專利名稱：干酪乳桿菌在提高流感疫苗所提供之保護作用中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)在增強老年個體中流感疫苗接種 所產生的體液應答因而提高疫苗接種后針對流感的保護中的用途。流行性感冒病毒(流感病毒)是呼吸道感染的一個重要原因。冬季流行性感冒影響了人群中的 5%，在兒童中具有高感染率并在老年 人中具有致命的并發(fā)癥。衛(wèi)生部門(與WHO—致)推薦向年齡超過65歲的個體、住在 EHPAD(無自理能力老人看護機構)的個體或者由于嚴重病理狀況而具有潛在健康問題的 人群每年進行流感疫苗接種。疫苗接種即使不能預防該病，也可以降低流感的嚴重程度、持 續(xù)時間和并發(fā)癥(重疊感染、住院治療、死亡)風險。然而，盡管流感疫苗接種在大多數成年個體(70%到90% )中賦予被認為有保護 性的抗體效價(抗血細胞凝集素效價大于或等于40 ；世界衛(wèi)生組織流行病學周報第33期， 第 283 頁，2005 年 8 月 19 日(WHOweekly epidemiological record, No. 33, p. 283, August 19，2005))，但在老年個體中情況卻不是這樣，這時僅在30 %至40 %的個體中達到了這一 抗體效價(C0X等，Scand. J. Immunol.，59，1-15，2004)。老年個體對流感疫苗的這種非理 想應答(suboptimal response)是由于與個體的年齡和/或生理狀況相關的免疫系統功 能缺陷所致(DENG 等，J. Immunol.，172，3437-46，2004 ；KANG 等，J. Immunol.，173，673-81， 2004)。提高免疫應答的一種方法是施用發(fā)揮佐劑作用的免疫刺激物。因此，含有佐劑 (例如MF59，它由尺寸小于250nm的穩(wěn)定液滴組成，該液滴包含在水包油乳劑中的角鯊烯、 可代謝的油和兩種表面活性劑(聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯及三油酸酯))的新疫苗 開始在法國銷售，來增強老年個體的免疫應答(BALD0等，Vaccine，19，3472-5，2001)。此 外，飲食能調節(jié)免疫應答。已經顯示，在2到6個月中攝入硒和鋅的補劑以及某些維生素 和微量元素可以增強福利機構中的老年個體對疫苗接種的免疫應答(ALLSUP等，J.Am. Geriatr. Soc. ,52,20-4,2004 ；BUNOUT 等，JPEN J. Parenter. Enteral. Nutr.，28，348—54， 2004 ；BUNOUT 等，JPEN J. Parenter. Enteral. Nutr.，26，372-6，2002 ；CHANDRA, Lancet, 340，1124-7，1992 ；GIR0D0N 等，Arch. Intern. Med.，159，748-54，1999 ；LANGKAMP-HENKEN 等，J. Am. Geriatr. Soc.，52，3-12, 2004 ；PR0VINCIALI 等，Age Ageing, 27，715-22，1998)。還 有報道稱，某些益生菌也可以調節(jié)對疫苗(如脊髓灰質炎疫苗)的應答(DE VRESE等，Eur. J. Nutr.，44，406-13，2005)。先前已經觀察到(PCT申請WO 2001/089541)，施用干酪乳桿菌能夠增強與多種病 原微生物(包括流感病毒)相關的細胞介導免疫應答(由T淋巴細胞介導)。另一方面，干 酪乳桿菌對體液免疫的可能作用仍然知之甚少，前述體液免疫與流感疫苗接種所給予的保 護有關。本發(fā)明人著手研究了攝入干酪乳桿菌對于改變老年個體中流感疫苗接種所產生 的特異性血清抗體效價的作用。他們注意到了這些抗體效價的提高，尤其是導致了血清轉 化率和血清保護率的增加。
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“血清保護”定義為個體中以大于或等于保護閾值的量存在針對流感病毒的血清 抗體。此保護閾值定義為大于或者等于40的抗血細胞凝集素血清抗體效價，該效價通過血 細胞凝集抑制(HAI)來測定。群體中的“血清保護率”對應于觀察到血清保護之個體的比 例。公認的是，通過HAI測定大于或等于40的抗體效價與針對疫苗中所包含和存在之菌株 的保護相關(C0X N. J.等，Lancet, 1999 354 1277-82)。“血清轉化”在本文中定義為針對流感病毒進行疫苗接種之后，個體中針對流感病 毒的血清抗體量的增加，疫苗接種后的抗體水平至少等于疫苗接種前所測定水平的4倍。 人群中的“血清轉化率”對應于觀察到血清轉化之個體的比例。本發(fā)明人還注意到，攝入干酪乳桿菌對于改變流感疫苗接種所產生血清抗體效價 的積極作用看來在某些類別的老年個體(即無自理能力程度最低的老年個體，以及老年女 性)中特別顯著。無自理能力程度水平用AGGIR(Autonomie Gerontologie Groupeslso-Ressources [老年自主性國際標準化組織])分類網格來定義(VETEL等，Soins Gerontol.，23-7,1998)。AGGIR網格的第1類、2類和3類集合了無自理能力程度高的個體； 第4類和5類集合了具有無自理能力程度低的個體；第6類集合了有自理能力的個體。因此，本發(fā)明的主題之一是干酪乳桿菌菌株用于制備增強疫苗接種后針對流感之 保護的可經口施用組合物的用途。本發(fā)明還使得可以提高在流感疫苗接種時所給予的體液 免疫。特別地，它還使得可以獲得保護性的抗體效價(血清保護)。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述組合物擬施用于65歲或以上的接受流感 疫苗接種的老年個體。優(yōu)選地，所述個體至少為70歲。特別有利地，所述組合物擬施用于有自理能力的個體或者無自理能力程度低的個 體和/或女性。在本發(fā)明實施中，所述干酪乳桿菌菌株可以單獨使用，或者與干酪乳桿菌菌種 或其他菌種的其他乳酸菌組合使用。它可以有利地與酸乳發(fā)酵菌(即保加利亞乳桿菌 (Lactobacillus bulgaricus)禾口口譽熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus))組合<吏用。優(yōu)選地，根據本發(fā)明之用途制備的組合物中含有每毫升至少IO5個、優(yōu)選至少IO6 個、一般為IXlO8到1.5X109個干酪乳桿菌細胞。當干酪乳桿菌與酸乳發(fā)酵菌組合使用時，所述組合物也有利地包含每毫升至少 IO7個、優(yōu)選2 X IO8到IX IO9個嗜熱鏈球菌細胞和每毫升至少5 X IO5個、優(yōu)選4X IO6到 2 X IO7個保加利亞乳酸桿菌細胞。非常適用于本發(fā)明的一種干酪乳桿菌菌株是1994年12月30日以編號1-1518保 藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes[法國微生物保藏中 心]，25rue du Docteur Roux, Paris)的菌株。根據本發(fā)明制備的組合物能夠以食品或食品補劑的形式施用。例如，它們可以是 乳制品特別是發(fā)酵的乳制品，其中至少包含所述干酪乳桿菌菌株，其如上文所述任選地與 其他乳酸菌(例如與酸乳發(fā)酵菌)組合。為了得到最佳效果，所述干酪乳桿菌菌株優(yōu)選在流感疫苗接種之前至少1個星期 施用，優(yōu)選至少兩個星期，有利地為至少3個星期，最優(yōu)選至少4個星期。其后可以繼續(xù)施 用干酪乳桿菌至期望的時間，以保持疫苗接種所產生的免疫力提高。干酪乳桿菌的每日用量為優(yōu)選至少101(ICFU、更有利地為2X IOltlCFU的干酪乳桿菌。這一用量可以在每日一次或 多次的攝入中施用。通過接下來涉及非限制性實施例的進一步描述，可以更為清晰地理解本發(fā)明，所 述實施例展示了干酪乳桿菌菌株提高流感疫苗接種所產生的體液免疫的特性。
實施例為了評估食用一種含有干酪乳桿菌CNCM 1-1518的發(fā)酵乳制品(Actimel )對 流感疫苗接種所產生的特異性血清抗體效價的影響而進行了研究，前述特異性血清抗體效 價是在疫苗接種后3周(疫苗接種后2至4周的應答峰值)以及在停止食用該產品的情況 下疫苗接種后3個月和5個月(為了監(jiān)測血清抗體效價的變化)的效價。研究概沭本研究是隨機、雙盲、以安慰劑為對照的多中心實驗性研究。將86人分為每組43 人的2個平行組，一組接受Actimel ,另一組接受對照產品(安慰劑)。本研究的過程圖示于

圖1。本研究的總持續(xù)時間為178天。本研究包括以選擇老年個體為目標的選擇訪視(selection visit，VI)。該訪視 發(fā)生在納入訪視(inclusion visit, V2)之前的一個月期間。在V2 (第0天)時，對所有中 心的所有個體已進行了兩周以上的納入和隨機分組。所有個體都于第ο天(V2)開始食用研究產品(根據隨機分組為Actimel 或對 照產品)，并持續(xù)7周(疫苗接種前4周和疫苗接種后3周)。在第28天(V3)(即在開始食用研究產品4周后)時，通過在三角肌中肌內注射對 所有個體進行流感疫苗接種(同一批Vaxigrip疫苗)。在第28天(V3)、第49天(V4)、第118天(V5)和第178天(V6)進行醫(yī)學訪視。個體的選擇本研究中包含的個體是居住在無自理能力老人看護機構(EHPAD)的老年個體。納入標準-至少70歲的男性或女性；-AGGIR分數為2到5 (包含邊界)的個體；-在選擇訪視(Vl)采集血液樣品時，抑制變體A/CalifOrnia/7/2004(疫苗原型) 相關毒株所致豚鼠紅細胞凝集的抗體效價低于40的個體；-體重指數(BMI)為16kg/m2至27kg/m2(包含邊界)的個體；-對其參與本研究給出了知情同意并能理解所提供信息的個體；排除標準-患有預期壽命少于6個月的嚴重進行性疾病的個體；-患有失衡性I型或II型糖尿病的個體；-對乳蛋白和/或雞蛋發(fā)生變態(tài)反應或過敏反應的個體；-已知為乳糖不耐受的個體；-慢性或醫(yī)源性免疫抑制的個體，尤其是在前期選擇訪視(VI)的兩個月中以口服 皮質類固醇或免疫抑制劑治療超過2周的；隨機分組
通過隨機抽取來決定把個體分配至“產品”組或“對照”組，平均到標記為“A”或 “B”的兩組。根據患者的自主性狀態(tài)(以此反映該個體的生理狀況)確定了 兩 個層次(stratification) AGGIR(Autonomie Gerontologique Groupes IsoRessources [Gerontological autonomy, iso-resources groups])分數等于 2 或 3 的 個體組成了第一層次，AGGIR分數等于4或5的個體組成了第二層次。研究產品Actimel 產品是一種商業(yè)化產品。對照產品是具有與產品Actimel 相同的感官品質、酸度、能量值和口感但不含 有乳酸發(fā)酵劑的產品。這兩種產品裝在標有字母代碼(A或B)的IOOml無標記瓶中。這兩種產品的特征總結在下面的表一中。表一
產品脂類 g/100 g糖類 g/100g蛋白質 g/100 g能 量 KJ/100 g活性成分(干 酪乳桿菌)濃 度Actimel 1.5+/-0.514.5 +/- 0.52.5 +/- 0.580-85>108 cfu/ml對照1.5 +/- 0.514.5 +/- 0.52.5 +/- 0.580-85< 1 cfu/ml研究過稈選擇訪視結束時，保留既有之前定義的所有納入標準又沒有之前定義的任一排除 標準的個體。要求他們在研究開始前的7天中(第-7天至第O天)直到訪視V4 (第49天)時 戒除食用發(fā)酵乳制品(酸乳、白乳酪(fromage blanc)、新鮮乳酪(petits suisses，未熟化 的奶油乳酪)和大豆酸乳)。采集血液樣品以測定基礎抗流感抗體效價。在第O天進行納入和隨機分組的訪視(V2)。從第O天開始，個體每天食用隨機分配的研究產品(A或B)，早飯一瓶100ml，晚餐 一瓶100ml，連續(xù)食用49天。在第28天(V3)時，通過三角肌的肌內注射對個體接種流感疫苗。所用的疫苗 (Vaxigrip)是滅活的裂解病毒疫苗，每劑中含有以下毒株的血細胞凝集素各15 μ g 兩種A 型毒株(一種Hmi毒株和一種H3N2毒株)和一種B型毒株；每劑中所述毒株的血細胞凝 集素各15 μ g。此疫苗不含有佐劑。所述HlNl毒株是New Caledonia/20/99毒株，所述H3N2毒株是 California/7/2004 毒株，所述 B 毒株是 Shangai/361/2002 毒株(根據 2005-2006 季 WHO 北半球疫苗接種建議)。在其后的每次訪視中(分別在第49天(V4)、第118天(V5)和第178天(V6)時進
6行)，采集血液樣品以測定疫苗接種所產生的針對疫苗中存在的每一毒株具有特異性的血 清抗體。還進行醫(yī)學檢查，并且每次都記錄自前次訪視以來出現的生理狀況或實施的治療?？贵w分析在V1、V4和V5訪視時，從所有個體的前臂靜脈中采集血液樣品(1管7ml)。將樣品 裝入干燥的管中，之后離心以分離血清。將每份血清樣品等分到凍存管中(每管500μ1)， 以在-20°c到-80°c保存直至進行分析。由法國巴黎巴斯德研究所的centre national de reference (CNR)[國家參比中心]對流感病毒進行分析；。所用的測試是血細胞凝集抑制(HAI)測試，根據WHO的建議(WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance :WH0/CDS/CSR/NCS/2002-5)實施。該測 試是基于測試血清中所含的特異性針對每一病毒毒株的抗血細胞凝集素抗體與表達在病 毒表面的血細胞凝集素結合從而阻止這些病毒與紅細胞結合的能力。在不存在特異性抗體 時，觀察到紅細胞與病毒形成網絡(培養(yǎng)孔均一地紅色)。另一方面，在特異抗體存在下，觀 察到孔底部的紅細胞沉淀。為了消除由血清而非流感病毒引起的非特異性血細胞凝集，將每個血清樣品通過 與RDE(破壞受體的酶)一起孵育而進行處理，然后吸附到雞紅細胞上。每個血清樣品連續(xù) 稀釋兩倍，分到培養(yǎng)皿中并與標準病毒懸液(每50 μ 1中4個血細胞凝集素單位)一起孵 育。然后加入豚鼠紅細胞，以顯示未被抗體中和的病毒血細胞凝集素的存在情況。同時分析來自CNR[國家參比中心]的血細胞凝集抑制測試陽性對照和陰性對照， 對每一測試進行驗證。將抗體效價表示為仍具有血細胞凝集抑制作用的最高稀釋度的倒數。統計學分析對以下群和亞群進行數據分析-“意向處理”(Intention To Treat, ITT)群包括該研究中隨機分組并接受了至 少一種研究產品的所有個體；-根據AGGIR層次和性別區(qū)分的亞群。以5%的雙側顯著性閾值進行該測試。5%至10%的顯著性閾值被認為指示了傾 向性。實驗設計是有“產品”和“對照”兩個組的平行組?？紤]到本研究的目的，此研究的主效應是“產品”。同時，還研究了 “AGGIR分數”、BMI、年齡和基礎抗體效價的效應。就抗體效價而言，已知這一參數呈對數正態(tài)分布。為了進行參數分析，必須對抗體 效價進行對數轉換，因此對抗體效價對數的正態(tài)性進行了驗證和討論。參數分析是根據共變量的性質對變量和/或共變量進行分析的常規(guī)高斯模型。還對變量和/或共變量進行非參數分析(Friedman檢驗)。分析中考慮以下共變量“AGGIR分數”、BMI、年齡和基礎抗體效價。產品間的數據比較通過卡方檢驗或者Fisher精確檢驗來進行，Fisher精確檢 驗在未遵循卡方檢驗之條件的情況使用。同時采用logistic回歸模型將各種影響因素 (“AGGIR分數”、BMI、年齡和基礎抗體效價)考慮在內。對每個分層變量組(“AGGIR分數”)進行相同的分析。
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判斷標準所研究產品效果的主要標準選擇的主要標準是在第4次訪視時(第49天)對3種病毒毒株的流感抗體效價。這一標準的主要表現為第4次訪視時抗體效價相比于基礎值的變化。所研究產品效果的次要標準對3種病毒毒株中每一種所選擇的次要標準是-在第4次訪視時(第49天)的血清轉化(與基礎水平相比抗體效價至少提高4 倍的個體)，-在第4次訪視時(第49天)的血清保護(抗體效價彡40的個體)。結果ITT 群抗體效價結果示于圖2。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在接種每 種流感毒株疫苗后3周產生了更高的抗體效價。血清轉化結果示于圖3。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在接種疫 苗后3周對每種流感毒株產生了更高的血清轉化率。血清保護結果示于圖4。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在對每種 流感毒株進行疫苗接種后3周使得受保護個體的百分比提高。在Hmi血清型的毒株中，這 一效果表現出了統計學傾向性。MMAGGIR分數為4-5的亞群抗體效價結果示于圖5。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在對每種 流感毒株接種疫苗后3周產生了更高的抗體效價。血清轉化結果示于圖6。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在接種疫 苗后3周對每種流感毒株產生了更高的血清轉化率。H3N2血清型毒株的這一效果具有統計 學顯著性。血清保護結果示于圖7。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在對每種 流感毒株進行疫苗后3周使得受保護個體的百分比提高。H3N2血清型毒株的這一結果具有 統計學顯著性。女性亞群抗體效價結果示于圖8。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在對每種 流感毒株接種疫苗后3周產生了更高的抗體效價。血清轉化結果示于圖9。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在接種疫苗后3周對每種流感毒株產生了更高的血清轉化率。Hmi血清型毒株的這一效果具有統計 學顯著性。血清保護結果示于圖10。這些結果表明，與食用安慰劑的情況相比，食用Actimel在對每 種流感毒株接種疫苗后3周使得受保護個體的百分比提高。這一效果在A型毒株中更突出 (H3N2血清型有統計學傾向性)，特別是在Hmi血清型的毒株中(統計學顯著差異)。
權利要求
干酪乳桿菌物種的細菌菌株在制備用于提高疫苗接種后針對流感之保護作用的可經口施用組合物中的用途。
2.權利要求1的用途，其特征在于所述細菌菌株可以提高流感疫苗接種時所給予的體 液免疫。
3.權利要求1和2中任一項的用途，其特征在于所述組合物意圖施用于年齡為65歲或 更高的個體。
4.權利要求1-3中任一項的用途，其特征在于所述干酪乳桿菌菌株是CNCM1-1518菌株。
5.權利要求1-4中任一項的用途，其特征在于所述組合物為食品或食品補劑的形式。
6.權利要求1-5中任一項的用途，其特征在于所述組合物為發(fā)酵乳制品的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及可經口施用組合物中的干酪乳桿菌用于提高流感疫苗接種后針對流感之保護作用的用途，這通過增強所述疫苗所產生的體液應答來實現。
文檔編號A61P37/02GK101918013SQ200880008664
公開日2010年12月15日 申請日期2008年2月13日 優(yōu)先權日2007年2月16日
發(fā)明者拉斐爾萊·布爾代-西卡爾, 桑德里納·薩姆森-維萊熱 申請人:達能日爾維公司