專利名稱：：富含甘草素的提取物或自其衍生的甘草素用于增加膽汁流、利膽作用以及用于預(yù)防和治...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及富含甘草素的甘草提取物和自其衍生的甘草素作為用于增加膽汁流、利膽作用以及用于預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病的有效成分的用途；通過使用其而增加膽汁流、利膽作用的方法；以及包含其的組合物。
背景技術(shù)：
：膽汁含有膽汁酸、磷脂、膽紅素、谷胱甘肽(GSH)和電解質(zhì)，并在涉及脂質(zhì)的消化和吸收的各種生理功能中起到重要作用，所述生理功能例如增加腸道處正常脂質(zhì)的吸收、保持人類膽固醇代謝平衡以及充當(dāng)各種毒性化學(xué)物質(zhì)(如藥物、如膽紅素的內(nèi)生碎片和脂質(zhì)代謝物)的排泄途徑(BallatoriN.等人，Am.J.Physiol.，263，ppG617-G624，1992)。兩種物質(zhì)，即半乳糖胺(GalN)和脂多糖(LPS)在實(shí)驗(yàn)中廣泛用作膽汁淤積性肝病的代表性誘導(dǎo)劑。半乳糖胺消耗肝臟組織中的UTP(尿苷三磷酸)和UDP(尿苷二磷酸)-葡萄糖醛酸而抑制肝臟內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生；消耗GSH(—種保肝物質(zhì))；并抑制在廢物排泄中涉及的葡萄糖苷酸化而引起肝毒性，從而導(dǎo)致伴隨的異常形態(tài)，如實(shí)質(zhì)組織的細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤等(JonkerAM等人，Hepatology,11，pp622_627，1990)。LPS快速增加包含LPS的內(nèi)毒素流入門靜脈；增加由炎癥肝細(xì)胞的活化引起的TNF-α(腫瘤壞死因子-α)，從而導(dǎo)致突發(fā)性肝炎；抑制肝轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)而引發(fā)膽汁排泄的紊亂；并增加膽汁淤積性肝病的血液指標(biāo)(例如ALP(堿性磷酸酶)、Y-GTP(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)等)的表達(dá)(GrimM等人，ActaHepatogastroentero1.(Stuttg)24，pp64_81，1977)。數(shù)種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即在膽汁流入肝細(xì)胞中涉及的存在于細(xì)胞膜中的NTCP(Na+-依賴性?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽)和0ATP-1(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽-1)；肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如在膽汁從肝輸出至膽管中涉及的MRP2(多藥耐藥蛋白2、和BSEP(膽鹽輸出泵)等(KepplerD等人，F(xiàn)ASEBJ.，11，pp509_516,1997)。甘草根(烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFISCH)、洋甘草(GlycyrrhizaglabraL.)等的根)屬于豆科，并報(bào)導(dǎo)其含有如甘草皂苷的三萜皂甙和如甘草素、甘草苷、新甘草苷、新異甘草苷等的數(shù)種類黃酮，其已用于治療咳嗽、胃潰瘍、高血壓等。通常，迄今為止，在韓國已報(bào)導(dǎo)UDCA(熊脫氧膽酸)為治療膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的唯一藥物。因此，至今仍然需要治療膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的新型藥物的開發(fā)。本發(fā)明人證實(shí)了甘草素顯示了對(duì)由重金屬中毒引起的肝病和由肝毒素物質(zhì)引發(fā)的急性和慢性肝臟疾病的潛在治療和預(yù)防作用(Kim等人，Toxicology,197,pp239-251，2004；Kim等人，Chem.Biol.Interact,161,ppl25_138，2006)。然而，在任何上述引文(其公開以引用方式并入本文)中未報(bào)導(dǎo)或公開甘草提取物或甘草素對(duì)膽汁淤積性肝病的治療作用。因此，本發(fā)明人力圖尋找用于治療膽汁淤積性肝病和提高膽汁流的有效試劑，并通過各種體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型試驗(yàn)來研究甘草提取物和自其分離的甘草素的藥理作用，例如，對(duì)血液指標(biāo)(如ALT、ALP、y-GTP等)和組織病理指標(biāo)(如肝細(xì)胞壞死、GSH的消耗)、通過半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病動(dòng)物模型中的保肝指標(biāo)的抑制作用。最后，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素在治療和預(yù)防膽汁淤積性肝病和增加膽汁流中是有效的。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明也提供了富含甘草素的提取物或自其分離的化合物用于制造用于治療或預(yù)防人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了治療人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的上述提取物或自其分離的化合物及其藥物可接受的載體。本發(fā)明提供了包含作為用于治療或預(yù)防膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的活性成分的甘草提取物或自其分離的甘草素的藥物組合物。本發(fā)明也提供了一種健康功能食品，其包含作為活性成分的有效量的用于預(yù)防或改善膽汁淤積性肝病和用于增加膽汁流的上述提取物或自其分離的化合物以及營養(yǎng)學(xué)可接受的添加劑，以預(yù)防和改進(jìn)膽汁淤積性肝病。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種藥物組合物，其包含富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素作為用于治療或預(yù)防膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的活性成分以及藥物可接受的載體。本發(fā)明的另一目的是提供富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素用于制造用于治療或預(yù)防人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的藥物中的用途。本發(fā)明的另一目的是提供治療人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素及其藥物可接受的載體。本文公開的術(shù)語“富含甘草素的甘草提取物”包括烏拉爾甘草、洋甘草等的提取物，優(yōu)選烏拉爾甘草，以及可通過包括如下步驟的程序制得的富含甘草素的甘草提取物洗滌、干燥甘草；在第1步驟中進(jìn)行使用非極性溶劑的分餾以去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)；在第2步驟中將強(qiáng)酸加入餾分并進(jìn)行酸解反應(yīng)以獲得水解的富含甘草素的餾分；在第3步驟中用強(qiáng)堿中和所述溶液；用水分離包含糖組分的水溶性餾分以獲得本發(fā)明意圖的富含甘草素的提取物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種健康功能食品，其包含有效量的作為活性成分的用于預(yù)防或改善膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素以及營養(yǎng)學(xué)可接受的添加劑，以預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病。本文公開的術(shù)語“膽汁淤積性肝病”包括肝膽汁郁積性黃疸、膽汁郁積性肝炎、原發(fā)性膽汁郁積性肝硬化、急性或慢性膽汁淤積性肝病、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽石病、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制病、膽汁性纖維化，或膽管癌，優(yōu)選地，包括膽汁郁積性肝炎、原發(fā)性膽汁郁積性肝硬化、急性或慢性膽汁淤積性肝病和膽石病?？捎糜诒景l(fā)明但不旨在限制本發(fā)明的藥草包括對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，用于相同或類似目的，并可被替代用于預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病的同屬植物。用于治療肝病的藥物組合物可含有以組合物總重量計(jì)約0.01至95W/W%，優(yōu)選0.5至的本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的提取物和化合物可根據(jù)如下優(yōu)選實(shí)施方案制得。對(duì)于本發(fā)明，上述甘草提取物或自其分離的甘草素可通過如下程序制得例如，將甘草(例如烏拉爾甘草)洗滌、干燥，并與5至20倍，優(yōu)選10至15倍體積的蒸餾水、醇(如甲醇、乙醇等)或其混合物，優(yōu)選甲醇混合；將溶液在0至室溫范圍的溫度，優(yōu)選室溫冷吸12小時(shí)至1星期，優(yōu)選48至72小時(shí)范圍的時(shí)間，或者在80至120°C范圍的溫度，優(yōu)選105°C以上加熱回流提取1至M小時(shí)，優(yōu)選2至5小時(shí)范圍的時(shí)間2至5次，或者通過超聲、回流或常規(guī)提取進(jìn)行提??；過濾溶液以獲得本發(fā)明的粗甘草提取物。為了獲得更優(yōu)選的本發(fā)明的富含甘草素的提取物，使由如上步驟制得的粗甘草提取物進(jìn)行使用混合溶劑體系洗脫的重復(fù)柱色譜法以獲得富含甘草苷的甘草提取物；使用如HCl的強(qiáng)酸使經(jīng)純化的提取物進(jìn)行酸解以去除甘草苷的糖部分；反應(yīng)物用如NaOH的堿溶液中和；將該溶液進(jìn)行使用混合物溶劑體系(CHCl3和丙酮)洗脫的硅膠柱色譜法以獲得本發(fā)明的富含甘草素的提取物。為了獲得本發(fā)明的純的甘草素，使所述富含甘草素的提取物進(jìn)一步經(jīng)受如硅膠柱色譜法的純化過程或重結(jié)晶法以獲得本發(fā)明的甘草素。本發(fā)明的另一目的是提供用于制備治療或預(yù)防膽汁淤積性肝病有效的組合物的上述甘草提取物和自其分離的甘草素的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種從甘草的提取物制備富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步驟洗滌、干燥甘草；與10至15倍體積的蒸餾水、醇(如甲醇、乙醇等)或其混合物混合；在0至室溫范圍的溫度冷吸溶液48至72小時(shí)；過濾殘余物以獲得粗甘草提取物；使該提取物進(jìn)行使用混合溶劑體系洗脫的重復(fù)柱色譜法以獲得富含甘草苷的甘草提取物；使用強(qiáng)酸將該提取物酸解以去除甘草苷的糖部分；用堿溶液中和溶液；將該溶液進(jìn)行使用混合溶劑體系(CHCl3和丙酮)洗脫的硅膠柱色譜法以獲得本發(fā)明的富含甘草素的提取物。在本發(fā)明的可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步驟洗滌、干燥甘草；在10至100°C范圍的溫度用10至15倍體積的如正己烷、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯，優(yōu)選二氯甲烷或其混合物的非極性溶劑提取1小時(shí)至7天，優(yōu)選M至72小時(shí)范圍的時(shí)間，提取方法選自冷吸提取、熱水提取、超聲提取、SFE(超臨界液體萃取法)提取法等，優(yōu)選超聲提??；過濾殘余物以去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)；將殘余物與10至15倍體積的蒸餾水、如甲醇、乙醇等的醇或其混合物，優(yōu)選甲醇混合；在10至100°C范圍的溫度冷吸溶液1小時(shí)至7天，優(yōu)選48至72小時(shí)范圍的時(shí)間，提取方法選自冷吸提取、熱水提取、超聲提取、SFE提取法等，優(yōu)選超聲提取，以在第1步驟中得到去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)的極性溶劑可溶性餾分；將5至40倍，優(yōu)選15至20倍體積的強(qiáng)酸(如1-3NHCl、硫酸等，優(yōu)選INHCl)加入餾分并在10至200°C，優(yōu)選80至100°C范圍的溫度進(jìn)行酸解反應(yīng)2小時(shí)至10小時(shí)，優(yōu)選4至8小時(shí)范圍的時(shí)間，以在第2步驟中獲得水解的富含甘草素的餾分；在第3步驟中用如氫氧化鈉、氫氧化鉀等的強(qiáng)堿中和溶液；用5水分離包含糖組分的水溶性餾分以獲得本發(fā)明所需的富含甘草素的提取物。本發(fā)明的化合物可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法而轉(zhuǎn)化為它們的藥學(xué)可接受的鹽和溶劑化物。對(duì)于鹽，由其藥學(xué)可接受的游離酸形成的其酸-加成鹽是可用的，并可通過常規(guī)方法制得。例如，在將化合物溶于過量酸溶液中之后，通過水可混溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)將得到的鹽沉淀以制備其酸加成鹽，進(jìn)一步，將等當(dāng)量的化合物與用水或醇(如二醇單甲醚)稀釋的酸的混合物加熱并隨后通過減壓下蒸發(fā)或過濾干燥以獲得其干燥鹽形式?？墒褂糜袡C(jī)酸或無機(jī)酸作為上述方法的游離酸。例如，可在本文使用有機(jī)酸，如甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、乳酸、乙醇酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡萄糖醛酸、天冬氨酸、抗壞血酸、甲酸(carbonylicacid)、香草酸、氫碘酸等，和無機(jī)酸，如鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等。進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物的藥學(xué)可接受金屬鹽的形式可通過使用堿制得?？赏ㄟ^常規(guī)方法制得其堿金屬或堿土金屬鹽，例如，在將化合物溶于過量堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物溶液之后，過濾不可溶的鹽，蒸發(fā)剩余濾液并干燥以獲得其金屬鹽。鈉、鉀或鈣鹽為藥物合適的作為本發(fā)明的金屬鹽，相應(yīng)的銀鹽可通過使堿金屬鹽或堿土金屬鹽與如硝酸銀的合適的銀鹽反應(yīng)而制得。若未在本文特別指出，化合物的藥學(xué)可接受的鹽包括可存在于化合物中的所有酸性或堿性鹽。例如，本發(fā)明的藥學(xué)可接受的鹽包括羥基的鹽，如其鈉、鈣和鉀鹽；氨基的鹽，如溴化氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、甲烷磺酸(甲磺酸)鹽和對(duì)甲苯磺酸(甲苯磺酸)鹽等，其可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制得。本發(fā)明的又一目的是提供一種藥物組合物，其包含粉末形式、提取形式或干浸膏形式的通過上述方法獲得的如上粗藥物提取物作為用于預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病的活性成分。當(dāng)本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的化合物口服給藥和靜脈內(nèi)給藥時(shí)，本發(fā)明的組合物顯著增加了膽汁酸排泄中涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)，并抑制了如ALT、ALP、γ-GTP等的血液指標(biāo)和如肝細(xì)胞壞死、GSH消耗的組織病理指標(biāo)、半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病動(dòng)物模型中的保肝指標(biāo)的增加。當(dāng)測(cè)試提取物的口服急性毒性時(shí)，提取物對(duì)死亡率、臨床癥狀、體重變化和驗(yàn)尸的總的結(jié)果(grossfindings)無明顯影響。用于治療膽汁淤積性肝病的藥物組合物可含有以組合物總重量計(jì)約0.01至99.，優(yōu)選0.1至的本發(fā)明的如上粗藥物組合物。本發(fā)明的組合物可根據(jù)所用方法另外包含常規(guī)的載體、佐劑或稀釋劑。優(yōu)選的是根據(jù)用途和應(yīng)用方法使用所述載體作為適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)，但不限制。適當(dāng)?shù)南♂寗┝杏赗emington’sPharmaceuticalScience(MackPublishingco，EastonPA)的文禾高中。在下文中，如下配制方法和賦形劑僅是示例性的，且不限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的組合物可作為藥物組合物提供，所述藥物組合物含有藥物可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。配方可另外包含填料、抗凝集齊IJ、潤滑劑、潤濕劑、增味劑、乳化劑、防腐劑等?？膳渲票景l(fā)明的組合物以在通過利用本領(lǐng)域公知的任何程序向患者給藥之后提供活性成分的快速、持續(xù)或延緩釋放。例如，可將本發(fā)明的組合物溶于油、丙二醇或通常用于制備注射劑的其他溶劑中。載體的合適的例子包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸異丙酯等，但不限于它們。對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的化合物可配制為軟膏和乳膏的形式。包含本發(fā)明組合物的制藥配方可以任何形式制得，如口服劑型(粉末、片劑、膠囊、軟膠囊、水性藥物、糖漿、酏劑丸劑、粉末、小袋、顆粒)或局部制劑(乳膏、軟膏、洗液、凝膠、香脂、貼劑、糊劑、噴霧溶液、氣溶膠等)、栓劑或無菌可注射制劑(溶液、懸浮液、乳液)。藥物劑型的本發(fā)明的組合物可以它們的藥學(xué)可接受的鹽的形式使用，也可單獨(dú)或適當(dāng)?shù)穆?lián)合使用，以及與其他藥物活性化合物組合使用。本發(fā)明組合物的合意的劑量根據(jù)條件和受試者重量、嚴(yán)重性、藥物形式、給藥途徑和時(shí)間而變化，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。然而，為了獲得合意的效果，通常推薦給藥者0.01-10g/kg，優(yōu)選1至5g/kg(以重量/天計(jì))的劑量范圍的本發(fā)明組合物。劑量可每天單劑量或多劑量給藥。就組合物而言，粗藥物組合物應(yīng)以組合物總重量計(jì)0.01至80重量％之間，優(yōu)選0.5至50重量％之間的量存在。本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)由各種途徑給藥至受試動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、家畜或人類)。預(yù)期多種給藥模式，例如，可口服、經(jīng)直腸或通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外或腦室內(nèi)注射進(jìn)行給藥。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種健康功能食品，其包含作為活性成分的有效量的用于預(yù)防或改善膽汁淤積性肝病的上述提取物或化合物以及營養(yǎng)學(xué)可接受的添加劑，以預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病。本發(fā)明的健康功能食品的粗藥物組合物以其粉末形式、其提取形式或其干浸膏形式使用。用于預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病的健康功能食品組合物可含有以組合物總重量計(jì)約0.01至，優(yōu)選0.5至的本發(fā)明的如上組合物?？蓪⑸鲜鼋M合物加入食品、添加劑或飲料以用于預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病。為了預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病的目的，其中，上述粗藥物組合物在食品或飲料中的量通常為用于健康食品組合物的食品的總重量的約0.1至15w/w%，優(yōu)選1至10w/w%，以及相比于IOOmL健康飲料組合物的1至30g，優(yōu)選3至10g。假設(shè)本發(fā)明的健康飲料組合物含有所指比例的上述粗藥物組合物作為基本組分，則對(duì)其他液體組分無特別限制，其中其他組分可為各種除臭劑或天然碳水化合物等，如常規(guī)飲料。上述天然碳水化合物的例子為單糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；常規(guī)糖，如糊精、環(huán)糊精；和糖醇，如木糖醇和赤蘚醇等。作為除了上述除臭劑之外的其他除臭劑，可有利地使用如索馬甜(taumatin)的天然除臭劑，如萊包迪苷A(levaudiosideA)、甘草皂苷等的甜葉菊提取物，和如糖精、阿斯巴甜等的合成除臭劑。上述天然碳水化合物的量相比于IOOmL本發(fā)明的飲料組合物通常為約1至20g，優(yōu)選5至12g的范圍。除了上述組合物之外的其他組分為各種營養(yǎng)物、維生素、礦物質(zhì)或電解質(zhì)、合成增味劑、著色劑和改進(jìn)劑(在奶酪巧克力等的情況中)、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)膠體粘合劑、PH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、用于碳酸飲料中的碳化劑等。除了上述組分之外的其他組分可為用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的果汁，其中組分可單獨(dú)使用或結(jié)合使用。組分的比例不重要，但通常為每100W/W%本發(fā)明的組合物約0至20/%的范圍。其中包含上述粗藥物組合物的可添加食品的例子為各種食品、飲料、口香糖、維生素復(fù)合物、營養(yǎng)改善食品等。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可對(duì)本發(fā)明的組合物、用途和制劑進(jìn)行各種改變和變化。有益效果如上所述，本發(fā)明的包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的組合物顯著增加膽汁流速率和膽汁酸、GSH和膽紅素的膽汁排泄。與這些結(jié)果相符，當(dāng)本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的化合物口服給藥或靜脈內(nèi)給藥時(shí)，所述組合物減少了包括作為保肝標(biāo)志的ALT和作為膽汁淤積標(biāo)志的ALP和g-GTP的血化學(xué)標(biāo)志，以及包括半乳糖胺/脂多糖-誘導(dǎo)的肝中毒動(dòng)物模型中的中心壞死和炎癥的組織化學(xué)標(biāo)志。因此，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病，并可用作安全有效的保肝劑。本發(fā)明的如上和其他目的、特征和其他優(yōu)點(diǎn)將由如下詳細(xì)描述結(jié)合附圖而更清楚地理解，其中圖I-A顯示了Ml(4-0-葡萄糖苷酸)和M2(7-0-葡萄糖苷酸)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖I-B顯示了在甘草素(LQ)靜脈內(nèi)給藥至大鼠(50mg/kg)的情況下試驗(yàn)中LQ血清水平隨時(shí)間的變化；圖I-C顯示了在甘草素(LQ)靜脈內(nèi)給藥至大鼠(50mg/kg)的情況下試驗(yàn)中LQ代謝物，即Ml和M2隨時(shí)間的變化；圖2-A表示當(dāng)50mg/kgLQ靜脈內(nèi)給藥至動(dòng)物模型時(shí)甘草素治療與對(duì)照組對(duì)膽汁酸排泄的比較作用；圖2-B表示當(dāng)50mg/kgLQ靜脈內(nèi)給藥至動(dòng)物模型時(shí)甘草素的利膽作用引起膽汁中膽汁酸排泄的增加；圖2-C表示當(dāng)50mg/kgLQ靜脈內(nèi)給藥至動(dòng)物模型時(shí)甘草素的利膽作用引起膽汁中GSH排泄的增加；圖2-D表示當(dāng)50mg/kgLQ靜脈內(nèi)給藥至動(dòng)物模型時(shí)甘草素的利膽作用引起膽汁中膽紅素排泄的增加；圖3-A表示15mg/kgLQ靜脈內(nèi)給藥3天增加了在肝臟組織內(nèi)的膽汁酸排泄中涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平(mRNA定量分析結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的增加，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即NTCP(Na+-依賴性?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽)和在膽汁流入肝細(xì)胞中涉及的細(xì)胞膜中存在的0ATP-1(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽-1)；在膽汁從肝臟輸出至膽管中涉及的如MRP2(多藥耐藥蛋白2)和BSEP(膽鹽輸出泵)的肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)；圖3-B表示反映MRP2的增加的蛋白質(zhì)印跡分析(Westernblotanalysis)結(jié)果，MRP2為在膽汁酸的輸出中涉及的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；圖3-C表示反映MRP2的增加的免疫化學(xué)染色分析結(jié)果，MRP2為在膽汁酸的輸出8中涉及的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；圖4-A表示如ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶)和-GTP(谷氨酰轉(zhuǎn)移酶)的血液生物化學(xué)指標(biāo)分析，其證明了當(dāng)靜脈內(nèi)給藥15mg/kg的LQ或口服給藥50mg/kg的LQ3天時(shí)對(duì)由半乳糖胺(GalN)/脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用；圖4-B表示組織化學(xué)H&E染色分析，其證明了當(dāng)靜脈內(nèi)給藥15mg/kg的LQ或口服給藥50mg/kg的LQ3天時(shí)對(duì)由氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用；圖4-C表示組織化學(xué)TUNEL染色分析，其證明了當(dāng)靜脈內(nèi)給藥15mg/kg的LQ或口服給藥50mg/kg的LQ3天時(shí)對(duì)由氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用；圖5-A表示減少的代表性指數(shù)GSH水平的恢復(fù)，其證明了當(dāng)靜脈內(nèi)給藥15mg/kg的LQ或口服給藥50mg/kg的LQ3天時(shí)對(duì)由氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用；圖5-B表示增加的代表性免疫指數(shù)TNF-水平的恢復(fù)，其證明了當(dāng)靜脈內(nèi)給藥15mg/kg的LQ或口服給藥50mg/kg的LQ3天時(shí)對(duì)由氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用。具體實(shí)施例方式最佳模式如下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的模式實(shí)施例1本發(fā)明的甘草提取物(GE-I)的制備將購自位于首爾的Kyimg-dong市場的3kg烏拉爾甘草洗滌、干燥，并向其中加入15升100%甲醇。在室溫靜置該溶液72小時(shí)，提取物用過濾紙過濾。濾液用真空濃縮器(N-21NS,ELYA)濃縮以獲得120g棕色凝膠型粗甘草提取物(下文指定為GE-1)。實(shí)施例2水解的甘草提取物(GE-2)的制備將2升INHCl加入120g實(shí)施例1中制得的提取物(GE-1)中，并在100°C下進(jìn)行酸解6小時(shí)。溶液用2升INNaOH溶液中和以獲得約90g水解的甘草提取物(下文指定為GE-2)。實(shí)施例3甘草素(LQ)的制備使實(shí)施例2中制得的水解產(chǎn)物經(jīng)過硅膠柱色譜法(60cm，230-400目)，洗脫溶液起始自CHCl3至混合物溶劑(CHCl3-MeOH=501—151)，獲得43g純化的餾分。該餾分進(jìn)一步經(jīng)過硅膠柱色譜法(50cm，230-400目)，洗脫溶液為混合物溶劑(CHCl3-丙酮=201—11)，獲得17g淡黃色富含甘草苷的餾分，即餾分22-45[Rf=0.7，展開溶劑CHCl3-MeOH=41]。將在實(shí)施例2中制得的水解產(chǎn)物經(jīng)過硅膠柱色譜法(60cm，230-400目)，洗脫溶液起始自CHCl3至混合物。將收集的包含豐富甘草苷的餾分進(jìn)一步經(jīng)過硅膠柱色譜法(50cm，230-400目)，洗脫溶液為混合物溶劑(CHCl3-MeOH=501—151)，并進(jìn)行使用二氯甲烷的重結(jié)晶，獲得12g白色粉末狀甘草素提取物(下文指定為LQ)。實(shí)施例4本發(fā)明的富含甘草素的甘草提取物(GEF-I)的制備將2000mlINHCl加入Ikg實(shí)施例1中制得的甘草提取物，并在100°C下反應(yīng)6小時(shí)以水解甘草苷的糖部分。反應(yīng)物用2000mlINNaOH中和。水解產(chǎn)物用蒸餾水反復(fù)洗滌以去除糖組分和鹽組分以獲得800g富含甘草素的甘草提取物(下文指定為GEF-1)。對(duì)比實(shí)施例實(shí)驗(yàn)制備試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半乳糖胺(SigmaChemicalCo.)和脂多糖(SigmaChemicalCo.)購自商業(yè)公司以在實(shí)驗(yàn)中使用。聚乙二醇#400(YakuriCo.)用生理溶液稀釋。重量為140_160g的雄性斯普拉-道來大鼠(SamtakoCo.Korea)在實(shí)驗(yàn)中使用并允許提供飼料(Harlan，teklan,USA)和飲水。在使用之前，將所有動(dòng)物保持在溫度為22士2°C且濕度為55士5%，具有12小時(shí)的明暗周期的受控環(huán)境中至少1個(gè)星期。統(tǒng)計(jì)所有結(jié)果通過使用藥理學(xué)計(jì)算進(jìn)行分析。測(cè)試組之間的顯著性通過ANOVA(單向方差分析法)評(píng)估并通過Newmann-Keuls測(cè)試方法(*p<0.5，**p<0.01)確定。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1靜脈內(nèi)給藥的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)大鼠模型中的膽汁排泄的作用為了研究實(shí)施例中獲得的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)膽汁排泄的抑制作用，在程序中進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將蒸餾水中的溶于在對(duì)比實(shí)施例中制得的40%PEG溶液中的甘草素(50mg/kg)靜脈內(nèi)給藥至大鼠，一天一次，在處理結(jié)束之后每隔1小時(shí)收集膽汁以分析膽汁組分。在結(jié)果中，靜脈內(nèi)給藥至大鼠(50mg/kg)的甘草素轉(zhuǎn)化為其代謝物，即Ml(4，-0-葡萄糖苷酸)和M2(7-0-葡萄糖苷酸)。Ml和M2的血液水平在530分鐘內(nèi)達(dá)到最大值，并保持直到36小時(shí)(參見圖1)。在研究膽汁排泄和甘草素代謝的變化之后，膽汁排泄在02小時(shí)內(nèi)顯著增加，且膽汁成分(即膽液、谷胱甘肽(GSH)和膽紅素)的排泄水平也在甘草素(50mg/kg)靜脈內(nèi)給藥之后增加(參見圖2)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2靜脈內(nèi)給藥的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)大鼠模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的增加的作用為了研究實(shí)施例中獲得的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的增加的抑制作用(其緊密涉及膽汁增加作用)，在程序中進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將甘草素靜脈內(nèi)給藥至大鼠(15mg/kg)，每天一次達(dá)3天，然后在處理之后1小時(shí)，將肝臟從大鼠分離。在結(jié)果中，使用mRNA對(duì)在膽汁酸流入肝細(xì)胞中涉及的兩個(gè)細(xì)胞膜蛋白(即0ATP-1和NTCP)以及在膽汁酸從肝臟排泄至膽管中涉及的膽小管膜蛋白(即MRP2和BSEP)的血清水平的增加進(jìn)行分析，在用甘草素處理的組中mRNA的表達(dá)急劇增加(參見圖3-A)。MRP2(在膽排泄中相關(guān)的主要蛋白)的水平不僅在mRNA分析中，還在蛋白質(zhì)和免疫化學(xué)染色分析中顯著增加(參見圖3-B和3-C)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3靜脈內(nèi)給藥的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)大鼠模型中半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病的抑制作用為了研究實(shí)施例中獲得的本發(fā)明的提取物和化合物對(duì)大鼠模型中半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病的抑制作用，在程序中進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將甘草素靜脈內(nèi)給藥至大鼠，一天三次達(dá)3天(15mg/kg)，或口服給藥，一天三次達(dá)3天(50mg/kg)。為了引起膽汁淤積性肝病，將半乳糖胺(600mg/kg)和LPS(lyg/kg)—次性腹腔內(nèi)給藥，然后在處理之后M小時(shí)，將血液和肝臟從大鼠腹腔分離。在結(jié)果中，在兩個(gè)不同的處理實(shí)驗(yàn)組中，血液指標(biāo)(即肝損傷指標(biāo)ALT和膽汁淤積指標(biāo)-GTP和ALP)的增加得以顯著抑制(參見圖4)，這驗(yàn)證了甘草素對(duì)膽汁淤積性肝病的發(fā)生和發(fā)展的抑制作用。此外，使用H&E染色法和TUNEL染色法確定甘草素對(duì)膽汁淤積性肝中毒的抑制作用。已證實(shí)甘草素顯著降低由半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的中心壞死和細(xì)胞凋亡，其結(jié)果與血液分析中的結(jié)果一致，并直接驗(yàn)證了甘草素對(duì)肝損傷的發(fā)生和發(fā)展的抑制作用(參見圖4)。而且，確定了TNF-α(炎癥指標(biāo)以及致病細(xì)胞凋亡)的量和顯示保肝活性的GSH的量。在結(jié)果中，確定在實(shí)驗(yàn)中甘草素有效抑制了TNF-α的增加和GSH的減少(參見圖5)。在下文將描述配制方法和賦形劑類型，但本發(fā)明不限于它們。代表性的制備實(shí)施例如下描述。粉末的制備GEF-I25mg玉米淀粉20mg乳糖30mg硬脂酸Mg最佳含量粉末制劑通過混合如上組分并填充密封包裝而制得。片劑的制備GEF-IIOOmg玉米淀粉IOmg乳糖50mg硬脂酸鎂最佳含量片劑制劑通過混合如上組分并壓片(entabletting)而制得。膠囊的制備GEF-IIOmg結(jié)晶纖維素！Bmg乳糖14.ang硬脂酸鎂OJmg片劑制劑通過混合如上組分并通過常規(guī)明膠制備方法填充明膠膠囊而制得。注射液的制備GEF-IIOmg甘露醇180mgNa2HPO4-12H2026mg注射用蒸餾水197%ig注射液制劑通過溶解活性組分、控制PH至約7.5，然后將所有組分填充至2mL安瓶(ample)中，通過常規(guī)注射液制備方法進(jìn)行滅菌而制得。液體的制備GEF-I20mg糖20g甘露醇5g蒸餾水最佳含量液體制劑通過溶解活性組分，然后將所有組分填充至IOOOmL安瓶中，并通過常規(guī)液體制備方法進(jìn)行滅菌而制得。健康食品的制備GEF-I1000mg維生素混合物最佳含i維生素A乙酸鹽70mg維生素El.Omg維生素B10.13mg維生素B20.15mg維生素B60.5mg維生素B120.2mg維生素C10mg生物素IOmg酰胺煙酸1.7mg葉酸50mg泛酸鈣0.5mg礦物質(zhì)混合物最佳含i硫酸亞鐵1.75mg氧化鋅0.82mg碳酸鎂25.3mg磷酸一鉀15mg磷酸二鈣55mg檸檬酸鉀90mg碳酸鈣100mg氯化鎂24.8mg上述維生素和礦物質(zhì)混合物可以多種方式變化。這種變化不應(yīng)看作是對(duì)本發(fā)明的精神和范圍的偏離。12健康飲料的制備GEF-I維生素C維生素E(粉末)15gIOOg0.2g0.25g0.3g3.5g3.5g19.75g1000mg維生素A維生素B1維生素B2酰胺煙酸氧化鋅乳酸亞鐵蒸餾水最佳含量健康飲料制劑通過溶解活性組分，混合，在85°C下攪拌1小時(shí)，過濾，然后將所有組分填充至IOOOml安瓶，并通過常規(guī)健康飲料制備方法進(jìn)行滅菌而制得。由此描述了本發(fā)明，顯而易見的是本發(fā)明可以許多方式變化。這種變化不應(yīng)看作是對(duì)本發(fā)明的精神和范圍的偏離，且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的所有這種改變旨在包括于如下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明涉及包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的組合物，其顯著增加膽汁流速率和膽汁酸、GSH和膽紅素的膽汁排泄。與這些結(jié)果相符，當(dāng)本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的化合物口服給藥或靜脈注射給藥時(shí)，包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的本發(fā)明的組合物減少了包括作為保肝指標(biāo)的ALT和作為膽汁淤積指標(biāo)的ALP和γ-GTP的血化學(xué)指標(biāo)，以及包括半乳糖胺/脂多糖-誘導(dǎo)的肝中毒動(dòng)物模型中的中心壞死和炎癥的組織化學(xué)指標(biāo)。因此，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病，并可用作安全有效的保肝劑。權(quán)利要求1.一種藥物組合物，其包含富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素作為用于治療或預(yù)防膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的活性成分以及藥學(xué)可接受的載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述富含甘草素的提取物通過包括如下步驟的程序制得洗滌、干燥甘草；在第1步驟中進(jìn)行使用非極性溶劑的分餾以去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)；在第2步驟中將強(qiáng)酸加入餾分并進(jìn)行酸解反應(yīng)以獲得水解的富含甘草素的餾分；在第3步驟中用強(qiáng)堿中和所述溶液；用水分離包含糖組分的水溶性餾分以獲得所需的本發(fā)明的富含甘草素的提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述富含甘草素的提取物為富含甘草素的甘草提取物，其通過包括如下步驟的程序制得用重復(fù)柱色譜法純化甘草提取物以獲得純化的甘草苷餾分；處理以酸解并用堿中和溶液的PH；進(jìn)行柱色譜法以獲得所需的富含甘草素的提取物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述膽汁淤積性肝病為膽汁郁積性黃疸、膽汁郁積性肝炎、原發(fā)性膽汁郁積性肝硬化、急性或慢性膽汁淤積性肝病、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽石病、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制病、膽汁性纖維化或膽管癌。5.富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素用于制造用于治療或預(yù)防人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的藥物中的用途。6.一種治療人類或哺乳動(dòng)物中膽汁淤積性肝病和增加膽汁流的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物給予有效量的富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素及其藥學(xué)可接受載體。7.一種健康功能食品，其包含有效量的用于預(yù)防或改善膽汁淤積性肝病和用于增加膽汁流的富含甘草素的甘草提取物或自其分離的甘草素作為活性成分以及營養(yǎng)學(xué)可接受的添加劑，以預(yù)防和改善膽汁淤積性肝病。8.一種制備本發(fā)明的富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步驟洗滌、干燥甘草；在10至100°C范圍的溫度用10至15倍體積的如正己烷、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯的非極性溶劑提取1小時(shí)至7天的時(shí)間，提取方法選自冷吸提取法、熱水提取法、超聲提取法、SFE提取法等；過濾殘余物以去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)；將殘余物與10至15倍體積的蒸餾水、如甲醇、乙醇等的醇或其混合物混合；在10至100°C范圍的溫度冷吸溶液1小時(shí)至7天的時(shí)間，提取方法選自冷吸提取法、熱水提取法、超聲提取法、SFE提取法等，以在第1步驟中獲得去除非極性溶劑可溶性物質(zhì)的極性溶劑可溶性餾分；將5至40倍體積的強(qiáng)酸加入餾分并在10至200°C范圍的溫度進(jìn)行酸解反應(yīng)2小時(shí)至10小時(shí)的時(shí)間以在第2步驟中獲得水解的富含甘草素的餾分；在第3步驟中用如氫氧化鈉、氫氧化鉀等的強(qiáng)堿中和溶液；用水分離包含糖組分的水溶性餾分以獲得所需的本發(fā)明的富含甘草素的提取物。全文摘要本發(fā)明涉及包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的組合物，其顯著增加膽汁流速率和膽汁酸、GSH和膽紅素的膽汁排泄。與這些結(jié)果相符，當(dāng)本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的化合物口服給藥和靜脈內(nèi)給藥時(shí)，包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的本發(fā)明的組合物減少了包括作為保肝標(biāo)志的ALT和作為膽汁淤積標(biāo)志的ALP和γ-GTP的血化學(xué)標(biāo)志，以及包括半乳糖胺/脂多糖-誘導(dǎo)的肝中毒動(dòng)物模型中的中心壞死和炎癥的組織化學(xué)標(biāo)志。文檔編號(hào)A61K36/484GK102223888SQ200980147241公開日2011年10月19日申請(qǐng)日期2009年9月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者金盈佑,金相建,金相贊申請(qǐng)人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)