專利名稱：一種減輕藥物心臟毒性的甘草提取物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥提取物，涉及從中藥甘草中提取的糖苷類物質(zhì)，主要包括黃酮苷和三萜皂苷成分，該提取物與蒽環(huán)類抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時，能夠減輕其心臟毒性，同時并不減弱蒽環(huán)類抗腫瘤藥物(如阿霉素)的抗腫瘤效果。

背景技術(shù)：
自1957年分離出第一個蒽環(huán)類抗癌藥柔紅霉素(Daunorubicin)以來，蒽環(huán)類抗癌藥已經(jīng)成為臨床上廣泛使用的一類化療藥物。阿霉素(Doxorubicin，DXR；Adriamycin，ADM)自70年代進入臨床試驗以后，因具有抗瘤譜廣、臨床療效好等顯著特點、尤其對乏氧腫瘤細胞有效，已成為蒽環(huán)類抗癌藥的代表藥物。ADM對多種腫瘤有效，包括血液系統(tǒng)腫瘤、惡性淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、頭頸部腫瘤和骨軟組織腫瘤等。ADM價格低廉，療效-費用比較高，是當(dāng)前臨床上常用的抗腫瘤藥物之一。但由于其主要毒副反應(yīng)心臟毒性的限制，尤其是劑量累積性心臟毒性，嚴(yán)重限制了其在臨床上的廣泛和長期使用。
目前，已發(fā)現(xiàn)了多種阿霉素結(jié)構(gòu)類似物。如臨床得到廣泛使用的吡柔比星和表阿霉素心臟毒性均低于阿霉素。而阿霉素通過劑型改變，如制成脂質(zhì)體阿霉素，也可有效降低毒性。但是，這些藥物價格較高，且并不能完全克服心臟毒性的問題，臨床使用劑量仍然受到限制。
最近，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了右雷佐生(dexrazoxane)作為化學(xué)保護劑能有效地預(yù)防蒽環(huán)類抗腫瘤藥物如阿霉素等誘發(fā)的心臟毒性，且不影響化療藥物的抗腫瘤活性。它通過在細胞內(nèi)水解成螯合劑，與鐵離子結(jié)合，干擾Fe3+-蒽環(huán)類藥螯合物的形成，進而降低了氧自由基產(chǎn)生。此外，右雷佐生也抑制了這類螯合物對心脂質(zhì)的過氧化，因而對心臟具有獨特的保護作用。該藥現(xiàn)已在北美和歐洲國家上市，主要用于晚期乳腺癌患者。該品作為唯一上市的對蒽環(huán)類抗腫瘤化學(xué)藥品心臟毒性有預(yù)防作用的保護劑，已在臨床上取得了顯著的療效。但是，右雷佐生的用藥劑量很大，通常是阿霉素的10倍，而且有一定的腎毒性。如果采用右雷佐生與阿霉素合并給藥的方案，病人的經(jīng)濟負擔(dān)將提高5-10倍。因此，開發(fā)新的抗阿霉素毒性心臟保護劑具有現(xiàn)實意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種減輕藥物心臟毒性的甘草提取物，該提取物來源于豆科植物甘草，如烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(G.Inflata Bat.)及光果甘草(G.Glabra L.)的干燥根及根莖。其主要活性成分為三萜皂苷和黃酮糖苷類物質(zhì)，其中三萜皂苷類成分的含量在10～30％，黃酮類成分含量在25～80％。
本發(fā)明的另一個目的是提供甘草提取物在制備減輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的甘草提取物與蒽環(huán)類抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時，能夠減輕其心臟毒性，同時并不減弱蒽環(huán)類抗腫瘤藥物(如阿霉素)的抗腫瘤效果。體內(nèi)、外實驗研究證明，甘草總黃酮對阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷有顯著的保護效果，同時并不減弱蒽環(huán)類抗腫瘤藥物(如阿霉素)的抗腫瘤效果?？梢杂糜陬A(yù)防和減輕蒽環(huán)類藥物心臟毒性，從而擴大阿霉素的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明提供的甘草提取物，可以添加到其它藥物中，組合成新的放化療輔助藥物。該提取物可以制成片劑、膠囊、口服液、顆粒劑、滴丸及其他口服劑型；經(jīng)過精制處理，也可制成經(jīng)皮下、肌肉或靜脈給予的注射劑。
甘草是最常用的中藥之一?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明，甘草具有抗炎、保肝、強心、抗腫瘤、增強免疫功能等作用。但迄今沒有抗阿霉素心臟毒性作用方面的報道。此外，甘草提取物除了黃酮類成分具有直接對抗阿霉素引起的心臟毒性外，尚含有以甘草酸為代表的三萜皂苷類成分，后者不但具有抗炎作用，而且能減輕化學(xué)性肝損傷。以甘草酸為主要藥效成分的制劑已應(yīng)用于防治化療引起的肝毒性。由于目前化療普遍采用多種藥物聯(lián)合治療的方案，故甘草提取物在減輕阿霉素心臟毒性的同時，可能還同時能減輕其他化療藥物造成的機體損傷。
本發(fā)明的有益之處是提供了一種口服有效的抗蒽環(huán)類抗腫瘤藥心臟毒性的保護劑，尤其是抗阿霉素心臟毒性的保護劑，從而提高阿霉素的療效，擴大其臨床應(yīng)用的范圍，幫助患者減輕由此帶來的毒副作用。本發(fā)明首次提供了一個從甘草中獲得的口服有效的心臟保護劑，在減輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的心臟毒性的同時，并不減弱其抗腫瘤效果，從而也能夠減輕患者經(jīng)濟負擔(dān)。

具體實施例方式 為了更好地理解本發(fā)明，以下結(jié)合實施例作進一步的說明。
實施例1 甘草藥材用10倍量70％乙醇提取兩次，每次1.5小時。濃縮至無醇后，D101樹脂分離，以三個柱體積的水沖洗，然后以70％乙醇沖洗，收集流出物，濃縮干燥，即甘草總苷提取物，得率10.8％。以甘草苷為對照品，采用紫外-分光光度法測定，提取物總黃酮含量在25.8％。按照《中國藥典2005年版一部》的規(guī)定，以甘草酸為對照品，經(jīng)HPLC法測定，甘草酸含量為15.1％。
實施例2 甘草藥材用8倍量水煮沸回流提取兩次，每次1.5小時。合并后冷卻，加乙醇至60％，醇沉過夜，離心取上清，濃縮至無醇后，AB-8樹脂分離，依次以三個柱體積的水和20％乙醇沖洗，然后以80％乙醇沖洗，收集流出物，濃縮干燥，即甘草總苷提取物，得率9.2％。以甘草苷為對照品，采用紫外-分光光度法測定，提取物總黃酮含量在33.4％。按照《中國藥典2005年版一部》的規(guī)定，以甘草酸為對照品，經(jīng)HPLC法測定，甘草酸含量為25.5％。
實施例3 甘草藥材用6倍量水煮沸回流提取三次，每次1.5小時。合并后冷卻，濃縮成清膏，上D101大孔吸附樹脂，先用三個柱體積的水和20％乙醇洗脫，然后用70％乙醇沖洗，收集流出物，濃縮干燥，即甘草總苷提取物，得率8.4％。以甘草苷為對照品，采用紫外-分光光度法測定，提取物總黃酮含量在68.4％。按照《中國藥典2005年版一部》的規(guī)定，以甘草酸為對照品，經(jīng)HPLC法測定，甘草酸含量為17.5％。
實施例4 大鼠心肌細胞系H9C2，種入96孔板。細胞密度1×105個/孔。以DMEM+10％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，進行藥物處理。分別設(shè)對照組，模型組(含1μM鹽酸阿霉素)，以及不同濃度(0.1，0.5，1，5，10，50，100μg/ml)的甘草提取物(在加入阿霉素前30min加入)。培養(yǎng)24小時后，以MTT法進行測定，以550nm比色值反映心肌細胞活力。實驗表明，1μM鹽酸阿霉素能造成心肌細胞活力降低23.4％(P＜0.01)，而甘草提取物1～50μg/ml的濃度預(yù)先給藥，顯示一定的保護作用，細胞活力相對于模型組提高11.2～14.2％，其中10，50μg/ml的濃度下，具有顯著性差異(P＜0.01)。說明甘草總苷提取物在體外實驗中能預(yù)防和減輕阿霉素導(dǎo)致的心肌細胞損傷。
實施例5 40只ICR雄性小鼠，體重20±2g，共分為4組，每組10只。腋下接種小鼠肝癌瘤株H22(3×105個細胞/只)。接種后第2天分組。設(shè)對照組，每日灌胃給予生理鹽水，第5天和第6天給予0.2ml生理鹽水；阿霉素治療組，每日灌胃給予生理鹽水，在接種后第5天和6天，分別注射阿霉素7.5mg/kg(i.p.)；甘草提取物處理組，每日灌胃給予(如實施例1描述的)甘草提取物100mg/Kg，第5天和第6天同法給予阿霉素，之前30min分別提前給予甘草提取物。甘草對照組，每日灌胃給予甘草提取物100mg/Kg，第5天和第6天給予等體積生理鹽水代替阿霉素。動物在接種腫瘤后第10天，用戊巴比妥麻醉后，固定，打開胸腔，用22號針頭插入左心室，連接壓力傳感器，以生理記錄儀進行監(jiān)控。記錄心率、最大心室內(nèi)壓、最小心室內(nèi)壓、心室內(nèi)壓上升最大速率等數(shù)據(jù)。解剖取出肉瘤和心臟稱重。
如表1所示，動物給予阿霉素后，心率，左心室峰壓，心室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)和最大降壓速率(-dp/dtmax)均顯著降低，而心室舒張期末壓顯著升高。說明心臟做功能力嚴(yán)重削弱。事先給予甘草提取物后，各項指標(biāo)明顯改善，說明對心功能具有保護作用。如表2所示，阿霉素的抑瘤率為47.2％，同時給予甘草提取物，抑瘤率沒有明顯變化，說明甘草提取物并不影響阿霉素的抗腫瘤作用。
表1甘草提取物對阿霉素致心功能降低的保護作用
aa，與正常對照組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；a，與正常對照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
bb，與模型組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；b，與模型照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
表2甘草提取物對阿霉素抗腫瘤作用的影響
aa，與正常對照組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；a，與正常對照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
實施例6 40只ICR雄性小鼠，體重30±2g，共分為4組，每組8只。設(shè)正常對照組，每日灌胃給予生理鹽水，連續(xù)5天，第5天腹腔注射0.2ml生理鹽水；阿霉素造模組，每日灌胃給予生理鹽水，連續(xù)5天，第5天腹腔注射阿霉素20mg/kg；甘草處理組，每日灌胃給予(如實施例2描述的)甘草提取物100mg/Kg，連續(xù)5天，第5天給予甘草提取物1h后腹腔注射20mg/kg阿霉素；甘草對照組，每日灌胃給予甘草提取物100mg/Kg，連續(xù)5天，第5天給予甘草提取物1h后腹腔注射等體積生理鹽水代替阿霉素。48h后，下腔靜脈取血，得血清測定生化指標(biāo)乳酸脫氫酶(LDH)、激酸激酶(CK)和激酸激酶同功酶(CKMB)；另取心臟勻漿得5％組織勻漿，測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)及蛋白含量。
表3甘草提取物對阿霉素致心肌損傷的保護作用
aa，與正常對照組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；a，與正常對照組相比，具有顯著差異P＜0.05； bb，與模型組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；b，與模型照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
如表3所示，大劑量阿霉素導(dǎo)致血清心肌酶譜指標(biāo)成倍上升，說明心肌組織受到嚴(yán)重損傷。其中CK-MB在心肌組織中特異性表達，升高了3倍左右。心肌組織中SOD，GSH-Px，CAT等指標(biāo)顯著下降，說明心肌組織抗氧化能力受到明顯削弱。事先給予100mg/kg甘草提取物，相對于阿霉素處理組，LDH、CK和CK-MB水平分別降低34％(P＜0.05)、26％(P＞0.05)和25％(P＜0.05)。而組織中抗氧化酶活均有一定上升。尤其是SOD和GSH-Px與模型組相比，提高了24％和42％(p＜0.01)。說明甘草提取物能夠提高心肌組織抗氧化酶活力，同時減輕心肌組織的損傷。也進一步說明甘草提取物對阿霉素心臟毒性具有保護作用。
實施例7 清潔級ICR小鼠，雄性，體重30±2g。小鼠隨機分組，設(shè)正常對照組，阿霉素模型組，甘草總苷灌胃組和甘草總苷注射組。給藥及造模方案正常對照組每日按0.02ml·g-1體積灌胃生理鹽水一次；模型組連續(xù)4天灌胃等量生理鹽水，第4天靜脈注射20mg/kg鹽酸阿霉素溶液；(如實施例3所描述)甘草總苷灌胃組連續(xù)3天按0.02mg/kg體積灌胃100mg/kg甘草總苷，第4天動物禁食4h后灌胃給予甘草總苷，30min后靜脈注射20mg/kg鹽酸阿霉素溶液；甘草總苷注射組連續(xù)4天灌胃等量生理鹽水，第4天腹腔注射甘草總苷200mg/kg，30min后靜脈注射20mg/kg鹽酸阿霉素溶液。96h后用50mg/kg戊巴比妥麻醉。將連接壓力換能器的靜脈輸液針從心室外刺入左心室內(nèi)，記錄左心室內(nèi)壓變化曲線。
表4甘草總苷不同給藥方式對小鼠心功能的保護作用
注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01 試驗結(jié)果說明，甘草總苷通過多次口服給藥和單次腹腔注射均能發(fā)揮心臟保護作用。因此可以開發(fā)成口服制劑或注射制劑。
實施例8 清潔級ICR小鼠，雄性，體重25±2g。小鼠隨機分組，設(shè)正常對照組，阿霉素模型組，甘草總苷不同劑量干預(yù)組。給藥及造模方案(如實施例3所描述)甘草總苷分別以25、50、100、200mg/kg的劑量提前3天給藥，每日按0.02ml/g體積灌胃給藥一次，在阿霉素靜注當(dāng)日，動物事先禁食4h，然后灌胃給藥，30min后靜脈注射15mg/kg鹽酸阿霉素溶液，模型組事先給予等量生理鹽水灌胃，靜脈注射15mg/kg鹽酸阿霉素溶液。72h后動物用50mg/kg戊巴比妥麻醉。將連接壓力換能器的靜脈輸液針從心室外刺入左心室內(nèi)，記錄左心室內(nèi)壓變化曲線。解剖取心臟稱重。
表5甘草總苷不同給藥劑量對小鼠心功能的保護作用
注與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01 試驗表明，甘草總苷在25～200mg/kg的范圍內(nèi)，對阿霉素引起的心臟功能損傷的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性，100mg/kg可視為最低有效劑量。
實施例9 取實施例1描述的甘草總苷，用生理鹽水配制成濃度約為0.4g/ml的稠膏。以動物允許的最大單次灌胃體積(0.4ml/10g)給藥，受試動物在12h內(nèi)全部死亡；灌胃體積減少至0.3ml/10g，受試動物在14天內(nèi)死亡率為75％；灌胃體積減少至0.25ml/10g，受試動物在14天內(nèi)無一死亡，生理活動如常。即在單次給藥劑量11.25g/kg的劑量下，都不能觀察到明顯的毒性反應(yīng)，此劑量相當(dāng)于有效給藥劑量的112.5倍。
取實施例3描述的甘草總苷，用生理鹽水配制成濃度約為0.4g/ml的稠膏。以動物允許的最大單次灌胃體積(0.4ml/10g)給藥，20只受試動物在14天內(nèi)無一死亡，生理活動基本如常。此劑量相當(dāng)于有效給藥劑量的400倍。
試驗結(jié)果說明，甘草總苷口服安全性良好。
權(quán)利要求
1.一種減輕藥物心臟毒性的甘草提取物，該提取物來源于豆科植物甘草的干燥根及根莖，其特征是甘草提取物主要活性成分為三萜皂苷和黃酮糖苷類物質(zhì)，其中三萜皂苷類的含量在10～30％，黃酮類含量在25～80％。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種減輕藥物心臟毒性的甘草提取物在制備減輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的應(yīng)用，其特征是在制備減輕阿霉素心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物制劑形式為膠囊、片劑、口服液、顆粒劑或滴丸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物制劑形式為注射劑等多種劑型的藥物，或與其他藥物組合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種減輕藥物心臟毒性的甘草提取物，該提取物來源于豆科植物甘草，如烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(G.Inflata Bat.)及光果甘草(G.Glabra L.)的干燥根及根莖，其主要活性成分為三萜皂苷和黃酮糖苷類物質(zhì)，其中三萜皂苷類含量在10～30％，黃酮類含量在25～80％。本發(fā)明經(jīng)體內(nèi)、外實驗研究證明，對阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷有顯著的保護效果，同時并不減弱蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果，可預(yù)防和減輕蒽環(huán)類藥物心臟毒性，從而提高其療效，擴大其臨床應(yīng)用范圍?？稍谥苽錅p輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K9/10GK101284042SQ20081009946
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者靂 劉, 程翼宇, 瞿海斌, 玲 張, 楊 霍, 葛志偉, 水文波 申請人:浙江大學(xué)