專利名稱：西藏胡黃連在制備治療腎臟疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及西藏胡黃連的新用途，特別涉及西藏胡黃連在制備治療腎臟疾病藥物中的應用。
背景技術：
慢性腎臟疾病、糖尿病腎病、急性缺血再灌注導致的腎臟損傷等是十分常見的腎臟疾病。在我國，糖尿病、腎臟疾病的人群日益增多，已成為最為常見的疾病。因此，加強上述疾病的防治是我國乃至全球性亟待解決的問題。但是，迄今為止，尚無有效的針對上述疾病的防治手段和藥物。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，上述疾病都具有的共同的病理生理特點，即都存在氧化反應增強，也就是氧化應激狀態(tài)。研究證實氧化應激并非疾病的伴隨現(xiàn)象，而是介導組織器官損害，參與病變發(fā)生發(fā)展的重要因素。
胡黃連是原產(chǎn)于印度的一種玄參科植物，其根莖可入藥。作為中藥材始見于《唐本草》，具有清熱涼血、燥濕消疳作用，用于小兒驚癇、疳積、瀉痢、骨蒸癆熱、自汗、盜汗、吐血等癥。在20世紀70年代以前，我國的胡黃連一直依賴進口主產(chǎn)于印度的胡黃連(Picrorhizakurrooa Royle ex Benth)。1965年在西藏東南部及云南西北部發(fā)現(xiàn)了與印度胡黃連同屬植物，其生藥形態(tài)、組織及性味等方面與前者非常相似，可以代替印度胡黃連用藥，命名為西藏胡黃連(Picrorhiza scrophulariifora Pennell)。目前《中國藥典》收載的胡黃連即西藏胡黃連。國內(nèi)關于西藏胡黃連的研究報道以及專利文獻均集中于其保肝作用、抗糖尿病活性等，未有對該中藥在腎臟疾病方面的用途進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供西藏胡黃連提取物在制備治療腎臟疾病藥物中的應用，開辟了西藏胡黃連作為中藥的一種新用途，也為腎臟疾病的治療提供了一種新的途徑。
本發(fā)明所述的西藏胡黃連的新應用，是將西藏胡黃連作為原料藥用于制備治療腎臟疾病的藥物。所述的腎臟疾病包括慢性腎臟疾病、糖尿病腎病、急性缺血再灌注導致的腎臟損傷。主要采用西藏胡黃連的根莖，也可采用西藏胡黃連植物的其他有效部位。
優(yōu)選的是采用西藏胡黃連的根莖的醇提取物?；蛘卟捎闷渌袡C溶劑提取，具有類似的藥效。
優(yōu)選的生產(chǎn)方法是將西藏胡黃連的根莖風干后粉碎成顆粒狀粉末，浸泡于50-95％乙醇或甲醇中，室溫過夜提純，過濾，蒸餾，經(jīng)冷凍干燥制成西藏胡黃連提取物。
所述西藏胡黃提取物的密度范圍為1.0005～1.0269g/ml。
本發(fā)明將西藏胡黃連用于制備治療腎臟疾病藥物時，藥物的劑型為藥劑學上允許的口服劑型。具體是將西藏胡黃連提取物經(jīng)過常規(guī)生產(chǎn)工藝，添加常規(guī)的口服劑型的輔料，制成片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、口服液等各種劑型。使用方法成人0.5～2g(以原料計)，2～3次/日，口服。兒童減半。
本發(fā)明所述的西藏胡黃連還可以與目前已知的其他治療腎臟疾病的藥，如黃芪等制成復方制劑，用于治療腎臟疾病。
本發(fā)明通過各種動物模型及實驗證明，西藏胡黃連對各種腎臟疾病均有確切的療效。由于西藏胡黃連來源方便、廣泛，提取物的制備方法簡單，不需要貴重儀器設備和試劑，因此本發(fā)明提供了一種簡便、價廉、高效的治療腎臟疾病的藥物。


圖1為5/6腎切除大鼠肌酐清除率與血清AOPP含量的相關分析圖。
圖2為5/6腎切除大鼠肌酐清除率與血清AGEs含量的相關分析圖。
圖3表示實時定量熒光PCR分析腎組織ICAM-1mRNA表達量。熒光定量操作系統(tǒng)所得數(shù)據(jù)結果Ct值(熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))按照2-ΔΔCt方法處理后進行分析比較。
圖4表示實時定量熒光PCR分析腎組織MCP-1mRNA表達量。熒光定量操作系統(tǒng)所得數(shù)據(jù)結果Ct值(熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))按照2-ΔΔCt方法處理后進行分析比較。
具體實施例方式
實施例一西藏胡黃連提取物的制備本發(fā)明所述的西藏胡黃連提取物是通過以下方法制備的取西藏胡黃連(生藥)的根莖，風干后機械粉碎成顆粒狀粉末(顆粒大小適中，約20mm3左右)。350g原料浸泡于50-95％乙醇2000ml中，置于搖床上(150轉/分)，室溫過夜提純，負壓過濾，蒸餾至少兩次，最后經(jīng)冷凍干燥制成胡黃連提取物醇提取物，密閉干燥保存。1g醇提取物相當于3.5g生藥。提取物的密度范圍為1.0005～1.0269g/ml。浸泡提取過程中所采用的有機溶劑也可采用其他醇類，如甲醇等。
實施例一中制備得到的西藏胡黃連提取物用于以下實施例中的實驗。
實施例二西藏胡黃連提取物延緩5/6腎切除大鼠慢性腎臟病的進展的實驗(一)材料與方法一、實驗動物分組雄性SD大鼠30只(南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，體重231.56±23.75g，隨機分為三組。胡黃連治療組(n＝10)和手術對照組(n＝10)，行5/6腎切除手術，0.3％戊巴比妥鈉35mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)背部切除左腎2/3，一周后切除右腎；假手術組(n＝10)，經(jīng)背切口暴露腎臟，牽拉腎臟撕裂腎包膜后，放回原位，縫合切口。第二次術后一周開始，胡黃連治療組給予胡黃連提取物灌胃(400mg/kg/d)，手術對照組和假手術組給與等體積生理鹽水灌胃。至第九周處死所有大鼠。處死前一天禁食，自由飲水，放置代謝籠收集24小時尿液。0.3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，用50ml生理鹽水從腹主動脈灌注腎臟，以去除循環(huán)中紅細胞；摘取左腎，部分用生理鹽水制作10％腎皮質(zhì)勻漿，部分固定。
二、尿、血清學指標檢測腹主動脈采血，3000r/min離心?？捡R斯蘭亮法[1]測24小時尿蛋白含量。用自動生化分析儀測定血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(Bun)、血肌酐(Scr)、尿肌酐，并計算肌酐清除率(Ccr)；DTNB法[2]測定血清硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)活性；硫代巴比妥酸反應法[3]測定尿液丙二醛(MDA)；競爭ELISA法測血清晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[4]；晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)測定參考文獻的方法[5]，以氯胺T為標準曲線，測定酸性條件下340nm處吸光度值。
參考文獻[1]Lott JA，Stephan VA，Pritchard KJEvaluation of the Coomassie Brilliant Blue G-250method for urinary protein[J].Clin Chem.1983，291946-1950[2]Flohe L，Gunzler WAAssays of glutathione peroxidase[J].Methods Enzymol.1984，105114-120 Obertop H，Malt RALost mass and excretion as stimuli to parabiotic compensatory renalhypertrophy[J].Am J Physiol.1977，232405-408[4]Hou FF，Boyce J，Chertow GM，Kay J，et al.Aminoguanidine inhibits advanced glycation endproducts formation on beta2-microglobulin[J].J Am Soc Nephrol.1998；9277-283[5]Yagi KA simle fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma.Biochem Med15212-216，1973三、病理形態(tài)學觀察部分腎組織經(jīng)4％中性福爾馬林緩沖液固定后，石蠟包埋切片，PAS、Masson染色行光鏡檢查，雙盲法觀察病理組織學改變。
腎小球硬化程度采用Reijis的半定量法(Raij L，Azar S，Keaue WMesangial immuneinjury，hypertention and progressive glomerular damage in Dahl rats[J].Kidney Int.198426137)，按腎小球的硬化面積分成0～4級。0級腎小球無硬化；1級腎小球硬化面積≤25％；2級26～50％；3級51％～75％；4級76％～全部腎小球硬化。腎小球硬化指數(shù)GI＝〔(1n1+2n2+3n3+4n4)/觀察腎小球總數(shù)〕×100％，n1、n2、n3和n4分別代表分級為1、2、3和4的腎小球數(shù)。
間質(zhì)病理損害程度的評定根據(jù)腎小管擴張、腎小管萎縮、腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管上皮細胞壞死、間質(zhì)纖維化機腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤程度分0～3分0分正常或病變面積＜25％；1分病變面積25％～50％；2分病變面積50％～75％；3分病變面積＞75％。
四、統(tǒng)計學方法采用SPSS 10.0版統(tǒng)計軟件包，正態(tài)分布計量資料用X±S表示。三組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較。尿丙二醛(MDA)排泄率，血清晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)、血清晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及血清硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)含量與肌酐清除率的關系采用雙變量相關分析。
(二)結果分析一、一般情況術后第九周胡黃連治療組大鼠體重及殘腎/體重與假手術組和手術對照組之間無顯著性差異，結果見表1。
表1 各組大鼠體重及殘腎重

注各組之間無顯著性差異二、腎功能及尿蛋白變化西藏胡黃連提取物能明顯減少5/6腎切除大鼠24小時尿蛋白含量(P＜0.01)，降低血清血尿素氮(Bun)，血肌酐(Scr)含量，升高肌酐清除率，但差異無顯著性。與假手術組相比，手術對照組大鼠血尿素氮(Bun)和血肌酐(Scr)水平明顯升高，肌酐清除率降低(P＜0.05)，24小時尿蛋白定量顯著升高(P＜0.01)，結果見表2。
表2 各組大鼠腎功能的變化

注與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與治療組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01三、腎臟病理改變西藏胡黃連提取物能明顯減輕5/6腎切除大鼠腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害程度，其半定量積分明顯低于手術對照組大鼠(P＜0.05)。與假手術組相比，手術對照組大鼠腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害程度顯著加重(P＜0.01)。見表3。
表3 各組大鼠腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)損害程度


注*與假手術組相比，P＜0.01；▲與治療組相比，P＜0.05四、氧化應激水平的改變與手術對照組相比，西藏胡黃連提取物能明顯升高5/6腎切除大鼠血清硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)活性(P＜0.05)，減少尿丙二醛(MDA)排泄率(P＜0.05)，明顯降低血清晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)、血清晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)水平(P＜0.05)。與假手術組相比，手術對照組大鼠血清硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)活性顯著降低(P＜0.05)，減少尿丙二醛(MDA)排泄率和血清晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)、血清晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)含量顯著升高(P＜0.01)，結果見表3。且肌酐清除率與血清晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)(r＝-0.483，P＜0.05)和血清晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)(r＝-0.686，P＜0.01)含量呈負相關。見圖1與圖2。
表4 各組大鼠尿MDA排泄率及血漿氧化應激指標的變化

注與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與治療組相比，▲P＜0.05結論本發(fā)明表明西藏胡黃連提取物能明顯減少5/6腎切除大鼠24小時尿蛋白含量，減輕5/6腎切除大鼠腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害程度，說明西藏胡黃連具有保護腎臟，延緩慢性腎臟疾病進展的作用。其機制可能與抑制慢性腎臟病時氧化應激有關。
實驗例三西藏胡黃連提取物對糖尿病大鼠的腎臟保護作用研究(一)材料和方法1、動物分組及標本留取清潔級雄性SD大鼠30只，體重120-140g(購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心)，適應性喂養(yǎng)3天后在3％戊巴比妥麻醉下行單腎摘除術，背部切口摘除左腎。7天后隨機取20只，禁食16小時后單次腹腔注射鏈脲佐菌素(用0.1mol/L，pH4.5的檸檬酸緩沖液新鮮配制)55mg/Kg，余8只腹腔注射等量檸檬酸緩沖液做為對照組，7天后測血糖＞16.7mmol/L為糖尿病。將成模大鼠按血糖及體重隨機分為糖尿病組8只，西藏胡黃連提取物處理組(300mg/Kg/d)8只，治療組每天上午予西藏胡黃連提取物灌胃，糖尿病組予等量雙蒸水灌胃。大鼠自由進食及飲水，治療8周后留取24小時尿及血漿，自腹主動脈用冰生理鹽水灌注腎臟，切除右腎，部分制作腎皮質(zhì)勻漿，部分中性甲醛固定24小時后脫水，浸蠟，包埋，部分固定于2.5％的戊二醛，樹脂包埋用于電鏡檢查。
2、腎功能和生化指標的檢測葡萄糖氧化酶法測血糖，全自動生化分析儀測定血肌酐(SCr)、血白蛋白(ALB)、膽固醇(CH)、甘油三酯(TG)、尿肌酐(UCr)，并計算肌酐清除率(CCr)尿肌酐×尿量/血肌酐/大鼠體重。血漿AOPP測定以氯胺T為標準曲線，測定酸性條件下340nm的吸光度值。DTNB法測定血清及腎勻漿硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)活性；硫代巴比妥酸反應法測定血清、尿液及腎勻漿丙二醛(MDA)；考馬斯亮藍法檢測24小時尿蛋白定量；比色法測尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)(上海太陽生物技術有限公司試劑盒)。
3、腎組織病理學分析腎組織石蠟切片2μm行PAS染色，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)對PAS染色切片進行分析，每張切片按順時針方向隨機取30個完整腎小球，經(jīng)分析系統(tǒng)計算每個腎小球PAS陽性染色面積與整個腎小球面積之比值，然后求30個腎小球此比值的均數(shù)，即為每張切片腎小球細胞外基質(zhì)的相對含量。電鏡下每組選取3只大鼠標本放大30萬倍照相，應用圖像分析系統(tǒng)測定基底膜厚度。
4、統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組數(shù)的比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計應用SPSS11.0軟件分析。
(二)結果分析1、西藏胡黃連提取物對大鼠體重及活動狀態(tài)的影響與對照組相比，糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，精神狀態(tài)差，體重均明顯減輕(p均＜0.01)，西藏胡黃連提取物治療可明顯改善大鼠的精神和活動，治療組大鼠體重減輕較未治療組少(p均＜0.05)。見表5。
表5西藏胡黃連提取物對各組大鼠體重、腎質(zhì)量指數(shù)、血糖、肌酐、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿蛋白、尿NAG酶、肌酐清除率的影響


dP＜0.05.cP＜0.01，vs NS group；eP＜0.05，fP＜0.01 vs DN group2、西藏胡黃連提取物對大鼠腎臟病理改變的影響糖尿病大鼠的腎臟均明顯增大，糖尿病組和西藏胡黃連提取物治療組腎臟質(zhì)量指數(shù)均明顯高于對照組(p均＜0.01)，但西藏胡黃連提取物治療可明顯降低糖尿病大鼠的腎質(zhì)量指數(shù)(p均＜0.01)。腎臟病理檢查則可見糖尿病大鼠的腎小球體積較對照組明顯增大，系膜基質(zhì)明顯增加。西藏胡黃連提取物治療可減輕腎小球體積的增大，減少系膜基質(zhì)沉積。電鏡檢查可見糖尿病大鼠腎小球基底膜明顯增厚，而西藏胡黃連提取物治療可明顯減輕基底膜的增厚。
3、西藏胡黃連提取物對大鼠腎臟功能的影響8周時糖尿病大鼠的24小時尿蛋白定量較對照組明顯升高，尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)亦明顯升高(p均＜0.01)，西藏胡黃連提取物治療可明顯降低糖尿病大鼠的尿蛋白及尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)(p＜0.05)。糖尿病大鼠的肌酐清除率較對照組明顯升高(p均＜0.05)，西藏胡黃連提取物治療8周對糖尿病大鼠的肌酐清除率無顯著影響。血肌酐各組之間無顯著差異。見表4。
4、西藏胡黃連提取物對大鼠血糖及血脂的影響西藏胡黃連提取物治療可明顯降低糖尿病大鼠的血糖，150mg/Kg劑量組下降18.88％，300mg/Kg劑量組下降26.67％，但未使之恢復正常。8周時糖尿病大鼠的血總膽固醇、甘油三酯均較對照組明顯升高，血漿白蛋白明顯下降(p均＜0.05)，西藏胡黃連提取物300mg/Kg治療可明顯降低糖尿病大鼠的總膽固醇，升高血漿白蛋白(p均＜0.05)，但對血甘油三酯未見顯著影響。見表4。
5、西藏胡黃連提取物對糖尿病大鼠體內(nèi)氧化產(chǎn)物及抗氧化酶含量的影響8周時糖尿病大鼠的血抗氧化酶指標GPx較對照組明顯下降(p均＜0.01)，血MDA、AOPP則較對照組明顯升高(p均＜0.01)，尿MDA排泄率均明顯升高(p均＜0.01)，腎勻漿MDA、GPx均明顯高于對照組。西藏胡黃連提取物治療可明顯降低糖尿病大鼠的血清AOPP、MDA水平，升高GPx水平，降低尿MDA排泄率，降低腎臟升高的MDA水平，改善GPx在腎臟的異常升高(p均＜0.05)。見表6。
表6西藏胡黃連提取物對血漿AOPP、MDA、GPx活性水平，腎勻漿MDA、GPx活性水平，尿MDA水平的影響。

dP＜0.05，cP＜0.01，vs NS group；eP＜0.05，fP＜0.01 vs DN group結論本發(fā)明首次證實了西藏胡黃連提取物可顯著降低糖尿病大鼠尿蛋白和尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)含量，升高血漿白蛋白，減輕糖尿病大鼠腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)增生，并降低糖尿病大鼠的血糖、總膽固醇，表明西藏胡黃連對糖尿病腎損害具有防治作用。
實驗例四西藏胡黃連提取物對急性缺血再灌注腎損傷的保護作用(一)材料和方法一、動物分組及給藥方法選取健康雄性SD大鼠，體重200～250g左右(南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院實驗動物中心提供)隨機分為以下各組(n＝8)1.假手術組；2.手術對照組(單純?nèi)毖?0min再灌注72h)手術前三天給大鼠灌胃2ml生理鹽水，連續(xù)3天，術前2h灌胃一次；3.胡黃連提取物不同劑量預防+治療組(40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg)手術前3天給大鼠灌胃胡黃連提取物，連續(xù)3天，術前2h灌胃一次，術后每天灌胃一次；4.胡黃連提取物預防組手術前3天給大鼠灌胃胡黃連提取物(160mg/kg)，連續(xù)3天，術前2h灌胃一次，術后不給藥；5.胡黃連提取物治療I組(早期給藥組)手術前不給藥，術后6h、30h各灌胃一次胡黃連提取物(160mg/kg)；6.胡黃連提取物治療II組(晚期給藥組)手術前不給藥，術后于30h、54h各灌胃一次胡黃連提取物(160mg/kg)。
二、缺血再灌注腎損傷大鼠動物模型的制備急性缺血再灌注腎損傷動物模型制備手術前將大鼠禁食12小時，按動作要領抓取大鼠，3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射，充分麻醉后固定于鼠板上，在無菌條件下取腹部正中切口切開皮膚，鈍性分離腹肌，切口約4-5cm。進入腹腔后，先暴露右腎，鈍性分離腎周脂肪及筋膜，游離出右腎動靜脈，用縫合線雙層結扎動靜脈，切除右腎。然后暴露左腎，鈍性分離腎周脂肪及筋膜，小心分離左腎動靜脈及其分支，用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈60min后打開動脈夾，觀察腎臟由蒼白變?yōu)轷r紅，表明再灌注成功?？p合傷口后在正常條件下喂養(yǎng)72h，自由進食水，在規(guī)定時間留取標本。假手術組暴露雙腎并分離腎周組織，不切除右腎及夾閉左腎動脈，其余處理同手術組。
三、標本的收集和處理在規(guī)定時間留取標本前24h將大鼠放入代謝籠，留取標本前12h禁食，先留取24h尿液，計算尿量，分裝后-70℃凍存。在規(guī)定時間將大鼠充分麻醉后固定于鼠板上，腹主動脈取血，組織灌注后取左腎，收集血標本30min內(nèi)4℃ 3000rpm離心10min，留取血清，分裝后-70℃凍存。取左腎組織腹面半個腎組織，下極楔型切除約0.3cm3，切成0.5-1mm3大小，立即放入2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定，剩余部分置于10％中性甲醛固定液中固定。稱取腎組織50mg，加入預冷的0.1M中性磷酸鹽緩沖液3ml，電動勻漿器研磨制備組織勻漿，鏡檢未見完整細胞.離心(2000rpm×10min，4℃)組織勻漿，取上清液-80℃保存?zhèn)溆?。另外半個腎組織立即將放入液氮凍存。
四、腎組織PAS染色觀察腎組織形態(tài)學改變腎組織用10％中性甲醛固定液固定18小時以上后，經(jīng)梯度乙醇脫水75％乙醇5min×3次→85％乙醇10min→85％乙醇+伊紅10min→95％乙醇10min×2次→無水乙醇10min×2次，二甲苯透明3min×2次，浸臘(軟蠟60℃、30min→硬蠟60℃、60min)，包埋蠟塊，切2υm切片，75℃烤片45min。組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至入水。2％高碘酸15min→水洗→Schiff液50min→水洗→蘇木素復染15min→0.5％鹽酸-乙醇→水洗分化→流水反藍→梯度乙醇脫水→二甲苯透明后封片。光學顯微鏡下觀察照相。并在顯微鏡下根據(jù)Paller氏法評定腎小管損傷分數(shù)10×20倍光鏡下組織切片隨機選取左上、左下、右上、右下及正中10個視野，每個視野觀察10個腎小管，按照以下標準計分腎小管上皮細胞胞漿空泡樣變性計1分，小管上皮細胞扁平計1分，刷狀緣脫落計1分，上皮細胞壞死計2分，各種管型計2分，間質(zhì)水腫計1分。
五、腎組織電鏡下觀察腎組織形態(tài)學改變腎組織(0.5-1mm3大小)在2.5％戊二醛中前固定12小時以上，0.1MPB磷酸鹽緩沖液漂洗(PH 7.4)15min×5次，1％鋨酸(0.24M PH 7.4)后固定1.5小時，固定后用緩沖液洗15min×3次；30％、50％、70％、90％丙酮逐級脫水每次15min，100％丙酮脫水3次，每次15分鐘，包埋劑∶丙酮＝1∶1浸透1小時，包埋劑(spur)∶丙酮＝1∶2浸透2小時，純樹脂浸透3小時后包埋，60℃聚合24小時后，修塊，AO型切片機切成60mm切片，選取呈銀灰或黃色的超薄切片，醋酸雙氧鈾染色30分鐘，枸櫞酸鉛染色10-15分鐘，H-600電子顯微鏡觀察。
六、生化法檢測血肌酐、尿肌酐留取血、尿標本送南方醫(yī)院檢驗科，用東芝全自動生化分析儀直接檢測，并結合尿量計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。Ccr＝尿肌酐/血肌酐×24尿量/1440(ml/min)七、腎組織勻漿和血漿TBARS檢測采用硫代巴比妥酸反應法，以四乙氧基丙烷為標準，標準應用液的濃度為10nmol/ml。
結果計算MDA濃度＝f/F×10(nmol/ml)f由樣本液測得的光密度F由標準液測得的光密度八、腎組織勻漿和血漿GSHPx檢測改良DNTB比色法。
分光光度計于423nm波長處測定各管吸光度A，單位定義以每毫升血清于37℃每分鐘使GSH濃度下降1μmol為一個酶活力單位。結果計算血清GSHPx活力(U/ml)＝(A非酶管-A測定管)A非酶管×100/3九、免疫組織化學檢測腎組織ICAM-1、MCP-1和單核巨噬細胞計數(shù)取石蠟組織切5μm切片，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水化。室溫下用3％過氧化氫孵育10min以滅活內(nèi)原酶，用雙蒸水洗2min×3次。將切片浸入枸櫞酸緩沖液中，加熱至96～100℃持續(xù)20min，室溫下冷卻。用PBS洗5min×3次。滴加1∶50正常山羊血清封閉液，室溫下孵育20min。滴加1∶150稀釋的兔抗鼠ICAM-1、MCP-1抗體，滴加1∶50稀釋的兔抗鼠ED-1抗體，以非免疫兔IgG做陰性對照，切片置于濕盒內(nèi)，放入4℃冰箱過夜。用PBS洗5min×3次，滴加羊抗兔-Evision二抗，37℃孵育30min。用雙蒸水洗5min×3次，DAB顯色5～10min，顯微鏡下觀察，用雙蒸水沖洗終止呈色反應。蘇木素復染1min，0.5％鹽酸-乙醇分化，溫水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。顯微鏡下觀察照相。腎組織ICAM-1、MCP-1免疫組化結果半定量積分評價根據(jù)染色范圍進行分析評定著色范圍參照Hugo標準，陰性為0分，著色范圍≤25％為1分，＞25％≤50％為2分，＞50％≤75％為3分，＞75％為4分。單核巨噬細胞計數(shù)采用目鏡網(wǎng)格測位尺，即在光鏡400倍下(網(wǎng)格測位尺面積25×25um2/網(wǎng)格)隨機選取10個視野，計數(shù)所有陽性細胞數(shù)并取其平均值作為分析指標。
十、實時定量熒光PCR測定腎組織ICAM-1、MCP-1mRNA表達十一、統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多個樣本均數(shù)的比較用One-Way ANOVA，多重比較采用LSD檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計由SPSS統(tǒng)計軟件11.5完成。
(二)結果分析一、急性缺血再灌注腎損傷大鼠動物模型的建立SD大鼠切除右腎無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈60min再灌注72h后，血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)顯著升高，尿肌酐(Ccr)降低，肌酐清除率下降，尿滲量降低，尿NAG酶升高。肉眼觀察左腎腫大明顯，重量增加，皮質(zhì)缺血；鏡下觀察腎皮髓質(zhì)交界處腎小管變性壞死明顯，證明造模成功。
二、西藏胡黃連提取物對缺血再灌注后腎組織形態(tài)變化的影響1.光鏡下缺血再灌注72h后，西藏胡黃連提取物各給藥組與手術對照組均可見皮髓交界處腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、上皮細胞變性、壞死、脫落，小管腔內(nèi)管型形成，間質(zhì)水腫等病理改變，但各給藥組腎組織病理改變輕于手術對照組。各預防+治療組小管間質(zhì)評分均低于手術對照組(P均為0.000)(表7)，隨給藥劑量的增加，腎組織病理改變逐漸減輕，小管間質(zhì)評分下降，各劑量預防+治療組之間小管間質(zhì)評分有顯著性差異(各劑量組之間P均為0.000)。預防組、治療1組、治療II組腎小管損傷分數(shù)均低于手術對照組(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.019)，預防組、治療I組、治療II組腎小管損傷分數(shù)高于預防+治療160mg/kg組(P＝0.02 P＝0.003 P＝0.000)，預防組、治療I組小管間質(zhì)評分數(shù)低于治療II組(P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.479)。
2.電鏡下西藏胡黃連提取物各給藥組與手術對照組均可見腎小管上皮細胞微絨毛腫脹、脫落，線粒體腫脹，嵴空泡變性、甚至消失，胡黃連提取物給藥組的病變較手術對照組減輕。
表7 各組大鼠腎小管間質(zhì)評分

△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05；One-Way ANOVA F值＝161.391，P＝0.000三、西藏胡黃連提取物對缺血再灌注后腎功能變化的影響與假手術組相比，缺血再灌注引起Scr升高，Ccr下降。各預防+治療組Ccr高于手術對照組(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.013)(表8)，并且隨給藥劑量的增加，Ccr逐漸升高，預防+治療160mg/kg組與預防+治療40mg/kg組之間有顯著性差異(P＝0.013)，預防+治療160mg/kg組與預防+治療80mg/kg組之間無顯著性差異(P＝0.054)；預防組、治療I組、治療II組Ccr高于手術對照組(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.003)；預防組、治療I組、治療II組與預防+治療160mg/kg組之間Ccr無顯著顯著性差異(P＝0.948 P＝0.732 P＝0.094)。
表8 各組大鼠Ccr變化


△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05；One-Way ANOVA F值＝13.952，P＝0.000四、西藏胡黃連提取物對缺血再灌注后氧化應激指標的影響1、西藏胡黃連提取物對腎組織和血漿TBARS的影響與假手術組相比，缺血再灌注引起腎組織和血漿TBARS升高，給予胡黃連提取物后，各預防+治療組腎組織勻漿TBARS含量低于手術對照組(P均為0.000)(表9)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，腎組織勻漿TBARS含量逐漸降低，各劑量預防+治療組之間腎組織勻漿TBARS含量有顯著性差異(各劑量組之間P均為0.000)；預防組、治療I組腎組織勻漿TBARS低于手術對照組(P＝0.008 P＝0.033)，治療II組腎組織勻漿TBARS與手術對照組無顯著性差異(P＝0.190)，預防組、治療I組、治療II組腎組織勻漿TBARS高于預防+治療160mg/kg組(P均為0.000)，預防組、治療I組、治療II組三組之間無顯著性差異(P＝0.563 P＝0.184 P＝0.433)。給予胡黃連提取物后，各預防+治療組血漿TBARS含量低于手術對照組(P均為0.000)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，血漿TBARS含量逐漸降低，預防+治療160mg/kg組與預防+治療40mg/kg組之間有顯著性差異(P＝0.000)，預防+治療160mg/kg組與預防+治療80mg/kg組之間無顯著性差異(P＝0.404)；預防組、治療I組、治療II組血漿TBARS低于手術對照組(P均為0.000)，預防組、治療I組、治療II組血漿TBARS高于預防+治療160mg/kg組(P均為0.000)，預防組、治療I組血漿TBARS低于治療II組(P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.855)。
表9 各組大鼠血漿和腎組織TBARS水平


△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05。One-Way ANOVA，P＝0.0002、西藏胡黃連提取物對腎組織和血漿GSHPx的影響與假手術組相比，缺血再灌注引起腎組織和血漿GSHPx降低，給予胡黃連提取物后，各預防+治療組腎組織勻漿GSHPx含量高于手術對照組(P均為0.000)(表10)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，腎組織勻漿GSHPx含量逐漸升高，預防+治療160mg/kg組腎組織勻漿GSHPx含量高于預防+治療80mg/kg組和預防+治療40mg/kg組(P＝0.049P＝0.000)，預防+治療80mg/kg組與預防+治療40mg/kg組之間無顯著差異(P＝0.083)；預防組、治療I組腎組織勻漿GSHPx高于手術對照組(P均為0.000)，治療II組腎組織勻漿GSHPx與手術對照組無顯著性差異(P＝0.284)，預防組、治療I組、治療II組腎組織勻漿GSHPx低于預防+治療160mg/kg組(P＝0.005 P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組腎組織勻漿GSHPx高于治療II組(P＝0.01 P＝0.008)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.929)。給予胡黃連提取物后，各預防+治療組血漿GSHPx含量高于手術對照組(P均為0.000)(表10)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，血漿GSHPx含量逐漸降低升高，各劑量預防+治療組之間血漿GSHPx含量無顯著性差異(P＝0.424 P＝0.206 P＝0.667)；預防組、治療I組、治療II組血漿GSHPx低于手術對照組(P均為0.000)，預防組、治療I組、治療II組血漿GSHPx與預防+治療160mg/kg組無顯著性差異(P＝0.403 P＝0.114 P＝0.082)，預防組、治療I組血漿GSHPx高于治療II組(P＝0.013 P＝0.002)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.448)。
表10 各組血漿和腎組織勻漿GSHPx活性


△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05。One-Way ANOVA，P＝0.000五、西藏胡黃連提取物對缺血再灌注后炎癥反應參數(shù)1.西藏胡黃連提取物對腎組織ICAM-1蛋白表達的影響假手術組腎臟組織ICAM-1未見明顯表達，手術對照組腎臟ICAM-1表達明顯，主要位于皮髓交界處的腎小管及間質(zhì)，近曲及遠曲小管均見陽性染色，腎小球表達不明顯；胡黃連提取物給藥組腎臟ICAM-1陽性染色明顯弱于手術對照組。半定量結果顯示，胡黃連提取物160mg/kg、80mg/kg預防+治療組ICAM-1組化評分低于手術對照組(P＝0.000P＝0.000)，40mg/kg預防+治療組ICAM-1組化評分與手術對照組無顯著性差異(P＝0.188)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，ICAM-1組化評分逐漸降低，各劑量組之間有顯著性差異(各劑量組之間P＝0.000)(表11)。預防組、治療I組ICAM-1組化評分低于手術對照組(P＝0.000P＝0.000)，治療II組ICAM-1組化評分與手術對照組無顯著性差異(P＝0.147)，預防組、治療I組、治療II組ICAM-1組化評分高于160mg/kg預防+治療組(P均為0.000)，預防組、治療I組ICAM-1組化評分低于治療II組I(P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.249)。
表11 腎組織ICAM-1組化評分


△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05。One-Way ANOVA，F(xiàn)值＝279.988，P＝0.0002西藏胡黃連提取物對腎組織MCP-1蛋白表達的影響假手術組腎臟組織MCP-1未見明顯表達，手術對照組腎臟MCP-1表達明顯，主要位于皮髓交界處的腎小管及間質(zhì)，近曲及遠曲小管均見陽性染色，腎小球表達不明顯；胡黃連提取物給藥組腎臟MCP-1陽性染色明顯弱于手術對照組。半定量結果顯示，胡黃連提取物各預防+治療組MCP-1組化評分低于手術對照組(P均為0.000，見表11)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，MCP-1組化評分逐漸降低，各劑量組之間有顯著性差異(各劑量組之間P＝0.000)。預防組、治療I組MCP-1組化評分低于手術對照組(P＝0.000)，治療II組MCP-1組化評分與手術對照組無顯著性差異(P＝0.298)，預防組、治療I組、治療II組MCP-1組化評分高于160mCkg預防+治療組(P均為0.000)，預防組、治療I組MCP-1組化評分低于治療II組I(P＝0.000 P＝0.000)，預防組MCP-1組化評分低于治療I組(P＝0.000)。
表11 各組大鼠腎組織MCP-1免疫組化評分

△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05。One-Way ANOVA F值＝233.881，P＝0.000
3西藏胡黃連提取物對腎組織ICAM-1mRNA表達的影響FQ-RT-PCR結果顯示，假手術組大鼠腎組織ICAM-1mRNA表達量很低，手術對照組腎組織ICAM-1mRNA表達明顯上調(diào)，各胡黃連提取物預防+治療組ICAM-1mRNA低于手術對照組(P均為0.000，見圖3、圖4)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，腎組織ICAM-1mRNA表達量逐漸降低，各劑量組之間有顯著性差異(各劑量組之間P＝0.000)。預防組、治療I組、治療II組ICAM-1mRNA表達量低于手術對照組(P均為0.000)，預防組、治療I組、治療II組ICAM-1mRNA表達量高于160mg/kg預防+治療組(P均為0.000)，預防組ICAM-1mRNA表達量低于治療I組、治療II組(P＝0.000 P＝0.000)，治療I組、治療II組之間無顯著性差異(P＝0.273，見表12)。
表12 各組大鼠腎組織ICAM-1mRNA的變化

*與假手術組比較P＜0.01；#與手術對照組比較P＜0.01。
4、西藏胡黃連提取物對腎組織MCP-1mRNA表達的影響FQ-RT-PCR結果顯示，假手術組大鼠腎組織MCP-1mRNA表達量很低，手術對照組腎組織MCP-1mRNA表達明顯上調(diào)，各胡黃連提取物預防+治療組MCP-1mRNA低于手術對照組(P均為0.000，見圖3、圖4)，隨著胡黃連提取物劑量的增加，腎組織MCP-1mRNA表達量逐漸降低，各劑量組之間有顯著性差異(各劑量組之間P＝0.000)。預防組、治療I組、治療II組MCP-1mRNA表達量較手術對照組降低(P均為0.000)，預防組、治療I組、治療II組MCP-1mRNA表達量高于160mg/kg預防+治療組(P＝0.035 P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組MCP-1mRNA表達量低于治療II組(P＝0.000)，預防組MCP-1mRNA表達量低于治療I組(P＝0.000，見表13)。
表13 各組MCP-1mRNA的變化

*與假手術組比較P＜0.01；#與手術對照組比較P＜0.015、西藏胡黃連提取物對腎組織巨噬細胞浸潤程度的影響免疫組化結果顯示，假手術組幾乎未見巨噬細胞浸潤，缺血再灌注后各組腎組織均可見明顯巨噬細胞浸潤，給予胡黃連提取物后，各預防+治療組巨噬細胞數(shù)目少于手術對照組(P均為0.000，見表14)。隨著胡黃連提取物劑量的增加，腎組織中巨噬細胞數(shù)目逐漸減少，各劑量組之間有顯著性差異(各劑量組之間P＝0.000)。預防組、治療I組巨噬細胞數(shù)目少于手術對照組(P＝0.000 P＝0.000)，治療II組巨噬細胞數(shù)目與手術對照組無顯著性差異(P＝0.180)，預防組、治療I組、治療II組巨噬細胞數(shù)目多于預防+治療160mg/kg組(P均為0.000)，治療II組巨噬細胞數(shù)目多于預防組、治療I組(P＝0.000 P＝0.000)，預防組、治療I組之間無顯著性差異(P＝0.086)。
表14 腎組織巨噬細胞計數(shù)


△與假手術組相比P＜0.01；▲與缺血再灌注組相比P＜0.01；●與缺血再灌注組相比P＜0.05。One-Way ANOVA，F(xiàn)值＝144.255，P＝0.000結論胡黃連提取物呈劑量依賴關系保護缺血再灌注腎損傷，且預防性或早期給予胡黃連提取物的保護作用較后期給藥明顯，其作用機制與抗氧化和抑制炎癥反應作用有關。
實施例三以西藏胡黃連配制的口服劑型本發(fā)明所述的西藏胡黃連可以配制成片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、口服液等口服劑型。
(一)制成片劑將西藏胡黃連經(jīng)醇提后的提取物，加入適量潤滑劑制成軟材，用10目篩制粒，干燥，干粒加入硬脂酸鎂，混勻，壓片機壓片成片劑，薄膜包衣，分裝，即得包衣片劑。
(二)制成膠囊劑將西藏胡黃連經(jīng)醇提后的提取物，噴霧干燥制成粉末，過100-120目左右篩，與輔料混合均勻，裝膠囊，分裝，即得膠囊劑。
(三)制成顆粒劑將西藏胡黃連經(jīng)醇提后的提取物，加入賦形劑，制粒，干燥，過8-10目篩，分裝，制成顆粒劑。
(四)制成散劑將西藏胡黃連粉碎，加入適量賦形劑后混勻，分裝，制成散劑。
(五)制成口服液將西藏胡黃連經(jīng)醇提后的提取物，加水溶解，加入矯味劑，加水調(diào)節(jié)容量，制成口服液。
(六)使用方法成人0.5～2g(以原料計)，2～3次/日，口服。兒童減半。
權利要求
1.西藏胡黃連在制備治療腎臟疾病藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的腎臟疾病包括慢性腎臟疾病、糖尿病腎病、急性缺血再灌注導致的腎臟損傷。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于采用西藏胡黃連的根莖的醇提取物。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的應用，其特征在于采用將西藏胡黃連的根莖風干后粉碎成顆粒狀粉末，浸泡于50-95％乙醇或甲醇中，室溫過夜提純，過濾，蒸餾，經(jīng)冷凍干燥制成的西藏胡黃連提取物。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述西藏胡黃連提取物的密度范圍為1.0005～1.0269g/ml。
6.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于藥物的劑型為藥劑學上允許的口服劑型。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述的口服劑型包括片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、散劑。
8.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于采用西藏胡黃連與其他治療腎臟疾病的藥制成復方制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及西藏胡黃連的新用途，具體是西藏胡黃連在制備治療腎臟疾病藥物中的應用。本發(fā)明所述的腎臟疾病包括慢性腎臟疾病、糖尿病腎病、急性缺血再灌注導致的腎臟損傷。采用西藏胡黃連的根莖的醇提取物。藥物的劑型為藥劑學上允許的口服劑型。本發(fā)明通過各種動物模型及實驗證明，西藏胡黃連對各種腎臟疾病均有確切的療效。由于西藏胡黃連來源方便、廣泛，提取物的制備方法簡單，不需要貴重儀器設備和試劑，因此本發(fā)明提供了一種簡便、價廉、高效的治療腎臟疾病的藥物。
文檔編號A61P13/00GK1943671SQ20061003718
公開日2007年4月11日 申請日期2006年8月24日 優(yōu)先權日2006年8月24日
發(fā)明者劉尚喜, 侯凡凡, 梁敏 申請人:南方醫(yī)科大學