了EGCG抑制在肝細(xì)胞中的葡萄糖的產(chǎn)生,并且促進(jìn)胰島素受體和IRS-1(胰島素受體底物-1)的酪氨酸磷酸化,從而有抗糖尿病的作用(J.Biol.Chem.,2002,27734933-34940,M.E.Waltner-Law等)。
      而且,報(bào)道了在帕金森病模型小鼠中EGCG顯示強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用(J.Biol.Chem.,2002,27730574-30580,Y.Levites等),從這一報(bào)道期待抑制多種神經(jīng)障礙。報(bào)道了EGCG或其甲基化物抑制作為變態(tài)反應(yīng)的要因的在嗜堿粒細(xì)胞中的FcεRI(高親和力IgE受體)的表達(dá)(J.Agric.Food Chem,2002,505729-5734,Y.Fujimura等),而且EGCG抑制在軟骨中被IL-1β(白細(xì)胞介素-1β)誘導(dǎo)的COX-2(環(huán)氧化酶-2)或NO合成酶2的表達(dá)(Free Radical Biology &amp; Me dicine,2002,331097-2002,S.Ahmed等)。
      但是,就本發(fā)明人們所知,關(guān)于EGCG通過(guò)67LR作為細(xì)胞增殖抑制因子等發(fā)揮作用的事實(shí),并且可以將67LR作為靶應(yīng)用于具有細(xì)胞增殖抑制作用等的低分子化合物的藥物篩選中的事實(shí),迄今為止還沒(méi)有任何報(bào)道。
      (非專利文獻(xiàn)1)
      Biochemistry,1995,3411276-11287(非專利文獻(xiàn)2)J.Cell.Biochem.,1998,69244-251(非專利文獻(xiàn)3)Cell.Mol.Life Sci.,2002,591577-1583(非專利文獻(xiàn)4)Anticancer Research,1999,195535-5542(非專利文獻(xiàn)5)Breast Cancer Research and Treatment,1998,52137-145(非專利文獻(xiàn)6)Clinical Cancer Research,1997,3227-231(非專利文獻(xiàn)7)Clinical Cancer Research,1996,21777-1780(非專利文獻(xiàn)8)J.Natl.Cancer Inst.,1991,8329-36(非專利文獻(xiàn)9)Breast Cancer Research and Treatment,1998,52137-145(非專利文獻(xiàn)9)British Journal of Cancer,1999,801115-1122(非專利文獻(xiàn)10)Cancer Letters,2000,153161-168(非專利文獻(xiàn)11)Jpn.J.Cancer Res.,1999,90425-431(非專利文獻(xiàn)12)Am.J.Pathol.,2002,160307-313
      (非專利文獻(xiàn)13)J.Biol.Chem.,1999,27415996-16002(非專利文獻(xiàn)14)EMBO J.,2001,205863-5875(非專利文獻(xiàn)15)J.Immunol.,1999,1633430-3440(非專利文獻(xiàn)16)Biochem.Biophys.Res.Commun.,1998,251564-569(非專利文獻(xiàn)17)J.Chem.Soc.,1947,322249(非專利文獻(xiàn)18)茶的功能,村松敬一郎等編輯,學(xué)會(huì)出版中心,2002(茶の機(jī)能、村松敬一郎ら編、學(xué)會(huì)出版センタ-、2002)(非專利文獻(xiàn)19)Int.J.Mol.Med.,2001,7645-652(非專利文獻(xiàn)20)J.Cell.Biochem.,2001,82387-398(非專利文獻(xiàn)21)Arch.Biochem.Biophys.,2000,376338-346(非專利文獻(xiàn)22)Cancer Lett.,1995,9827-31(非專利文獻(xiàn)23)Cell Biol.Int.,1993,17559-564(非專利文獻(xiàn)24)Cancer Lett.,2001,17315-20(非專利文獻(xiàn)25)Cancer Res.,2002,62652-655
      (非專利文獻(xiàn)26)Cancer Res.,2002,62381-385(非專利文獻(xiàn)27)FASEB J.,2002,16893-895(非專利文獻(xiàn)28)Nature,1999,389381(非專利文獻(xiàn)29)Biochem.Biophys.Res.Commun.,2001,2851102-1106(非專利文獻(xiàn)30)J.Biol.Chem.,2002,27734933-34940(非專利文獻(xiàn)31)J.Biol.Chem.,2002,27730574-30580(非專利文獻(xiàn)32)J.Agric.Food Chem.,2002,505729-5734(非專利文獻(xiàn)33)Free Radical Biology &amp; Medicine,2002,331097-2002發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人基于上述課題進(jìn)行深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)67LR能夠作為具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)感染抑制作用的藥物的靶來(lái)使用,從而完成了本發(fā)明。
      即本發(fā)明如下所述。
      一種篩選藥物的方法,所述藥物具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用,該方法包括如下步驟定性或定量測(cè)定試驗(yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體上時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。
      如[1]所述的篩選方法,所述藥物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用的藥物。
      一種通過(guò)如[1]或[2]所述的篩選方法獲得的藥物。
      如[1]至[3]的任一項(xiàng)所述的藥物,其有效成分是帶有沒(méi)食子?;幕衔?。
      如[4]所述的藥物,所述化合物是兒茶素類。
      如[5]所述的藥物,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      如[3]至[6]的任一項(xiàng)所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      如[3]至[6]的任一項(xiàng)所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      如[8]所述的藥物,所述疾病是癌。
      一種藥物組合物的制造方法,包括由化學(xué)合成方法制備如[3]至[9]的任一項(xiàng)所述的藥物的工序,和混合藥學(xué)上可接受的載體的工序。
      由[10]所述的制造方法獲得的藥物組合物。
      一種篩選藥物的方法,包括如下步驟定性或定量測(cè)定帶有沒(méi)食子?;幕衔锖驮囼?yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度超過(guò)帶有沒(méi)食子?;幕衔锱c67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與兒茶素類所具有的藥理學(xué)作用相同作用的藥物。
      一種篩選藥物的方法,包括如下步驟使帶有沒(méi)食子?;幕衔飳?duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合與試驗(yàn)化合物對(duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)相同時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與帶有沒(méi)食子酰基的化合物所具有的藥理學(xué)作用相同作用的藥物。
      如[12]或[13]所述的篩選方法,所述帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用是細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用。
      如[12]或[13]所述的篩選方法,所述帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用是細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用。
      如[12]至[15]的任一項(xiàng)所述的篩選方法,所述化合物是帶有沒(méi)食子?;膬翰杷仡悺?br> 如[12]至[15]的任一項(xiàng)所述的篩選方法,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      由[12]至[17]的任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的藥物。
      如[18]所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      如[18]或[19]所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      如[20]所述的藥物,所述疾病是癌。
      一種藥物組合物的制造方法,包括由化學(xué)合成方法制備如[18]至[21]的任一項(xiàng)所述的藥物的工序,和混合藥學(xué)上可接受的載體的工序。
      由[22]所述的制造方法獲得的藥物組合物。
      一種化合物,是與67kDa層粘連蛋白受體結(jié)合的化合物,在與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到該67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)相同的位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合。
      如[24]所述的化合物,所述化合物是兒茶素類。
      如[26]所述的化合物,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      包含如[24]至[26]的任一項(xiàng)所述化合物的細(xì)胞增殖抑制劑。
      包含如[24]至[26]的任一項(xiàng)所述化合物的血管新生抑制劑。
      包含如[24]至[26]的任一項(xiàng)所述化合物的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制劑。
      包含如[24]至[26]的任一項(xiàng)所述化合物的抗癌劑。


      圖1是顯示實(shí)施例1的表面等離子共振傳感器測(cè)定結(jié)果的圖。
      圖2是顯示實(shí)施例1的細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
      圖3是顯示實(shí)施例1的細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
      圖4是顯示實(shí)施例2的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的圖。
      圖5是顯示實(shí)施例3的細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
      圖6是顯示實(shí)施例3的表面等離子共振傳感器測(cè)定結(jié)果的圖。
      圖7是顯示實(shí)施例4的表面等離子共振傳感器測(cè)定結(jié)果的圖。
      圖8是顯示實(shí)施例4的細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果的圖。
      具體實(shí)施例方式
      下面詳細(xì)地描述本發(fā)明。
      本發(fā)明提供一種以67LR作為靶的篩選藥物的新方法。
      作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式,可以列舉一種篩選藥物的方法,所述藥物具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用,該方法包括如下步驟定性或定量測(cè)定試驗(yàn)化合物與67LR的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67LR上時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。
      本發(fā)明中使用的67LR是其本身公知的蛋白質(zhì),例如,基于GenBank Accession No.NM_002295登記cDNA序列,按照常規(guī)方法將各種庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))以加入編碼該蛋白質(zhì)的序列,可以容易地獲得67LR的cDNA。而且,以能夠表達(dá)蛋白的形式將這樣獲得的cDNA插入市售的各種載體(vector)中,從而可以容易地構(gòu)建表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞株及獲得該蛋白質(zhì)本體。除此之外還有幾個(gè)cDNA取得和蛋白質(zhì)表達(dá)的報(bào)道(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,856394,H.You等;BritishJournal of Cancer,1999,801115-1122,K.Satoh等;Biochemistry,1995,3411276-11287,T.H.Landowski等)。
      另外,67LR作為基因是37kDa的40S核糖體結(jié)合蛋白質(zhì),但是已知在膜上表達(dá)時(shí)變成67kDa。在本發(fā)明中,只要是在膜上表達(dá)時(shí)變成67kDa的蛋白質(zhì),且具有與層粘連蛋白結(jié)合的粘附性的蛋白質(zhì),都定義為本發(fā)明中的67LR,不僅可以是完整的蛋白質(zhì),也可以使用其部分肽。而且,根據(jù)篩選手段,67LR例如可以作為精制的蛋白質(zhì)、作為可溶性蛋白質(zhì)、作為結(jié)合于載體上的形態(tài)、以及作為與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì),適當(dāng)?shù)厥褂谩?br> 在本發(fā)明中,通過(guò)將試驗(yàn)化合物與67LR結(jié)合,篩選具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。這時(shí),作為試驗(yàn)化合物的形態(tài),只要是細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、發(fā)酵微生物產(chǎn)生物、生物提取物、植物提取物、精制或粗精制蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成低分子化合物、天然化合物、基因文庫(kù)等通常藥物篩選中所使用的形態(tài)就可以,而沒(méi)有特別的限制。
      試驗(yàn)化合物與67LR的結(jié)合,可以根據(jù)試驗(yàn)化合物的形態(tài)選擇適當(dāng)?shù)氖侄?,例如可以用將試?yàn)化合物添加到67LR表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液中的方法等進(jìn)行。
      如上所述地處理,測(cè)定試驗(yàn)化合物與67LR的結(jié)合程度,這里使用的測(cè)定方法可以采用定性手段和定量手段的任意一種。作為測(cè)定結(jié)合程度的手段的一個(gè)例子,可以列舉如后述的實(shí)施例中所示的使用表面等離子共振傳感器的方法。
      這樣測(cè)定結(jié)合程度的結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物實(shí)質(zhì)上結(jié)合到67LR上時(shí),就可判定該試驗(yàn)化合物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。特別是,本發(fā)明的篩選方法適合用于篩選具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用的藥物。
      如后述的實(shí)施例中所示,被啟示具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的帶有沒(méi)食子酰基的化合物,結(jié)合到67LR上,顯著地抑制其細(xì)胞增殖。
      上述事實(shí)啟示帶有沒(méi)食子酰基的化合物通過(guò)67LR作為細(xì)胞增殖因子發(fā)揮作用,進(jìn)一步,可以認(rèn)為與帶有沒(méi)食子?;幕衔锵嗤亟Y(jié)合到67LR上的物質(zhì),具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锵嗤淖饔茫?,細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用。
      因此,在本發(fā)明的篩選方法中,與67LR結(jié)合的試驗(yàn)化合物,可以判定為具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。
      另外,作為上述舉出的帶有沒(méi)食子?;幕衔?,可以列舉表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯及其3-甲基取代的衍生物,或表兒茶素沒(méi)食子酸酯等帶有沒(méi)食子?;膬翰杷仡?;帶有沒(méi)食子?;亩喾宇悾蝗龥](méi)食子?;咸烟恰⑽鍥](méi)食子?;咸烟恰⑿∧韭辄S素、鄰苯三酚等,優(yōu)選可以舉出表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      接下來(lái)描述本發(fā)明的篩選方法的其它實(shí)施方式。
      作為本發(fā)明中的其它實(shí)施方式,提供了一種篩選藥物的方法,包括加入到67LR中,再使用帶有沒(méi)食子?;幕衔铩<?,可以列舉一種篩選藥物的方法,包括如下步驟定性或定量測(cè)定帶有沒(méi)食子?;幕衔锖驮囼?yàn)化合物與67LR的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物與67LR的結(jié)合程度超過(guò)帶有沒(méi)食子酰基的化合物與67LR的結(jié)合程度時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用相同作用的藥物。
      另外,可以列舉一種篩選藥物的方法,包括如下步驟使帶有沒(méi)食子?;幕衔飳?duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合與試驗(yàn)化合物對(duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)相同時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用相同作用的藥物。
      如后述的實(shí)施例中所示,67LR的單克隆抗體抑制帶有沒(méi)食子?;幕衔飳?duì)67LR的結(jié)合,其結(jié)果抑制了帶有沒(méi)食子酰基的化合物的細(xì)胞增殖抑制效果。相反,帶有沒(méi)食子酰基的化合物抑制抗67LR抗體對(duì)67LR的結(jié)合。即,帶有沒(méi)食子酰基的化合物的結(jié)合位點(diǎn)與抗體識(shí)別位點(diǎn)重疊。由此,通過(guò)將帶有沒(méi)食子?;幕衔锖驮囼?yàn)化合物提供到對(duì)67LR的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到與帶有沒(méi)食子酰基的化合物相同的位點(diǎn)時(shí),可以認(rèn)為該試驗(yàn)化合物具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械淖饔孟嗤淖饔谩?br> 前面描述了作為本發(fā)明的其它實(shí)施方式的不使用帶有沒(méi)食子?;幕衔锏暮Y選方法的詳細(xì)說(shuō)明,但是這些記載也適用于使用帶有沒(méi)食子?;幕衔锏谋景l(fā)明的實(shí)施方式的情況。而且,這里所說(shuō)的本發(fā)明的實(shí)施方式中提供到篩選的帶有沒(méi)食子?;幕衔铮缛绾笫龅膶?shí)施例所示可以用PBS等緩沖液適當(dāng)稀釋而使用。另外,將試驗(yàn)化合物和帶有沒(méi)食子?;幕衔锾砑拥?7LR表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液中以引起它們的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí),試驗(yàn)化合物和帶有沒(méi)食子?;幕衔锏奶砑禹樞驔](méi)有特別的限制。
      如上所述地被篩選的藥物,可以用作通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病的藥物。這些疾病中,作為本發(fā)明中最合適的疾病可以列舉癌。
      另外,在本發(fā)明中,一旦藥物通過(guò)篩選被選擇之后,該藥物可以通過(guò)常規(guī)的化學(xué)合成方法等制造。另外,也可以混合藥學(xué)上可接受的載體。即,在本發(fā)明中,其要旨還包括一種藥物組合物的制造方法,以及通過(guò)該制造方法獲得的藥物組合物,所述制造方法包括由化學(xué)合成方法制備通過(guò)如上所述的篩選方法獲得的藥物的工序,和混合藥學(xué)上可接受的載體的工序。
      在作為醫(yī)藥組合物使用的情況下,作為藥學(xué)上可接受的載體,例如可以列舉生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等,可以將它們與藥物適當(dāng)組合經(jīng)制劑化而提供。而且,對(duì)患者給藥,例如除動(dòng)脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射等之外,還可以口服,可根據(jù)藥物或根據(jù)患者的體重或年齡、癥狀等適當(dāng)選擇。同樣,給藥量也可以根據(jù)藥物或根據(jù)患者的體重或年齡、癥狀等選擇適當(dāng)?shù)慕o藥量。另外,如果試驗(yàn)化合物是通過(guò)DNA編碼獲得的,那么也可以將該DNA編入到基因治療用載體中,進(jìn)行基因治療。
      在本發(fā)明中,其要旨還包括這樣一種化合物,它是與67LR結(jié)合的化合物,其在與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到該67LR的位點(diǎn)相同的位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合。這些如后述實(shí)施例中所示,被如下事實(shí)所充分證實(shí)67LR的單克隆抗體抑制帶有沒(méi)食子?;幕衔飳?duì)67LR的結(jié)合,其結(jié)果抑制帶有沒(méi)食子?;幕衔锏募?xì)胞增殖抑制效果;相反,帶有沒(méi)食子酰基的化合物抑制抗67LR抗體對(duì)67LR的結(jié)合;即,帶有沒(méi)食子?;幕衔锏慕Y(jié)合位點(diǎn)與抗體識(shí)別位點(diǎn)重疊。這些化合物,由于認(rèn)為具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械淖饔孟嗤淖饔茫虼丝捎米骷?xì)胞增殖抑制劑、血管新生抑制劑、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制劑,即抗癌劑。
      實(shí)施例下面列舉實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明,但是本發(fā)明并不限于此。
      材料和方法(1).細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)本試驗(yàn)中所使用的人肺癌細(xì)胞株A549(ATCC號(hào)CCL-185),在添加10%胎牛血清(FBS)(Bio Source International,Camarillo,CA)的ERD F培養(yǎng)基(極東制藥)中,于37℃、水蒸氣飽和的5%CO2條件下繼代、保持。1L ERDF培養(yǎng)基中加入了1.125g的NaHCO3(和光純藥,Osaka,日本)。細(xì)胞在對(duì)數(shù)增殖期培養(yǎng)保持。人伯基特淋巴瘤(Burkit′s lymphoma)細(xì)胞株DND39,在添加5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Nissui,日本)中,于37℃、水蒸氣飽和的5%CO2條件下繼代、保持。RPMI-1640培養(yǎng)基中加入了100U/mL青霉素(Meiji pharmaceutical Company,Tokyo,Japan)、100mg/mL鏈霉素(Meiji pharmaceuticalCompany)、12.5mM NaHCO3(和光純藥)和10mM HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)(和光純藥)。
      (2).綠茶兒茶素將綠茶兒茶素,表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate,EGCG)、表兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate,ECG)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素(epicatechin,EC)、兒茶素(catechin,C)、表沒(méi)食子兒茶素-3-(3-O-甲基)-沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-(3-O-methyl)-gallate,EGCG3″Me)溶解在磷酸緩沖液(PBS)中使其濃度成為5mM。使用時(shí)適當(dāng)解凍后使用。PB S是相對(duì)1L的超純水溶解8.0g NaCl(Nacalaitesque,Inc.)、0.2g KCl(Nacalai tesque,Inc.)、1.15g Na2HPO4(Nacalai tesque,Inc.)、0.2g KH2PO4(Nacalai tesque,Inc.)制得。
      咖啡因(caffeine)和槲皮黃素(quercetin)從Nacalai tesque,Inc.購(gòu)入,前者懸浮于PBS中、后者懸浮于二甲亞砜(DMSO)(Nacalai tesque,Inc.)中制得,使其濃度都成為5mM。
      (3).試劑和器械將臺(tái)盼藍(lán)(和光純藥)懸浮于PB S中使其成為1%的濃度,在121℃高壓滅菌20分鐘。全反式視黃酸(ATRA)從Sigma(St.Louis,MO)購(gòu)入并溶解在乙醇中。
      提取RNA所用的TRIzol(一步法總RNA提取試劑)從Invitrogen(Carlsbad,CA)購(gòu)入。0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水從Sigma(St.Louis,MO)購(gòu)入。溶解RNA所用的DEPC溶液是通過(guò)將DEPC加入到蒸餾水中攪拌2小時(shí)使其最終濃度成為0.1%之后,經(jīng)高壓滅菌制得的。Oligotex-dT30及由人胎盤獲得的RNase抑制劑是從Takara(Kyoto,日本)購(gòu)入的,莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)-逆轉(zhuǎn)錄酶是從Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire,UK)購(gòu)入的。引物等寡核苷酸是委托BIOSYNTHESIS(日本)合成的。Taq DNA 聚合酶是從Fermentas(Vilnius,Lithuania)購(gòu)入的,Ex Taq是從Takara購(gòu)入的。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用2400型P CR擴(kuò)增儀(Parkin-Elmer,Tokyo,Japan)。瓊脂糖使用超純瓊脂糖(SawadayTechnology,Tokyo,Japan)。
      克隆的載體使用pTARGETTM哺乳動(dòng)物表達(dá)載體系統(tǒng)(Promega,Madison,WI)。精制使用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒或EndoFre e質(zhì)粒提取試劑盒(都得自QIAGEN)。
      LB培養(yǎng)基是將10g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto Tryptone)(Becton Dickinson,Sunnyvale,CA)和5g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Bacto Yeast Extract)(DIFCO LABORATORIES,Detroit,MI)、5g NaCl溶解在1L超純水中,高壓滅菌。冷卻至60℃之后,加入1000mL 150mg/mL的氨芐青霉素(將氨芐青霉素鈉(和光純藥)溶解在超純水中使其成為150mg/mL之后,高壓滅菌)。LB板是加入2g Bacto Tryptone、1g Bacto Yeast Extract、2g NaCl、5g細(xì)菌瓊脂粉(Bacto Agar)(DIFCO),溶解在200mL超純水中經(jīng)高壓滅菌。冷卻至60℃之后,加入200mL 150mg/mL的氨芐青霉素,分別向10mL盤(Falcon)中各注入10mL。異丙基-b-D-(-)-硫代半乳糖苷(IPTG)從和光純藥購(gòu)入,配制成0.1M。將5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷(X-gal)(和光純藥)溶解在N-N-二甲基-甲酰胺(和光純藥)中使其成為20mg/mL。SOC如下制得向3g Bacto Tryptone、0.75g BactoYeast Extract,0.078g NaCl、0.027g KCl加水至總量成為148.5mL。將該溶液高壓滅菌。向其中加入1.5mL另外高壓滅菌的2MMg2+溶液(將12.324g的MgSO4·7H2O、10.165g的MgCl2·6H2O與超純水混合至50mL)。向100mL該溶液中加入1mL的2M葡萄糖。
      DNA測(cè)序儀使用ABI PRISM 310型遺傳分析儀(AppliedBiosystems,Toyko,Japan),此時(shí),使用ABI PRISM BIGDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version2.0(Applied Biosystems)。模板抑制劑(template suppressionreagent,TSR)從Applied Biosystems購(gòu)入。
      基因?qū)胧鞘褂肍uGENETM6轉(zhuǎn)染試劑(Roche DiagnisticsGmbh,Mannheim,Germany)進(jìn)行的。
      流式細(xì)胞儀分析用的抗人層粘連蛋白受體抗體從NEOMARKERS(Fremont,CA)購(gòu)入。陰性對(duì)照抗體的小鼠IgM抗體使用購(gòu)自Zymed Laboratories,Inc.,(San Francisco,CA)的抗體。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgM抗體從Southern Biotechnology Associates,Inc(Birmingham,AL)購(gòu)入。流式細(xì)胞儀使用FACSCalibur(Becton Dickinson)。
      (4).RNA提取和cDNA合成將預(yù)先用1mM ATRA于37℃處理24小時(shí)的細(xì)胞用PB S洗凈之后,對(duì)每1×107個(gè)細(xì)胞加入1mL Trizol,迅速懸浮使其完全溶解。室溫下靜置5分鐘之后,添加0.2mL氯仿,劇烈倒置攪拌。室溫下靜置3分鐘之后,于12000xg、4℃離心15分鐘。在離心上清液中加入0.5mL的2-丙醇,劇烈倒置攪拌,室溫下靜置10分鐘之后,于12000xg、4℃離心10分鐘。除去該上清液,用1mL的75%乙醇沖洗沉淀。于12000xg、4℃離心5分鐘之后,將上清液中的乙醇盡量除去,將沉淀的總RNA溶解在20mL的DEPC水中。cDNA合成如下所示。首先,向10mg的總RNA中加入1mL0.5mg/mL的(dT)20引物,在70℃下靜置10分鐘之后,直接用冰冷卻進(jìn)行退火。接下來(lái),加入2mL 10mM dNTP(脫氧核苷三磷酸)、0.1mL RNase(核糖核酸酶)抑制劑,4mL添附到MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶中的5x緩沖液,用DEPC水使總量達(dá)到20mL。將該混合液于37℃靜置1小時(shí)合成cDNA,于97℃靜置5分鐘使酶失活。
      (5).67kDa層粘連蛋白受體(67LR)表達(dá)載體的構(gòu)建用1mM ATRA將DND 39細(xì)胞于37℃處理24小時(shí)之后,進(jìn)行RNA提取并合成cDNA。參考Full-length cDNA(Yow等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,856394-6398(1988))制造引物(H-LamininR-F;5′-ATGTCCGGAGCCCTTGATGTCC-3′、H-LamininR-R;5′-TTAAGACCAGTCAGTGGTTGCTC-3′)。將引物調(diào)節(jié)至20mM。將1mL合成的cDNA、0.1mL ExTaq、2mL 10 x Taq緩沖液、1.6mL 2.5mM dNTP、引物各0.5mL、14.3mL dH2O懸浮,進(jìn)行PCR。條件是,初期變性在95℃下進(jìn)行5分鐘,變性反應(yīng)在94℃下進(jìn)行30秒鐘,退火在58℃下進(jìn)行30秒鐘,延伸反應(yīng)在72℃下進(jìn)行30秒鐘,變性反應(yīng)、退火和延伸反應(yīng)進(jìn)行25次循環(huán)。用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,目標(biāo)染色體帶用Wizard SV凝膠及PCR純化系統(tǒng)(Wizard SV Gel and PCRClean-Up System,Promega)進(jìn)行精制。進(jìn)行該測(cè)序,確認(rèn)是目標(biāo)物。加入1mL的T4D NA連接酶10x緩沖液、1mL的pTARGETTM載體、1mL的T4D NA連接酶以及2.82mL的PCR產(chǎn)物、4.18mL的dH2O,在4℃下靜置一夜,進(jìn)行連接。隨后進(jìn)行與亞克隆相同的操作。由菌落PCR進(jìn)行正反判斷,用白金耳拾起菌落轉(zhuǎn)移到LB培養(yǎng)基中,在37℃、150rpm下振動(dòng)一晚進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)其集菌,經(jīng)EndoFree質(zhì)粒提取試劑盒精制。進(jìn)行該測(cè)序,確認(rèn)是67LR。
      (6).67LR瞬時(shí)表達(dá)體系的構(gòu)建將構(gòu)建的67LR表達(dá)載體(pTARGET-hLamininR)用FuG ENETM6轉(zhuǎn)染劑導(dǎo)入A549細(xì)胞中。詳述如下。將細(xì)胞調(diào)節(jié)為1×104個(gè)細(xì)胞/mL(10%FBS-ERDF培養(yǎng)基)播種加入。37℃下放置24小時(shí)使細(xì)胞粘附之后,在管中取新的ERDF培養(yǎng)基,直接加入FuGENETM6(3倍的基因量),輕輕地混合。接下來(lái)加入pTARGET-hLamininR,輕輕地混合,室溫下放置30分鐘。將其加入到培養(yǎng)基中,在37℃下靜置48小時(shí)。用培養(yǎng)基洗凈之后,替換新鮮的培養(yǎng)基。
      (7).各種成分對(duì)67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的影響對(duì)67LR瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞,添加各種濃度的各種成分,在含有5%FBS的ERDF培養(yǎng)基中于37℃處理48小時(shí)。處理之后,進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)以及用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行存活率的測(cè)定。
      而且,就EGCG前處理而言,將最終濃度為10μg/mL(含有1%FBS的ERDF培養(yǎng)基)的抗67LR抗體于37℃處理30分鐘之后,進(jìn)行EGCG處理,還研究對(duì)抗體處理細(xì)胞的影響。作為陰性對(duì)照,小鼠IgM中也進(jìn)行同樣的處理。
      (8).各種成分對(duì)67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合性分析通過(guò)表面等離子共振傳感器SPR670(Nippon Laser andElectronic Lab.,Nagoya,Japan)測(cè)定5μM各種成分與細(xì)胞的結(jié)合性。測(cè)定時(shí)首先用蛋白質(zhì)等的標(biāo)準(zhǔn)固定化法將細(xì)胞固定在金膜(Nippon Laser and Electronic Lab.)上。將金膜浸在10mM的4,4-二硫代二丁酸(4,4-Dithiodibutyric acid,DDA)(東京化成工業(yè),Tokyo,Japan)乙醇溶液(在10mL的99%乙醇中溶解2.38mg的DDA,再用乙醇稀釋至1/100)(金面向上),室溫下輕輕地?cái)嚢?0分鐘。接下來(lái),不對(duì)金表面施加水壓地用乙醇洗滌2次,導(dǎo)入自組裝膜(SA膜)。分別將25mg水溶性碳化二亞胺;EDC(和光純藥)溶解在1mL超純水中,將15mg N-羥基琥珀酰亞胺;NHS(和光純藥)溶解在9mL 1,4-二噁烷(Nacalai tesque,Inc.)中。將各自混合溶液,浸入SA膜處理之后的金膜,輕輕地于室溫?cái)嚢?0分鐘。向其中加入10mL的超純水,再于室溫?cái)嚢?分鐘。不對(duì)金表面施加水壓地用超純水洗滌2次,使之干燥(風(fēng)干),裝到盒中。將細(xì)胞調(diào)節(jié)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL(流動(dòng)緩沖液PBS),在金膜上滴下20μL并于室溫下保持30分鐘將細(xì)胞固定化。之后,注入用PBS稀釋至1、10、25、50μM的綠茶兒茶素,通過(guò)測(cè)定表面等離子共振角度(Angle)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)細(xì)胞的結(jié)合性。
      另外,EGCG與抗67LR抗體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn),是將最終濃度為10μg/mL(含有1%FBS的ERD F培養(yǎng)基)的抗67LR抗體于37℃處理30分鐘之后,將細(xì)胞在金膜上固定化,用表面等離子共振傳感器與上述相同地進(jìn)行的。此時(shí),作為陰性對(duì)照,用小鼠IgM也進(jìn)行同樣的處理來(lái)測(cè)定。
      (9).流式細(xì)胞儀分析已知67LR在細(xì)胞表面上表達(dá),因此通過(guò)使用抗人層粘連蛋白受體(LR)抗體的流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)除在細(xì)胞表面上表達(dá)的67LR。將細(xì)胞回收,在1.5mL Eppendorf管中調(diào)節(jié)成總量100μL的1%FBS-PBS中含有1×106個(gè)細(xì)胞,作為1次抗體添加抗人LR抗體至最終濃度成為10μg/mL。在4℃下培育30分鐘之后,用PBS洗滌1次。接下來(lái),作為2次抗體添加可識(shí)別LR抗體的同種型的抗小鼠IgM FITC標(biāo)記抗體并使其在總量25μL的1%FBS-PBS中最終濃度成為12.5μg/mL。在4℃下培育30分鐘之后,用PBS洗滌2次,然后,再懸浮于PB S中用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。將陰性對(duì)照IgM抗體以相同濃度(10μg/mL)進(jìn)行反應(yīng)。細(xì)胞表面67LR表達(dá)量以LR的熒光強(qiáng)度的中央值表示。
      另外,為了研究EGCG處理對(duì)67LR細(xì)胞表面表達(dá)的影響,在1次抗體作用之前,用調(diào)節(jié)至最終濃度為50μM的添加EGCG的1%FBS-PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,在37℃下靜置30分鐘。用PBS洗滌1次。下面從1次抗體開(kāi)始進(jìn)行上述作用,進(jìn)行測(cè)定。并且,也用不含EGCG的1%FBS-PBS進(jìn)行處理,作為對(duì)照組。
      (10).統(tǒng)計(jì)計(jì)算用學(xué)生氏t-檢驗(yàn)(student′st-test)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
      實(shí)施例1導(dǎo)入67LR基因?qū)GCG的細(xì)胞結(jié)合性和增殖活性的影響使用FuGENETM6轉(zhuǎn)染劑通過(guò)以下方法將67LR表達(dá)載體(pTARGET-hLamininR)導(dǎo)入A549細(xì)胞中。將細(xì)胞調(diào)節(jié)為1×104個(gè)細(xì)胞/mL(10%FBS-ERDF培養(yǎng)基)播種。24小時(shí)之后,在管中取新的ERDF培養(yǎng)基,直接加入FuG ENETM6(3倍的基因量),輕輕地混合。接下來(lái)以不同濃度加入pTARGET-hLamininR并輕輕地混合,室溫下放置30分鐘。將其加入到培養(yǎng)基中,在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。對(duì)該67LR瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞,添加不同濃度的EGCG,在含有5%FBS的ERD F培養(yǎng)基中于37℃處理48小時(shí)。處理之后,進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)以及由臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行存活率的測(cè)定。
      結(jié)果,觀察到在瞬時(shí)表達(dá)67LR的細(xì)胞中依賴EGCG濃度地抑制細(xì)胞增殖。而且,也觀察到與導(dǎo)入到細(xì)胞的67LR基因量成比例地抑制細(xì)胞增殖。
      67LR是存在于細(xì)胞膜中的膜蛋白質(zhì),在導(dǎo)入該基因的表達(dá)載體的細(xì)胞中EGCG的效果增強(qiáng),可能是由于EGCG的結(jié)合性增大的緣故。因此,通過(guò)表面等離子共振傳感器測(cè)定EGCG對(duì)該細(xì)胞的的結(jié)合性。EGCG以5μM使用。
      首先,在導(dǎo)入空載體的A549細(xì)胞中,僅觀察到若干角度的變化(結(jié)合量),于此相對(duì)地,在導(dǎo)入67LR表達(dá)載體的細(xì)胞中,導(dǎo)入0.25μg的細(xì)胞中就已觀察到角度顯著增大,進(jìn)一步導(dǎo)入0.5μg的細(xì)胞中觀察到更進(jìn)一步的增大。由此顯示,67LR表達(dá)載體的導(dǎo)入提高了EGCG向細(xì)胞表面的結(jié)合性。
      圖1、圖2和圖3顯示實(shí)施例1的結(jié)果。
      實(shí)施例267LR的細(xì)胞表面表達(dá)量的測(cè)定已指出通過(guò)導(dǎo)入67LR表達(dá)載體,EGCG對(duì)細(xì)胞表面的結(jié)合性增大。于是,用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證該結(jié)合性的增大是不是由于實(shí)際上在細(xì)胞膜上的67LR表達(dá)增大。
      首先,進(jìn)行細(xì)胞表面的67LR的表達(dá)量的測(cè)定。在對(duì)照品A549細(xì)胞中觀察到若干表達(dá)。在向該細(xì)胞中導(dǎo)入了空載體(0.5μg)的細(xì)胞中幾乎未觀察到對(duì)表達(dá)量的影響。然而,在導(dǎo)入了67LR表達(dá)載體(0.5μg)的細(xì)胞中表達(dá)量大幅增加,由此可知在細(xì)胞表面上67LR表達(dá)。
      進(jìn)一步,為了弄清EGCG是否通過(guò)該67LR結(jié)合,在抗67LR抗體作用之前使EGCG作用。其結(jié)果,在對(duì)照細(xì)胞中觀察到的67LR的表達(dá)在表觀上消失。而且,在導(dǎo)入空載體的細(xì)胞中同樣也存在該現(xiàn)象。而且,導(dǎo)入67LR的細(xì)胞中同樣也存在。這可以認(rèn)為是由于使EGCG預(yù)先作用于細(xì)胞,細(xì)胞表面的67LR上已經(jīng)先結(jié)合了EGCG,導(dǎo)致抗67LR抗體不能結(jié)合到細(xì)胞膜上的67LR上,因此表觀上不能檢測(cè)出67LR的表達(dá)。
      由這些結(jié)果可知,通過(guò)導(dǎo)入67LR表達(dá)載體,細(xì)胞表面的67LR表達(dá)增大,顯示出EGCG的結(jié)合性的增大是67LR的細(xì)胞膜表達(dá)增大。而且啟示出EGCG通過(guò)該67LR結(jié)合到細(xì)胞上。即,顯示67LR是EGCG的受體。
      圖4顯示實(shí)施例2的結(jié)果。
      實(shí)施例3抗67LR抗體對(duì)EGCG的結(jié)合性和增殖抑制活性的影響到目前為止已指出,EGCG通過(guò)67LR結(jié)合到細(xì)胞上,表現(xiàn)出增殖抑制活性。為進(jìn)一步闡明該點(diǎn),這次,在對(duì)67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞用抗67LR抗體預(yù)先進(jìn)行處理的基礎(chǔ)上,研究能否觀察到對(duì)EGCG的結(jié)合性和增殖抑制活性的影響。
      首先,通過(guò)表面等離子共振傳感器研究抗體對(duì)結(jié)合性的影響。當(dāng)使抗67LR抗體作用,則由角度變化量觀察到EGCG的結(jié)合速度和結(jié)合量本身的減少。在陰性對(duì)照抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的效果。
      并且,還研究了抗體對(duì)EGCG的癌細(xì)胞增殖抑制的影響。在67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞中即使僅0.1μM濃度的EGCG也觀察到增殖抑制活性,然而在作用EGCG之前進(jìn)行抗體處理,其增殖抑制效果就消失了。此時(shí),沒(méi)有觀察到對(duì)存活率的影響。由該結(jié)果顯示,不僅是EGCG的結(jié)合,增殖抑制活性也是通過(guò)EGCG對(duì)67LR的結(jié)合來(lái)進(jìn)行的。
      圖5和圖6顯示實(shí)施例3的結(jié)果。
      實(shí)施例467LR表達(dá)對(duì)其它茶成分的結(jié)合性和增殖抑制活性的影響已指出,EGCG是通過(guò)67LR結(jié)合到細(xì)胞膜上的,而且,表現(xiàn)出癌細(xì)胞增殖抑制活性。研究了該通過(guò)67LR的效果是否是EGCG特有的效果。于是,作為其它茶成分,使用了主要的綠茶兒茶素ECG、EGC、EC、C和被報(bào)道具有強(qiáng)抗變態(tài)反應(yīng)作用并且在活體內(nèi)穩(wěn)定地存在的EGCG3″Me。還對(duì)與兒茶素同樣具有各種生理機(jī)能的咖啡因,以及報(bào)道同樣具有很多生理機(jī)能的黃烷醇類的一種槲皮黃素進(jìn)行研究。
      首先,研究對(duì)67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的增殖的影響。與上述相同地,用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法將0.5μg的pTARGET-hLamininR導(dǎo)入A549細(xì)胞中,在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)之后,對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞作用各種茶成分并使茶成分的最終濃度成為5μM。在該狀態(tài)下,再于37℃培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞數(shù)和存活率的測(cè)定。其結(jié)果,C、EC、EGC、咖啡因和槲皮黃素中,不論基因的導(dǎo)入與否,都沒(méi)有觀察到對(duì)存活率和細(xì)胞數(shù)的影響。另一方面,與EGCG同樣帶有沒(méi)食子?;腅CG和EGCG3″Me中,觀察到與EGCG相同的增殖抑制效果。該結(jié)果啟示,帶有沒(méi)食子?;某煞衷?7LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞中表現(xiàn)出增殖抑制活性。
      并且,用表面等離子共振傳感器測(cè)定各種茶成分對(duì)67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合性。對(duì)A549細(xì)胞,C、EC、EGC未顯示結(jié)合性,在67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞中也未觀察到變化。另外,咖啡因和槲皮黃素也未顯示細(xì)胞結(jié)合性,強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞中也未觀察到變化。ECG和EGCG″3Me全都顯示出細(xì)胞結(jié)合性,盡管都沒(méi)有EGCG那樣的程度,并明確了在67LR強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞中該結(jié)合性增大。
      圖7和圖8顯示實(shí)施例4的結(jié)果。
      工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明,可以提供一種以67kDa層粘連蛋白受體作為靶的藥物的新的篩選方法。
      另外,本申請(qǐng)是要求日本專利申請(qǐng)2003-097652號(hào)的優(yōu)先權(quán)而申請(qǐng)的。
      權(quán)利要求
      1.一種篩選藥物的方法,所述藥物具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用,該方法包括如下步驟定性或定量測(cè)定試驗(yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體上時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法,所述藥物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用的藥物。
      3.一種藥物,其通過(guò)權(quán)利要求1或2所述的篩選方法獲得。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的藥物,其有效成分是帶有沒(méi)食子?;幕衔铩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物,所述化合物是兒茶素類。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      7.根據(jù)權(quán)利要求3~6的任一項(xiàng)所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      8.根據(jù)權(quán)利要求3~6的任一項(xiàng)所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物,所述疾病是癌。
      10.一種藥物組合物的制造方法,包括由化學(xué)合成方法制備權(quán)利要求3~9的任一項(xiàng)所述的藥物的工序,和混合藥學(xué)上可接受的載體的工序。
      11.一種藥物組合物,其通過(guò)權(quán)利要求10所述的制造方法獲得。
      12.一種篩選藥物的方法,包括如下步驟定性或定量測(cè)定帶有沒(méi)食子?;幕衔锖驮囼?yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度超過(guò)帶有沒(méi)食子酰基的化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用相同作用的藥物。
      13.一種篩選藥物的方法,包括如下步驟使帶有沒(méi)食子酰基的化合物對(duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合與試驗(yàn)化合物對(duì)67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)相同時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有與帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用相同作用的藥物。
      14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的篩選方法,所述帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用是細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用。
      15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的篩選方法,所述帶有沒(méi)食子?;幕衔锼哂械乃幚韺W(xué)作用是細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用。
      16.根據(jù)權(quán)利要求12~15的任一項(xiàng)所述的篩選方法,所述化合物是兒茶素類。
      17.根據(jù)權(quán)利要求12~15的任一項(xiàng)所述的篩選方法,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      18.一種藥物,其通過(guò)權(quán)利要求12~17的任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得。
      19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的藥物,其用于通過(guò)細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用能夠預(yù)防和/或治療的疾病。
      21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物,所述疾病是癌。
      22.一種藥物組合物的制造方法,包括由化學(xué)合成方法制備權(quán)利要求18~21的任一項(xiàng)所述的藥物的工序,和混合藥學(xué)上可接受的載體的工序。
      23.一種藥物組合物,其通過(guò)權(quán)利要求22所述的制造方法獲得。
      24.一種化合物,是與67kDa層粘連蛋白受體結(jié)合的化合物,在與帶有沒(méi)食子?;幕衔锝Y(jié)合到該67kDa層粘連蛋白受體的位點(diǎn)相同的位點(diǎn)結(jié)合。
      25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物,所述化合物是兒茶素類。
      26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的化合物,所述兒茶素類是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
      27.一種細(xì)胞增殖抑制劑,其包含權(quán)利要求24~26的任一項(xiàng)所述的化合物。
      28.一種血管新生抑制劑,其包含權(quán)利要求24~26的任一項(xiàng)所述的化合物。
      29.一種癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制劑,其包含權(quán)利要求24~26的任一項(xiàng)所述的化合物。
      30.一種抗癌劑,其包含權(quán)利要求24~26的任一項(xiàng)所述的化合物。
      全文摘要
      提供一種使用67kDa層粘連蛋白受體篩選藥物的新方法和由此獲得的藥物。一種具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物的篩選方法,包括如下步驟定性或定量測(cè)定試驗(yàn)化合物與67kDa層粘連蛋白受體的結(jié)合程度,由該測(cè)定結(jié)果,當(dāng)試驗(yàn)化合物結(jié)合到67kDa層粘連蛋白受體上時(shí),判定該試驗(yàn)化合物是具有細(xì)胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性抑制作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗動(dòng)脈硬化作用和/或克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病感染抑制作用的藥物,以及由此獲得的藥物。
      文檔編號(hào)A61P25/28GK1798975SQ20048001517
      公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
      發(fā)明者立花宏文 申請(qǐng)人:株式會(huì)社產(chǎn)學(xué)連攜機(jī)構(gòu)九州
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