專利名稱：一種防治缺血性血管病的藥物制劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種藥物制劑，特別涉及一種防治缺血性血管病的藥物制劑及其制備方法和用途，屬于中藥領(lǐng)域。
本發(fā)明專利申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原案申請(qǐng)?zhí)枮?00310110316.8，申請(qǐng)日為2003年12月30日，發(fā)明名稱為山茱萸提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
缺血性血管病主要是指動(dòng)、靜脈系統(tǒng)病損引起的血管痙攣、血栓形成或血管閉塞，造成器官局部循環(huán)和功能障礙，主要包括動(dòng)脈硬化、短暫性缺血發(fā)作、各種組織器官梗塞和周圍血管閉塞等。缺血性血管病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是中老年人致死和致殘的主要疾病。因此，發(fā)現(xiàn)和研制防治缺血性血管病的藥物具有重要的意義。山茱萸為補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的傳統(tǒng)中藥，臨床上常與其它中藥配伍組成復(fù)方治療不同疾病，但很少見有山茱萸單味藥治療疾病，尤其山茱萸提取物中有效成分的研究報(bào)告極少，國(guó)內(nèi)外尚未見有該化合物防治缺血性血管病的報(bào)道。山茱萸提取物是從山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis果肉中提取的產(chǎn)物(Cornus total glycosides，山茱萸提取物)，其中主要包括莫諾苷(morroniside)、馬錢素(loganin即番木鱉苷)等。本發(fā)明通過(guò)特定的提取方法提取得到山茱萸的提取物，并發(fā)明了該提取物的制藥新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個(gè)目的在于提供了山茱萸的提取物及其提取方法；本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了山茱萸提取物的制藥新用途；本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種新的治療缺血性血管病的藥物制劑。
本發(fā)明所述山茱萸提取物，含有莫諾苷25-50％、馬錢素25-40％，二者總含量占50-90％。(以重量百分比計(jì))上述本發(fā)明山茱萸提取物可以用如下方法制備
山茱萸藥材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，煎煮時(shí)間1-4小時(shí)；合并煎煮液，過(guò)濾后減壓濃縮，過(guò)濾后冷藏備用；將上述濃縮的山茱萸水提取液過(guò)大孔吸附樹脂柱，使藥液流過(guò)全柱，依次用去離子水、5％-95％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮成浸膏；將大孔吸附樹脂分離的浸膏用乙酸乙酯或乙醇等有機(jī)溶媒進(jìn)行精制，得有效部位提取物。
或者山茱萸藥材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，時(shí)間1-4小時(shí)。合并煎煮液，過(guò)濾后減壓濃縮，加乙醇調(diào)至醇濃度為50％-90％，冷藏12-48小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇。
將上述濃縮的醇沉液過(guò)HP20大孔吸附樹脂柱，再過(guò)Al2O3層析柱，使藥液流過(guò)全柱，依次用去離子水、5％-95％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮成浸膏，冷凍干燥。本發(fā)明所說(shuō)的山茱萸提取物，是指經(jīng)過(guò)上述方法提取獲得的有效部位。
有效部位的測(cè)定方法對(duì)上述提取物制品應(yīng)用薄層層析進(jìn)行定性分析。并且對(duì)上述提取物制品應(yīng)用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析，色譜條件Lichrospher-C18色譜柱，流動(dòng)相甲醇-水(30∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，流速1.0ml/分鐘。檢測(cè)分析結(jié)果莫諾苷含量占25-50％、馬錢素含量占25-40％，二者總含量占50-90％(以重量百分比計(jì))。
本發(fā)明所述的山茱萸提取物可以按藥劑學(xué)方法，加入輔料制備成多種臨床藥物劑型，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說(shuō)的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑中的任何一種；所說(shuō)的非腸道給劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑或皮下給藥劑型當(dāng)中的一種。
所述輔料是指常規(guī)的賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑等。
本發(fā)明公開一種治療缺血性血管病藥物制劑，其特征在于該制劑含有5-95％莫諾苷、5-95％馬錢素；優(yōu)選10-80％莫諾苷、10-80％馬錢素；更優(yōu)選20-60％莫諾苷、60-20％馬錢素。該藥物制劑中還可含有藥學(xué)上可接受的輔料。所述的莫諾苷、馬錢素均可選用市面上銷售的提純品。
輔料如蔗糖、檸檬酸、阿斯巴甜、山梨酸鉀、香精、滑石粉和乳糖。本發(fā)明提取方法得到的山茱萸提取物，含量明確，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，在治療缺血性血管病方面具有確切的療效，可用于制備治療缺血性心腦血管病或周圍血管病等的藥物。
所說(shuō)的缺血性血管病是指動(dòng)、靜脈系統(tǒng)病損引起的血管痙攣、血栓形成、或血管閉塞，或者所造成的各種器官局部循環(huán)或功能障礙。所說(shuō)的缺血性血管病是指動(dòng)脈硬化、短暫性缺血發(fā)作、或各種組織器官梗塞、或周圍血管閉塞中的任何一種。
所說(shuō)的缺血性血管病的病理機(jī)制表現(xiàn)為各種原因所致血管痙攣或管腔狹窄，血管內(nèi)皮損傷，血小板聚集性增高，血栓形成，或栓子阻塞，導(dǎo)致組織缺血以至壞死。
本發(fā)明山茱萸提取物具有下述藥理作用包括抑制血小板聚集，減輕急性腦梗塞性血管損傷，減小梗塞缺血半暗區(qū)面積；降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，改善急性全腦缺血缺氧后的能量和物質(zhì)代謝，提高學(xué)習(xí)記憶能力，抑制乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶B活性，抑制自由基增高及脂質(zhì)過(guò)氧化。
以下實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)范圍的限定。
實(shí)驗(yàn)例1 山茱萸提取物對(duì)大鼠血小板聚集性的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谡Ｇ闆r下，血小板以分散狀態(tài)在血管內(nèi)運(yùn)行。但當(dāng)血管損傷、血流改變或受到化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，血小板則發(fā)生形態(tài)改變、黏附、聚集和釋放，在血栓形成中起著重要作用。血小板聚集性增高也可作為診斷高凝狀態(tài)的參考指標(biāo)和血栓形成的危險(xiǎn)因子。本研究觀察山茱萸提取物對(duì)大鼠血小板聚集性的影響。
實(shí)驗(yàn)方法雄性SD大鼠連續(xù)灌胃給山茱萸提取物14天后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取血前1小時(shí)給藥一次，戊巴比妥鈉麻醉。腹主動(dòng)脈取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，離心制備富血小板(PRP)及貧血小板血漿(PPP)，用上海斯隆公司MPG3E型血小板聚集儀測(cè)定ADP(1.25mmol/L)及凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果山茱萸提取物具有顯著降低ADP及凝血酶致血小板聚集的作用(表1)。表明該化合物有利于防治各種組織器官血管內(nèi)血栓形成。
表1 山茱萸提取物對(duì)大鼠血小板聚集的的影響

M±SD；*p＜0.05，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)例2 山茱萸提取物對(duì)小鼠斷顱致急性全腦缺血模型的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康臄囡B致急性全腦缺血小鼠模型是常用的快速篩選抗腦缺血缺氧藥物的模型，此模型可模擬腦內(nèi)能量代謝的降低，引起神經(jīng)元死亡。斷顱后腦內(nèi)存有的一些供能物質(zhì)仍夠維持一定時(shí)間的小鼠張口呼吸，所以可用張口呼吸時(shí)間來(lái)表示供能物質(zhì)耗竭的時(shí)間。本研究旨在觀察山茱萸提取物對(duì)小鼠急性全腦缺血模型的保護(hù)作用。
實(shí)驗(yàn)方法昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22克。給小鼠灌胃給藥每天2次，連續(xù)給藥5天。于第六天上午給藥1小時(shí)后斷顱，用秒表記錄小鼠張口連續(xù)呼吸持續(xù)時(shí)間，以兩次呼吸間隔大于5秒為死亡。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果山茱萸提取物灌胃口服可延長(zhǎng)小鼠斷顱后張口呼吸的時(shí)間(表2)，表明山茱萸提取物具有拮抗腦缺血缺氧引起的能量代謝降低造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。
表2 山茱萸提取物對(duì)小鼠斷顱致急性全腦缺血后張口呼吸時(shí)間的影響

M±SD；*p＜0.05，**p＜0.01，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)例3 山茱萸提取物對(duì)自由基損傷致局部組織缺血壞死小鼠模型的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠裳踝杂苫龈咭鹧軆?nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板聚集，形成血栓，導(dǎo)致局部組織缺血壞死是缺血性心腦血管病和周圍血管病的共同病理變化。本實(shí)驗(yàn)的造模原理是將光敏物質(zhì)(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長(zhǎng)的冷光源照射小鼠顱部，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成大量氧自由基，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板聚集，在照射區(qū)內(nèi)形成血栓，局部皮層組織缺血壞死。本研究旨在觀察山茱萸提取物對(duì)自由基損傷致局部組織缺血壞死及缺血半暗區(qū)的影響。
實(shí)驗(yàn)方法給小鼠灌服不同劑量山茱萸提取物，15天后造模。將光敏物質(zhì)(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長(zhǎng)的冷光源照射小鼠顱部。在造模后3小時(shí)經(jīng)舌靜脈注入伊文斯蘭染料，1小時(shí)后處死動(dòng)物。處死后取腦組織制成勻漿，并以比色法測(cè)定平均腦組織的光密度。梗塞嚴(yán)重者，染色深，光密度大，缺血半暗區(qū)面積大。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果灌服山茱萸提取物可降低模型小鼠腦組織伊文斯蘭的光密度，并減少模型小鼠缺血半暗區(qū)的面積(表3)。表明山茱萸提取物可減輕由于氧自由基增高而引起血管損傷和血栓形成，有利于防治缺血性血管病的血管損傷和組織壞死。
表3 山茱萸提取物對(duì)自由基損傷誘導(dǎo)血管損傷及腦梗塞小鼠模型的影響

M±SD；*p＜0.05，與模型組相比缺血半暗帶+，++，+++，++++代表面積依次由小到大。
實(shí)驗(yàn)例4 山茱萸提取物對(duì)動(dòng)脈閉塞致局灶性組織缺血大鼠模型的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠扇毖鸬陌麧{鈣離子濃度異常增高是缺血性心腦血管病和周圍血管病的共同病理變化，鈣離子增高也可引起血管收縮或痙攣。由缺血引起的胞漿鈣離子濃度異常增高，可使得受鈣離子調(diào)節(jié)的磷脂酶、蛋白酶、核酸內(nèi)切酶等被激活導(dǎo)致膜磷脂分解和細(xì)胞骨架破壞，細(xì)胞產(chǎn)生不可逆性損傷。本研究旨在觀察山茱萸提取物對(duì)缺血后胞漿內(nèi)鈣離子濃度的影響。
實(shí)驗(yàn)方法(1)模型制作實(shí)驗(yàn)大鼠于第14天給藥30分鐘后行腹腔麻醉，于右外耳道與右外眥連線中點(diǎn)作一上下的斜行切口，分離至充分暴露大腦中動(dòng)脈，以浸有50％三氯化鐵的濾紙條貼于大腦中動(dòng)脈與大腦前靜脈交叉處，30分鐘后用顯微鏡觀察大腦中動(dòng)脈血流確已阻斷，去濾紙，生理鹽水沖洗、縫合。(2)海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的測(cè)定大鼠造模后24小時(shí)，斷頭取腦后置于人工腦脊液中，于視交叉水平切300微米厚的腦片。加入含5uM Fluo-3/AM的人工腦脊液400微升，孵育1小時(shí)后激光共聚焦顯微鏡測(cè)定海馬區(qū)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組右側(cè)為缺血側(cè)，鈣離子濃度比健側(cè)(左側(cè))增高。左右腦鈣離子濃度差值比較，模型組海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增高較對(duì)照組明顯，模型是成立的。山茱萸提取物用藥組較模型組海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低(表4)。表明該化合物降低胞漿內(nèi)鈣離子濃度的作用有利于擴(kuò)張血管和保護(hù)缺血組織，提高細(xì)胞存活率，對(duì)缺血性血管病的防治具有重要意義。
表4 山茱萸提取物對(duì)缺血模型大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

M±SD；*p＜0.05，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)例5 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕M織器官缺血及其病理變化的結(jié)果是導(dǎo)致功能減退甚至喪失。長(zhǎng)期腦缺血可造成學(xué)習(xí)記憶功能下降或血管性癡呆。本研究觀察山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎8周后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。
模型制備及給藥SD大鼠，腹腔注射麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用1號(hào)絲線永久結(jié)扎，縫合肌肉皮膚。術(shù)前預(yù)防灌胃給山茱萸提取物2周，術(shù)后灌胃給藥8周。
避暗法檢測(cè)被動(dòng)回避記憶功能。采用大鼠避暗箱，于術(shù)后第8周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一天進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠放入明室中，使其進(jìn)入暗室受電擊2次，24小時(shí)后進(jìn)行測(cè)試，記錄大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)和潛伏期，并分級(jí)。兩前肢進(jìn)入暗室記為1分；三前肢進(jìn)入暗室記為2分；四肢同時(shí)進(jìn)入暗室記為3分。結(jié)果組間比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)。
通道式水迷宮法于術(shù)后第8周開始訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)分4天進(jìn)行，第1天訓(xùn)練2盲端2次，第2天訓(xùn)練3盲端2次；第3天訓(xùn)練4盲端2次，第4天測(cè)4盲端。每次訓(xùn)練時(shí)間限定在2min，超時(shí)者采用人工引導(dǎo)，按2min計(jì)時(shí)。每只大鼠每次訓(xùn)練和測(cè)試均記錄到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間(到達(dá)時(shí)間)和進(jìn)入盲端的次數(shù)(錯(cuò)誤數(shù))。以4盲端訓(xùn)練期到達(dá)時(shí)間和錯(cuò)誤數(shù)的均值作為學(xué)習(xí)成績(jī)，4盲端測(cè)試期到達(dá)時(shí)間和錯(cuò)誤數(shù)作為記憶成績(jī)，結(jié)果組間比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)。
Morris水迷宮法，于術(shù)后第8周開始訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)分5天進(jìn)行，每天訓(xùn)練2次。第1天訓(xùn)練2次，入池位置為站臺(tái)所對(duì)象限及所鄰象限。于象限邊1/2弧度處將大鼠頭朝池壁入水。訓(xùn)練時(shí)間限定在2min，超時(shí)者采用人工引導(dǎo)，按2min計(jì)時(shí)。每只大鼠每次訓(xùn)練均記錄游出時(shí)間、距離、搜索站臺(tái)的軌跡。結(jié)果組間比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈長(zhǎng)期結(jié)扎使大鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶障礙。山茱萸提取物可改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶，表現(xiàn)在可縮短水迷宮試驗(yàn)中的游出時(shí)間和距離、減少錯(cuò)誤次數(shù)(表5-7)；在避暗試驗(yàn)中可延長(zhǎng)潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)(表8)。表明山茱萸提取物可改善長(zhǎng)期組織器官缺血導(dǎo)致的功能障礙。
表5 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠Morris水迷宮游出時(shí)間(秒)的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表6 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型Morris水迷宮游出距離(厘米)的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表7 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠通道式水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表8 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)驗(yàn)例6 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型大腦皮層乙酰膽堿酯酶活性的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪X內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)是水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的酶類。AchE抑制劑可減緩乙酰膽堿的分解代謝，提高學(xué)習(xí)記憶能力。本研究觀察山茱萸提取物對(duì)缺血大鼠腦組織AchE活性的影響。
實(shí)驗(yàn)方法大鼠大腦皮層勻漿離心后，取上清液用生化方法測(cè)定AchE活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果長(zhǎng)期腦缺血模型大鼠大腦皮層AchE活性明顯增強(qiáng)。山茱萸提取物可明顯抑制模型大鼠大腦皮層AchE活性(表9)。
表9 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦皮層AchE活性的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)驗(yàn)例7 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦皮層單胺氧化酶B活性的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康膯伟费趸笍V泛分布在動(dòng)物組織，主要位于細(xì)胞線粒體部分，它可催化各種單胺類使其脫氨生成相應(yīng)的醛，進(jìn)一步氧化成酸或使醛轉(zhuǎn)化成醇再進(jìn)行下一步代謝。單胺氧化酶B(MAO-B)與衰老關(guān)系密切，隨增齡多種組織的MAO-B活性增高。近年來(lái)MAO-B抑制劑可用于治療心腦血管病、帕金森病、老年癡呆癥和延緩衰老。本研究觀察山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦皮層MAO-B活性的影響。
實(shí)驗(yàn)方法大鼠腦組織勻漿離心后，取上清液用生化方法測(cè)定MAO-B活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠大腦皮層MAO-B活性比對(duì)照組明顯增高。山茱萸提取物可明顯抑制雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦皮層MAO-B活性(表10)。
表10 山茱萸提取物對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦皮層MAO-B活性的影響

M±SD，與模型組比較*P＜0.05
實(shí)驗(yàn)例8 本發(fā)明所述山茱萸提取物定性分析對(duì)本發(fā)明提取物及其制品應(yīng)用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析，色譜條件Lichrospher-C18色譜柱，流動(dòng)相甲醇-水(30∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，流速1.0ml/分鐘。檢測(cè)分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例9 莫諾苷與馬錢素組合物(morroniside combined with loganin，MCL，莫諾苷占45％，馬錢素占40％，藥用淀粉15％的混合物)防治腦缺血缺氧的作用1.MCL提高缺血再灌注小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)方法昆明小鼠，體重20±2g，連續(xù)灌胃給MCL7天，末次給藥后1小時(shí)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再通(夾閉2次，每次15min，中間再通10min)合并尾部放血的方法建立腦缺血再灌模型。術(shù)后第7天開始進(jìn)行Morris水迷宮和小鼠跳臺(tái)測(cè)試，檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力。
Morris水迷宮測(cè)定Morris水迷宮主要由直徑1.4m的圓形水池和自動(dòng)錄象及分析系統(tǒng)兩部分組成。水深15cm，水溫25℃±2℃，加適量奶粉使水呈乳白色，每只小鼠頭部涂以黑色，水池上方置一射像頭采集小鼠游泳軌跡，第一天訓(xùn)練2次，入池位置為站臺(tái)所對(duì)象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處將小鼠頭朝池壁入水，120S未找到站臺(tái)者，將其引致站臺(tái)，放置30S引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。第2、3和4天重復(fù)測(cè)試；數(shù)據(jù)采集和處理均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)。將各組小鼠分別放入反應(yīng)箱中適應(yīng)3min，通以36V交流電，訓(xùn)練5min；24h后將小鼠放于銅柵上，通電，記錄小鼠第一次跳上跳臺(tái)的時(shí)間(反應(yīng)期)、第一次跳下的時(shí)間(潛伏期)、5min內(nèi)跳下的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠腦缺血缺氧后可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為Morris水迷宮試驗(yàn)游出時(shí)間增加及游出距離的延長(zhǎng)，跳臺(tái)試驗(yàn)反應(yīng)期延長(zhǎng)及潛伏期縮短，提示MCL有改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，表現(xiàn)為Morris水迷宮試驗(yàn)游出時(shí)間及游出距離的縮短。
表11 MCL對(duì)缺血再灌注小鼠模型Morris水迷宮游出時(shí)間的影響(n＝10)

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表12 MCL對(duì)缺血再灌小鼠模型Morris水迷宮游出距離的影響(n＝10)

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表13 跳臺(tái)法觀察MCL對(duì)缺血再灌小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響(n＝10)

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.012.MCL抑制缺血再灌小鼠模型脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)方法昆明小鼠，20±2g，隨機(jī)分組后，連續(xù)灌胃給MCL7天，末次給藥后1小時(shí)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再通(夾閉2次，每次15min，中間再通10min)合并尾部放血的方法建立腦缺血缺氧模型。14天后，迅速斷頭取腦，分離腦皮層組織，用硫代巴比妥(TAB)法測(cè)定腦組織中過(guò)氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果MCL灌服可降低缺血再灌小鼠腦組織MDA含量，表明該藥可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化(表14)，具有抗氧化作用。
表14 5-HMF對(duì)缺血再灌小鼠腦組織MDA含量的影響(n＝10)

M±SD，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01綜上所述，從山茱萸中提取獲得的產(chǎn)物，或由莫諾苷與馬錢素組成的組合物制劑，可明顯降低由ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，減輕組織器官的血管損傷，減小缺血半暗區(qū)面積，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，改善組織器官缺血缺氧后的能量和物質(zhì)代謝，提高長(zhǎng)期腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膶W(xué)習(xí)記憶能力，抑制乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶B活性；而且可明顯改善缺血再灌注動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能，抑制器官組織脂質(zhì)過(guò)氧化。表明該藥物制劑具有防治缺血性血管病的作用?？捎糜谥委焺?dòng)、靜脈系統(tǒng)病損引起的血管痙攣、血栓形成或血管閉塞，或者造成各種器官局部循環(huán)和功能障礙。臨床上主要用于治療動(dòng)脈硬化、缺血性心腦血管病和周圍血管病等。
以下實(shí)施例均能達(dá)到上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
最佳實(shí)施方式實(shí)施例1山茱萸提取物的制備山茱萸藥材用水煎煮3遍，加水量6倍，時(shí)間2小時(shí)。合并3次煎煮液，過(guò)濾后減壓濃縮，過(guò)濾后冷藏備用；取濃縮的山茱萸水提取，上HP20大孔吸附樹脂柱，使藥液流過(guò)全柱，依次用去離子水、30％、50％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集50％乙醇的洗脫液，減壓濃縮成浸膏；將大孔吸附樹脂分離的產(chǎn)物浸膏用乙醇萃取，脫除有機(jī)溶劑，濃縮，干燥，獲得固體產(chǎn)物。得率2.5％。
實(shí)施例2山茱萸提取物的制備山茱萸藥材用水煎煮3遍，加水量6倍，時(shí)間2小時(shí)。合并3次煎煮液，過(guò)濾后減壓濃縮，加乙醇調(diào)至醇濃度為70％，冷藏24小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇后，冷藏備用。
取上述山茱萸水提醇沉提取液，上HP20大孔吸附樹脂柱，使藥液流過(guò)全柱，依次用去離子水、30％、50％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集50％乙醇的洗脫液，減壓濃縮成浸膏。
將大孔吸附樹脂分離的流浸膏上Al2O3層析柱，用乙醇洗脫進(jìn)行精制，凍干獲得固體產(chǎn)物，得率2.3％。
經(jīng)高效液相色譜儀分析，所述產(chǎn)物中莫諾苷含量占25-50％、馬錢素含量占25-40％，二者總含量占50-90％。
實(shí)施例3膠囊劑本發(fā)明山茱萸提取物300g藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊，每粒0.35g，每次口服1-2粒，每日兩次。
實(shí)施例4片劑本發(fā)明山茱萸提取物300g，羧甲基纖維素40g，乳糖50g，硬脂酸鎂4g。將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑，每片0.4g，每次3片，每日3次。
實(shí)施例5膠囊劑莫諾苷140g，馬錢素120g，藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊，每粒0.35g，每次口服1-2粒，每日兩次。
實(shí)施例6片劑莫諾苷140g，馬錢素120g，羧甲基纖維素40g，乳糖50g，硬脂酸鎂4g。將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑，每片0.4g，每次3片，每日3次。
實(shí)施例7膠囊劑莫諾苷300g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊，每粒0.20g，每次口服1-2粒，每日兩次。
實(shí)施例8膠囊劑莫諾苷400g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
實(shí)施例9膠囊劑莫諾苷300g，馬錢素500g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
權(quán)利要求
1.一種藥物制劑，其特征在于該制劑藥物原料中含有5-95％莫諾苷、5-95％馬錢素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其特征在于該制劑藥物原料中含有10-80％莫諾苷、10-80％馬錢素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其特征在于該制劑藥物原料中含有20-60％莫諾苷、60-20％馬錢素。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物制劑的制備方法，其特征在于該方法所用的藥物原料中含有5-95％莫諾苷、5-95％馬錢素。
5.如權(quán)利要求2所述的藥物制劑的制備方法，其特征在于該方法所用的藥物原料中含有10-80％莫諾苷、10-80％馬錢素。
6.如權(quán)利要求3所述的藥物制劑的制備方法，其特征在于該方法所用的藥物原料中含有20-60％莫諾苷、20-60％馬錢素。
7.如權(quán)利要求1所述的膠囊劑的制備方法，其特征在于該方法為莫諾苷140g，馬錢素120g，藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
8.如權(quán)利要求1、2或3所述的片劑的制備方法，其特征在于該方法為莫諾苷140g，馬錢素120g，羧甲基纖維素40g，乳糖50g，硬脂酸鎂4g；將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑。
9.如權(quán)利要求1或2所述的膠囊劑的制備方法，其特征在于該方法為莫諾苷300g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
10.如權(quán)利要求1或2所述的膠囊劑的制備方法，其特征在于該方法為莫諾苷400g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
11.如權(quán)利要求1或2所述的膠囊劑的制備方法，其特征在于該方法為莫諾苷300g，馬錢素500g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號(hào)膠囊。
12.如權(quán)利要求1、2或3所述的藥物制劑在制備防治缺血性血管病的藥物中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于所述防治的缺血性血管病是指動(dòng)、靜脈系統(tǒng)病損引起的血管痙攣、血栓形成、或血管閉塞，或者所造成的各種器官局部循環(huán)或功能障礙。
14.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于所述的防治缺血性血管病是指動(dòng)脈硬化、短暫性缺血發(fā)作、或各種組織器官梗塞、或周圍血管閉塞中的任何一種。
15.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于所述的防治缺血性血管病是指防治腦缺血缺氧。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于所述的防治腦缺血缺氧是指提高學(xué)習(xí)記憶能力或抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。
全文摘要
本發(fā)明公開了山茱萸提取物及其制備方法，還公開了該提取物的藥物新用途。該提取物中含有莫諾苷25－50％、馬錢素25－40％。所述的新用途涉及在制備治療缺血性血管病的藥物的應(yīng)用，所說(shuō)的缺血性血管病包括動(dòng)、靜脈系統(tǒng)病損引起的血管痙攣、血栓形成或血管閉塞，或者所造成的器官局部循環(huán)或功能障礙。臨床上主要指動(dòng)脈硬化，短暫性缺血發(fā)作，各種組織器官梗塞，或周圍血管缺血、閉塞等。還涉及治療缺血性血管病的含有莫諾苷與馬錢素的藥物制劑。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1775219SQ20051009372
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者李林, 趙玲, 張?zhí)m, 葉翠飛, 魏海峰 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院