專利名稱：用于提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法。
背景技術(shù)：
通常，甘草是多年生的植物，屬于薔薇目豆科，它的根是紅褐色，生長在深厚土層 中，它的角莖(angular stem)垂直地長至約Im 約1. 5m。它的葉子是帶有點尖(pointed tips)的斜橢圓形。葉子約2cm 約5cm長，約Icm 約3cm寬，沒有任何內(nèi)顎葉(Iacinia)。 它的花與大豆的花相似，在夏天開靛紫色花，是一種總狀花序。與古老的習(xí)語，“東方藥房中的甘草”相符地是，這種植物是一種廣泛用于東方藥 學(xué)實踐中的草藥。根據(jù)甘草的藥理作用，它結(jié)合肝臟中的有毒物質(zhì)并為肝臟解毒，對治療吸 毒成癮、肝炎、蕁麻疹、皮炎、濕疹等是有用的。此外，它不僅具有去咳化痰的功效，還具有抗 組胺和抗乙酰膽堿能的功效。它具有緩解由肌肉或組織的突然緊張所致疼痛、減緩體重增 加以及白細(xì)胞數(shù)量的增加的功效，還具有利尿，抗炎的功效等，特別是其中的成分，如甘草 苷，甘草素等抑制消化性潰瘍的產(chǎn)生。據(jù)《東醫(yī)寶鑒》，朝鮮王朝(1392 1910)時期由Huh Jun編寫的一部悠久的東方 醫(yī)學(xué)科學(xué)綱要，其中記載“甘草消除了所有的藥物毒性，集合了 72類不同石藥(礦物藥)和 約1200類不同草藥的功效，所以被稱為“國老”，意思是國家的長老。該植物通?？刂祈n烈 (冷和熱)和四齊(暖熱涼熱)，使耳朵、眼睛、嘴、鼻、尿液和糞便的生理正常，促進(jìn)血液在 所有血管中的流動，增強肌肉和骨骼，改善全身的營養(yǎng)狀況。”已知，在竹筍或蘑菇所致中毒的民間療法中，人們將所述植物煎煮成藥湯飲用，且 已知通過煎煮所述植物并飲用煮沸的植物湯汁，其對煙草中毒、吸毒成癮和其它成癮是有 效的。因此，甘草已被用來作為對各種中毒的解毒劑，它已被廣泛認(rèn)為是非常重要的草藥 (galenical)如鎮(zhèn)咳藥、祛痰藥、調(diào)味品和緩和劑(palliative)，不僅用于東方藥物，而且 用于新藥和民間醫(yī)藥。甘草提取物含有高含量的甘草苷、甘草素、芹糖甘草苷、異甘草苷、含有異芹糖甘 草苷和苷元的黃酮類化合物，以及主要含有甘草苷和芹糖甘草苷的甲醇流分(Kamei，J等， Eur. J. Pharmacol.，469，ppl59_63，2003)。在這些成分中，已知甘草素顯示出各種生理活性 如抗癡呆、抗菌、抗氧化、抗血管生成、抗皮膚癌、為鎘中毒解毒等功效。有關(guān)甘草素的傳統(tǒng)工藝，韓國專利No. 5353872公開了一種治療和預(yù)防由重金屬 成癮所致疾病的含甘草素的組合物，以及韓國專利No. 697056公開了一種治療和預(yù)防肝癌 的含有甘草素作為活性成分的組合物。具有這些不同生理活性的甘草素一般通過傳統(tǒng)方法用水或低級醇提取。然而，由 于甘草提取物中的甘草素含量低，已進(jìn)行了許多研究以提高甘草提取物中的甘草素含量。例如，韓國專利No. 592482公開了一種提高甘草提取物中的甘草素含量的方法， 包括將甘草分割成小段，將小段用水在100°C下回流提取，過濾提取物，然后冷凍干燥濾出物；用具有糖水解活性的細(xì)菌或細(xì)菌的酶液處理上述步驟得到的冷凍干燥的物質(zhì)，然 后在約20°C 約50°C下靜置約10分鐘 約36小時；向上述步驟培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中加入 2倍 10倍量的乙醇，將其分為乙醇可溶部分和乙醇不溶部分，然后減壓濃縮乙醇可溶部 分，獲得提取物；將上述步驟得到的提取物分散于蒸餾水中進(jìn)行三相萃取分配，然后濃縮可 溶流分；以及在二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中對上述步驟中的第七流分進(jìn)行重結(jié)晶，獲得 純的甘草素。然而，該方法的問題在于由于使用了細(xì)菌或細(xì)菌的酶液，使各步驟復(fù)雜，成本增 加。韓國專利No. 37789公開了一種提高甘草或甘草提取物中的活性成分_甘草素含 量的方法，包括將甘草苷溶解于DMSO中；向溶液中加入IM HCl ；水浴加熱所述混合物，進(jìn)行甘草 苷的酸水解；加入等量的IM HCl以中和酸性部分；以及用含有氯仿和丙酮的溶劑組合進(jìn)行 硅膠層析以純化雜質(zhì)如酸水解過程中產(chǎn)生的糖和鹽。然而，由于該方法中高熔點的DMSO難以去除，需要做許多諸如檢查殘留溶劑的工 作，當(dāng)使用HCl進(jìn)行酸水解時，問題產(chǎn)生了，由于緩慢的水解反應(yīng)，耗時的酸水解是不可避 免的，而產(chǎn)生的甘草素純度并不好。因此，本發(fā)明人研究了一種簡單高效的提高甘草提取物中甘草素含量的方法，應(yīng) 理解為在約80°C 約100°C下，當(dāng)向提取物中加入強酸或強堿時，生成之后易于分離的含 有甘草素的產(chǎn)物沉淀，所述提取物是通過將甘草加入水、有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合溶劑 中并使用超聲波提取得到的，通過簡單的方法使甘草提取物中的甘草素提取含量增加，并 最終形成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的一個目的是提供一種提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的 提取方法，該方法包括用水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑提取甘草得到含甘草苷的產(chǎn)物(步驟 1)；以及將水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑加入步驟1中提取的含甘草苷的產(chǎn)物 中，向溶液中加入酸或堿，水解該混合物以制備含甘草素的產(chǎn)物(步驟2)。有益效果由于本發(fā)明方法無需使用高價的溶劑，省略了柱層析過程以簡化步驟，比采用傳 統(tǒng)方法獲得了含更高含量(約8 23% )甘草素的提取物，該方法在甘草素提取過程中是 有用的。最佳實施方式參考附圖
并通過以下優(yōu)選實施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的特征和優(yōu)點將被更清楚 地理解。首先指出地是，本文使用的術(shù)語或詞語應(yīng)被視為與本發(fā)明的精神相應(yīng)的含義或概 念，依據(jù)的原則是發(fā)明人可適當(dāng)定義這些術(shù)語的概念以最好的描述他自己的發(fā)明。此外，應(yīng)理解地是，與本發(fā)明有關(guān)的已知的功能和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述將被省略掉，以免不必要地掩蓋 了本發(fā)明的重點。本發(fā)明提供一種提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，該方法包括用水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑提取甘草以得到含甘草苷的產(chǎn)物(步 驟1)；以及將水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑加入步驟1中提取的含甘草苷的產(chǎn) 物中，向溶液中加入酸或堿，水解該混合物以制備含甘草素的產(chǎn)物(步驟2)。以下將詳細(xì)描述本發(fā)明。首先，在步驟1中，用水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑提取甘草以得到含 甘草苷的產(chǎn)物。由于甘草中甘草素的含量近乎為0%，可以首先從甘草中提取甘草苷，然后水解得 到甘草素。在該步驟中，甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、甘草林恩(Glycyrrhiza glabra Linne.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、甘草林恩(Glycyrrhiza glabra Linne.)、脹果甘草蝙蝠(Glycyrrhiza inflataBat.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)和甘草林恩(Glycyrrhizaglabra Linne.)等,可作為甘草使用?？蓛?yōu)選水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑作為該步驟提取過程中的溶劑， 所述有機(jī)溶劑可優(yōu)選包括低級醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇等，丙酮、 乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯等。根據(jù)本發(fā)明方法，可優(yōu)選加入甘草重量2倍 10倍量的溶劑用于提取，更優(yōu)選4 倍 8倍的量，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明方法，提取溫度可優(yōu)選為約30°C 約100°C，更優(yōu)選為約80°C 約 100°C，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明方法，提取時間可優(yōu)選為約1小時 約10小時，更優(yōu)選為約4小時 約8小時，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明方法，提取方法可包括但不限于加熱及攪拌提取，回流提取、超聲提取 和浸漬。根據(jù)本發(fā)明方法，提取的次數(shù)可優(yōu)選為但不限于一次 五次。根據(jù)所述方法，可提取含甘草苷的甘草提取物，將得到的提取物進(jìn)行過濾并在減 壓下濃縮以得到含甘草苷的產(chǎn)物。接下來，在步驟2中，將水、有機(jī)溶劑，或有機(jī)溶劑的混合溶劑引入到步驟1中得到 的含甘草苷的產(chǎn)物中，向產(chǎn)物中加入酸或堿，水解產(chǎn)物中含有的甘草苷制備含甘草素的產(chǎn) 物。然后使用的有機(jī)溶劑可優(yōu)選包括低級醇如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔 丁醇等，丙酮、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲 苯等。在有機(jī)溶劑中，甲醇或乙醇的濃度可為70% 100%。所述酸可優(yōu)選為強酸，例如鹽酸、硫酸、硝酸或它們的任意混合溶劑。優(yōu)選使用硫 酸。更優(yōu)選使用約IM 約5M的硫酸。作為堿，優(yōu)選使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或 它們的任意混合物，優(yōu)選使用氫氧化鈣。更優(yōu)選使用約IM 約5M的氫氧化鈣。 根據(jù)本發(fā)明方法，反應(yīng)溫度優(yōu)選為約50°C 約100°C，更優(yōu)選為約80°C 約100°C。由于甘草素在水中不溶，在水解后，可將反應(yīng)混合物降至室溫以得到沉淀，甘草素 含量達(dá)到約5% 約15%。隨后，將沉淀溶于有機(jī)溶劑中，用水洗幾次，然后濃縮有機(jī)層并 在減壓下干燥將甘草素含量提高至約8% 約23%。然后使用的有機(jī)溶劑可包括低級醇如 正丁醇、叔丁醇等，乙酸乙酯、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯等。當(dāng)干燥有機(jī)溶劑時，優(yōu)選減壓下干燥，而不是熱風(fēng)干燥，減壓干燥所述沉淀的有機(jī) 溶劑之后，可將沉淀再次溶于乙醇中并在減壓下再次干燥沉淀以更大程度地減少殘留溶劑 的量。由于本發(fā)明方法無需使用高價的溶劑，省略了柱層析過程以簡化步驟，比采用傳 統(tǒng)方法獲得了含更高含量(約8 23% )甘草素的提取物，該方法在甘草素提取過程中是 有用的。實施方式以下給出優(yōu)選實施例以更好地理解本發(fā)明。然而，以下實施例僅用于理解本發(fā)明， 本發(fā)明并不限于以下實施例。<實施例1>甘草素1的制備(1)含甘草苷的甘草提取物的制備從東方藥商那里購買到甘草并精確區(qū)分后，將其分割成小段(甘草段)使用。甘 草中含有的甘草苷的含量不到1%。向約IOOg的甘草段中加入800ml約80% 約90%的 甲醇，并在約85°C下加熱攪拌約8小時。隨后，冷卻并過濾，然后在減壓下濃縮，得到含約 25. 8g甘草苷的提取物。1H NMR (CD3OD, 300MHz) δ 7. 61 (1Η, d,8. 6Hz) 7. 08 (2H, d,8. 4Hz)6. 81 (2H, d, 8. 4Hz) 6. 49 (1H, dd, 8. 6Hz)，6. 37 (1H, d, 2. 4Hz)，5. 41 (1H, dd, 13. 2,3. 1) 5. 37 (2H, dd, 13. 0， 2. 9Hz)，3. 49 (3H, t, 2. 4Hz)，3. 05 (1H, dd, 17. 0，13. 0)，2. 68 (1H, dd, 17. 0，2. 9)。在得到的甘草提取物中，按照以下方法測定甘草苷的含量。具體地，精確稱量約 0. 5g提取物，用約50ml約80%的甲醇進(jìn)行超聲提取，然后過濾以制備試驗溶液。另外，精 確稱量約IOmg甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品以制備50ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后各取20 μ 1的試驗溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶 液用于檢測，使用液相色譜按照以下條件測定甘草苷的含量，考慮到稀釋因素。*檢測器紫外分光光度計(測量波長約254nm)*柱十八烷基硅膠，約5 μ m，約4. 6謹(jǐn)X約15cm*流動相約1 %乙酸混合溶液ACN = 9:1* 流速約 lml/min根據(jù)該方法的測定顯示從甘草提取物中獲得的甘草苷含量約為2. 3%。(2)甘草素的制備將約IOOg(I)中得到的提取物分散于約500ml水中，向其中加入3M硫酸250ml，在 約90°C 約100°C下加熱攪拌約2小時。隨后，將混合物冷卻至室溫，過濾生成的沉淀并干 燥產(chǎn)生約34g的深褐色物質(zhì)(甘草素含量約8. 5% )。隨后，將約30g的所述物質(zhì)溶于約300ml乙酸乙酯中，用約300ml水洗兩次，濃縮 并減壓干燥除去溶劑，得到約22g深褐色晶體(甘草素含量約11% )。1H NMR (CD3OD, 300MHz) δ 7. 73 (1Η, d，8.6Hz，H_5) 7. 33 (2H，d,8. 4Hz)6. 81 (2H, d,8. 4Hz) 6. 49 (1H, dd, 8. 6Hz)，6. 35 (1H, d, 2. 4Hz)，5. 37 (2H, dd, 13. 0,2. 9Hz)，3. 05 (1H, dd, 17. 0，13. 0)，2. 68 (1H, dd, 17. 0，2. 9)。然后，按照以下方法測定甘草素的含量。具體地，精確稱量約0. Ig產(chǎn)物，用約50ml 約80%的甲醇進(jìn)行超聲提取，然后過濾以制備試驗溶液。另外，精確稱量約IOmg甘草苷標(biāo) 準(zhǔn)品以制備50ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后各取20 μ 1的試驗溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液用于檢測，使用液相色 譜按照以下條件測定甘草素的含量，考慮到稀釋因素。*檢測器紫外分光光度計(測量波長約254nm)*柱十八烷基硅膠，約5 μ m，約4. 6謹(jǐn)X約15cm* 流動相約 0. OlM 磷酸ACN = 67 33* 流速約 lml/min<實施例2>甘草素2的制備采用與實施例1相同的方法得到約23g深褐色物質(zhì)(甘草素含量約11. 2% )，不 同之處在于向甘草中加入約80%的乙醇以制備提取物。<實施例3>甘草素3的制備采用與實施例1相同的方法得到約23g深褐色物質(zhì)(甘草素含量約11. 8% )， 不同之處在于向甘草中添加約80 %的甲醇得到提取物后，再向提取物中加入約100 %的甲 醇，得到含甘草苷的提取物(約2. 9% )。<實施例4>甘草素4的制備采用與實施例1相同的方法產(chǎn)生約25g深褐色物質(zhì)(甘草素含量約12. )，不 同之處在于提取工藝是用約80%的乙醇提取甘草兩次。<對比例1>甘草素1的傳統(tǒng)制備方法向約IOOg甘草段中加入約800ml約80% 100%的甲醇，室溫下靜置48小時。隨 后，過濾該混合物并減壓濃縮，得到約18. 4g 約21. 2g提取物(甘草素含量約1. 3 約 1.6)。將得到的提取物溶于200ml DMSO中，向溶液中加入IN HCl 100ml，100°C水浴加熱所 述混合物6小時。將混合物冷卻至室溫，向其中加入等量的IN NaOH以中和酸性部分，然后 冷凍干燥約48小時，得到約28g提取物(甘草素含量約0. 8% )。<對比例2>甘草素2的傳統(tǒng)制備方法采用與實施例1相同的方法得到約29g含甘草素的提取物(甘草素含量約 0.7%)，不同之處在于用乙醇替換甲醇作為溶劑。<實驗例1>甘草苷的高效提取實驗(1)依照提取溶劑的甘草苷含量，為測定根據(jù)提取溶劑的不同，甘草提取物中甘草苷的含量，在表1中給出的提取 溶劑和提取溫度的條件下，加熱攪拌約IOOg的甘草段8小時，用實施例1中測定甘草苷含 量的方法測定所述提取物中甘草苷的含量，結(jié)果列于表1中。表 權(quán)利要求
1.一種提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，該方法包括用水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑提取甘草以得到含甘草苷的產(chǎn)物(步驟 1)；以及將水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑加入步驟1中提取的含甘草苷的產(chǎn)物中， 向溶液中加入酸或堿并水解該混合物以制備得到含甘草素的產(chǎn)物(步驟2)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟1和步驟2中所述的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、 正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基 甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述甲醇或乙醇的濃度為70% 100%。
4 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟1中所述的提取在30°C 100°C下進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟1中所述的提取方法為加熱及攪拌提取，回流提 取或超聲提取。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2中所述的酸為硫酸、鹽酸、硝酸或它們的混合 溶液，步驟2中所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或它們的任意混合物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2中所述的酸為IM 5M的硫酸，步驟2中所述 的堿為IM 5M的氫氧化鈣。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2中所述的水解反應(yīng)在50°C 100°C下進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將步驟2中得到的含甘草素的產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，水洗溶液幾次，濃縮并減壓干燥 有機(jī)層以提高甘草素含量。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、二甲 醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述干燥為減壓干燥。
12.如權(quán)利要9所述的方法，進(jìn)一步包括將步驟2中得到的含甘草素的產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，水洗溶液幾次，濃縮并減壓干燥 有機(jī)層，然后將含甘草素的產(chǎn)物溶于乙醇中并減壓干燥溶液以減少殘留的溶劑的量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，該方法包括用水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑提取甘草得到含甘草苷的產(chǎn)物(步驟1)；以及將水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑加入步驟1中提取得到的含甘草苷的產(chǎn)物中，向溶液中加入酸或堿，水解混合物以制備含甘草素的產(chǎn)物(步驟2)。
文檔編號A61K36/484GK102112142SQ200980130875
公開日2011年6月29日 申請日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者孫世一, 鄭燦圭, 金亨善, 金弘起 申請人:大元制藥株式會社