專利名稱：一種新型抗炎分子drp的抗炎作用、實(shí)施方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及死亡抵抗蛋白(Death Resistant Protein, DRP)在細(xì)菌感染性疾病中的效應(yīng)、作用機(jī)制、實(shí)施方法和用途。
背景技術(shù)：
細(xì)菌感染是臨床常見的疾病，可以導(dǎo)致機(jī)體局部和全身的感染性表現(xiàn)，甚至可 以最終導(dǎo)致感染性休克、內(nèi)毒素性休克以及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴(yán)重后果，一旦重度感染導(dǎo)致出現(xiàn)休克或者多器官功能衰 竭，則引起高死亡率( 50-80% )表現(xiàn)。常見的臨床細(xì)菌感染，如大腸埃希菌、銅綠假單胞 菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、糞腸球菌等均可以導(dǎo)致機(jī)體局部和全 身的炎癥反應(yīng)，引起不同程度的感染性疾病的發(fā)生。對于細(xì)菌感染患者，醫(yī)生一般采用大劑量抗生素“轟炸”，意欲“一舉殲敵”，快速、 徹底殺滅病原體，但是往往忽略了另一方面，即在病菌死亡后會(huì)釋放大量毒素，通過毒素來 引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性癥狀。誘發(fā)全身性炎癥的毒素主要有兩類內(nèi)毒素(革蘭陰性細(xì)菌細(xì) 胞壁的脂多糖成分)和超抗原(包括革蘭陽性細(xì)菌的肽聚糖/脂磷壁復(fù)合物、外毒素等毒 素)。目前細(xì)菌感染導(dǎo)致的休克和多器官功能衰竭仍然是臨床預(yù)防和治療的重大挑戰(zhàn)。人們對于機(jī)體識別外來微生物的分子機(jī)制并不完全了解，但是隨著Toll樣分子 的發(fā)現(xiàn)，機(jī)體針對微生物所產(chǎn)生的天然免疫和繼發(fā)的獲得性免疫的細(xì)胞和分子生物學(xué)基礎(chǔ) 逐步得到了認(rèn)識。Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)在果蠅胚胎發(fā)育過程中，對背腹側(cè)體軸細(xì)胞的形成起 重要調(diào)控作用Hashimoto，C.等，Cell. 1988 ；52 :269_279 ；Anderson, K. V.等，Cell. 1985 ； 42 :791-798。Toll蛋白在物種進(jìn)化上高度保守，目前為止在哺乳動(dòng)物相繼發(fā)現(xiàn)了 11種 Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLRs)[Medzhitov, R.等，Nature. 1997 ；388 :394_397 ； Rock, F. L.等，Proc Natl Acad Sci USA. 1998 ;95 :588_593。不同的 TLR 識別不同病原 體中相應(yīng)的特定結(jié)構(gòu)的分子，這些分子是一類大多數(shù)病原微生物所共有的組成性表達(dá)的 分子，結(jié)豐勾{呆守，稱為病原體才目關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)；而相應(yīng)的受體則為模式識別受體(Pattern recognition rec印tors，PRRs)。天然 免疫系統(tǒng)通過PRR識別病原體保守的PAMP，構(gòu)成機(jī)體抗感染的第一道防線，同時(shí)對獲得性 免疫也具有重要的調(diào)節(jié)作用。人類TLR1、TLR2、TLR3和TLR6定位于4號染色體，其中TLR2識別革蘭氏陽性 菌成分細(xì)菌脂蛋白BLP等成分，并與TLR6協(xié)同作用識別PGN分子等，TLR3則識別病毒 分子中雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)Takeuchi，0.等，Immunity. 1999 ； 11 443-451 ；0zinsky,A.等，Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ；97 :13766_13771 ；Alexopoulou, L.等，Nature. 2001 ；413 :732_738。人類TLR4和TLR5分別定位于9和1號染色體，相應(yīng) 識別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和細(xì)菌鞭毛蛋白分子 flagelin [Poltorak A.等，Science. 1998 ；282 :2085_2088 ；Hayashi F.等，Nature. 2001 ； 410 1099-1103；人類TLR7和TLR8基因定位于染色體Xp22，識別病毒分子中的單鏈RNA(single-stranded RNA, ssRNAs)Heil，F(xiàn).等，Science. 2004 ；303 :1526_1529；人類 TLR9定位于染色體3p21. 3，識別細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔 酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG ODN) [Hemmi, H.等，Nature. 2000 ；408 :740_745； TLR11為TLRs家族新成員，主要表達(dá)于泌尿系統(tǒng)，在控制泌尿系統(tǒng)細(xì)菌感染的過程中發(fā)揮 重要作用Zhang D.等，Science. 2004 ；303 :1522_1526。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR不僅與機(jī)體的抗感染免疫密切相關(guān)，而且與很多種疾病的發(fā)生 和進(jìn)展具有因果關(guān)系。微生物在進(jìn)入機(jī)體后可以快速激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，由巨噬細(xì) 胞、樹突狀細(xì)胞(DC)等免疫細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的炎性因子(如TNFa、IL-1 和IL-15、I型干擾素等)，一方面直接殺死和消除外來病原體，一方面誘導(dǎo)針對病原體的 特異性獲得性免疫。如果機(jī)體不能夠及時(shí)有效地清除病原體，則機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生慢性炎癥 (如結(jié)核病、慢性肝炎、慢性腎炎以及慢性胃腸道疾病)，而且會(huì)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的 紊亂，長期的慢性炎癥可以引起繼發(fā)的多種臨床疾病Cook，D.N.等，Nat Immunol. 2004, 5:975-979。研究發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫病、過敏性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、甚至包括多種腫 瘤均與慢性炎癥密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制涉及TLRs的信號傳導(dǎo)異常Cook，D.N.等，Nat Immunol. 2004,5 :975_979。Toll樣受體(TLRs)是一類模式識別受體，廣泛分布于免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞和 巨噬細(xì)胞表面，可以通過病原微生物特定的病原體相關(guān)分子模式識別抗原并激活相應(yīng)的信 號通路，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，構(gòu)成機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。TLRs是I型跨 膜蛋白，屬于TIR(Toll/IL-lrec印tor)超家族成員，Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)在調(diào)控果蠅的胚 胎發(fā)育過程中起重要作用。TLR受體與相應(yīng)配體結(jié)合可以分別活化下游的MyD88 (myeloid differentiation factor 88)依賴性通路和 TRIF(Toll/IL-lrec印tor (TIR)-domain containing adaptor protein inducingIFN-0 )依賴性通路，MyD88 既而活化下游的 IRAKs、TRAF6、TAK1及IKK和MAPK等信號分子，最終導(dǎo)致NF k B和API的早期活化，介 導(dǎo)炎性因子如TNF-a，IL-6，IL-1 3和一氧化氮的產(chǎn)生；TRIF的活化能激活TBK1、TRAF3 和IRF3，最終導(dǎo)致I型干擾素的產(chǎn)生和干擾素誘導(dǎo)基因的活化，如CXCL10和CCL5等Akira， S.等，Nat. Rev. Immunol. 4,499-511(2004) ；Liew, F. Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5, 446-458(2005)。TLRs信號通路作為機(jī)體固有免疫的第一道屏障，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子和干擾素 來清除病原體，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，然而，TLRs的活化是一把雙刃劍，過多的炎性因子 產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致各種炎癥性疾病和自身免疫病。炎癥性疾病如內(nèi)毒素休克的機(jī)理是由于病灶或 血流中革蘭氏陰性病原菌大量死亡，釋放出來的大量內(nèi)毒素進(jìn)入血液時(shí)，可發(fā)生內(nèi)毒素血 癥。大量內(nèi)毒素作用于機(jī)體的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板，以及補(bǔ)體系統(tǒng)和 凝血系統(tǒng)等，便會(huì)產(chǎn)生白細(xì)胞介素1、6、8和腫瘤壞死因子a、組胺、5羥色胺、前列腺素、激 肽等生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)作用于小血管造成功能紊亂而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，臨床表現(xiàn)為 微循環(huán)衰竭、低血壓、缺氧、酸中毒等，于是導(dǎo)致病人休克，嚴(yán)重者可致死亡。其本質(zhì)是大量 生物毒素引發(fā)的機(jī)體過度的炎性反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體自身的損傷，在此過程中，免疫細(xì)胞表面的 TLRs介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是其致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。因此，TLR信號通路的活化必須受到嚴(yán)格 的調(diào)控，防止其過度活化，尤其是炎性因子的過度產(chǎn)生。目前的研究表明很多跨膜和胞內(nèi)分子都能夠負(fù)調(diào)節(jié)TLR信號通路，抑制MyD88依賴性通路的活化和炎性因子的產(chǎn)生，如A20，CYLD，DUBA, SHP-1等，還有某些分子通過減 少細(xì)胞膜表面TLRs受體的表達(dá)來達(dá)到負(fù)調(diào)節(jié)的目的Akira，S.等，Nat. Rev. Immunol. 4， 499-511(2004) ；Liew,F. Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5，446-458 (2005)。針對 TLR介導(dǎo)的信號 傳導(dǎo)通路進(jìn)行的研究和試驗(yàn)已經(jīng)表明，抑制TLR信號傳導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)可以有效地控制細(xì)菌 感染所導(dǎo)致的炎癥性反應(yīng)，預(yù)防和治療細(xì)菌感染導(dǎo)致的休克、器官功能損傷等嚴(yán)重的后果。 已有研究發(fā)現(xiàn)TLR拮抗劑可以應(yīng)用于感染性疾病的預(yù)防和治療，如TLR4拮抗劑TAK-242、 E5564等可以應(yīng)用于嚴(yán)重的敗血癥(III期臨床試驗(yàn))Liew，F(xiàn). Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5， 446-458(2005) ；Cook, D. N.等，Nat Immunol. 2004，5 :975_979。死亡抵抗蛋白(DRP)是第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所于1998年利用大規(guī)模測序的 方法，從健康成年人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞的cDNA文庫進(jìn)行基因表達(dá)分析后 于1998年發(fā)現(xiàn)的，并已經(jīng)在基因數(shù)據(jù)庫GenBank中登錄(GenBank No. AF077599)。DRP, 又稱Nrdpl、FLRF或者RBCC，已有研究表明DRP是E3泛素連接酶的一種，可以泛素化并降 解表皮生長因子家族成員 ErbB3 和 BRUCEAbdullah，J. M.等 Blood Cells Mol. Dis. 27， 320-333 (2001) ；Diamonti, A. J.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，2866—2871 (2002)； Qiu, X. B.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，14843-14848 (2002) ；Qiu, X. B.等 EMB0 J. 23， 800-810(2004) ；Cao, Z.等 Mol. Cell Biol. 27，2180-2188 (2007) ；Yen, L.等 Cancer Res. 66，11279-11286(2006)。DRP是一個(gè)317個(gè)氨基酸組成的蛋白，包括4個(gè)功能域RING finger功能域 (l-57aa)、B_box功能域(2個(gè)TRAF樣鋅指功能域，58_134aa)、卷曲螺旋(coiled-coil)功 能域(CC，135-178aa)和C端的ErbB3結(jié)合區(qū)域(179_317aa)。雖然已有的研究揭示了 DRP/ Nrdpl在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡等方面的作用，但是對于其免疫功能的研究還沒有。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種可有效抵抗細(xì)菌感染、抑制炎性因子產(chǎn)生 的免疫學(xué)活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是提供了 DRP蛋白或其編碼序列在有效抵抗細(xì)菌感染、抑制炎性因子產(chǎn) 生中的新用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預(yù)防或治 療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的一 種或多種因細(xì)菌感染引起的疾病和/或征狀細(xì)菌感染后炎癥因子的過量產(chǎn)生；內(nèi)毒素性 休克或死亡；器官的炎性損傷；多器官功能衰竭。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)菌感染是由選自下組的一種或多種細(xì)菌引 起的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌或糞腸球 菌。在另一優(yōu)選例中，所述炎癥因子為選自下組的一種或多種TNF a、IL_1、IL_6或 I型干擾素，優(yōu)選TNF a、IL_l或IL-6。在另一優(yōu)選例中，所述器官選自肝臟、脾臟、腦或腎臟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述死亡抵抗蛋白選自
(a)SEQ ID NO 2 的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀 活性的蛋白；(c) (a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有 預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，死亡抵抗蛋白是天然純化的蛋白、化學(xué)合成的產(chǎn)物、或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生，優(yōu)選為人死亡抵抗蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主選自細(xì)菌、酵母、高等動(dòng)物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病 和/或征狀的分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂 質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制 缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，在給予本發(fā)明的藥物組合物之前、同時(shí)或之后，給予具有預(yù)防或 治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)。所述具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相 關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)選自臨床常用抗生素(包括內(nèi)酰胺類(青霉 素類和頭孢菌素類)、氨基糖甙類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類、抗真菌抗生素、抗結(jié)核 類抗生素)的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥 物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%o在一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥物組合物總 重量的1 95wt%，優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它 活性物質(zhì)選自臨床常用抗生素(包括內(nèi)酰胺類(青霉素類和頭孢菌素類)、氨基糖甙 類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類、抗真菌抗生素、抗結(jié)核類抗生素)的一種或多種。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀的 方法，所述方法包括給予需要預(yù)防或治療的對象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的一種或多種因 細(xì)菌感染引起的疾病和/或征狀細(xì)菌感染后炎癥因子的過量產(chǎn)生；內(nèi)毒素性休克或死亡； 器官的炎性損傷；多器官功能衰竭。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述細(xì)菌感染是由選自下組的一種或多種細(xì)菌引起的大腸 埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌或糞腸球菌。在另一優(yōu)選例中，所述炎癥因子為選自下組的一種或多種TNF a、IL_1、IL_6或 I型干擾素，優(yōu)選TNF a、IL_l或IL-6。在另一優(yōu)選例中，所述器官選自肝臟、脾臟、腦或腎臟。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1 :DRP真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264. 7細(xì)胞抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥因 子的產(chǎn)生。其中，圖la為定量RT-PCR分析；圖lb為ELISA分析(“*”，P < 0. 05 ；“**，，，P < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖2 :DRP腺病毒載體尾靜脈體內(nèi)注射抑制LPS誘導(dǎo)的血清中炎癥因子的產(chǎn)生 (“***”，P < 0. 001)。圖3 :DRP腺病毒載體尾靜脈體內(nèi)注射降低LPS誘導(dǎo)的小鼠死亡率。圖4 :DRP腺病毒載體尾靜脈體內(nèi)注射抑制LPS誘導(dǎo)的器官大體表現(xiàn)。圖5 :DRP腺病毒載體尾靜脈體內(nèi)注射抑制LPS誘導(dǎo)的血清中AST和ALT的水平 (“**”，P < 0. 01)。圖6 :DRP腺病毒載體尾靜脈體內(nèi)注射抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟顯微病理的改變。圖7 :DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定。其中，圖7a為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定；圖7b為 dn-DRP (功能缺陷型DRP)的轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定；圖7c為DRP和dn-DRP的轉(zhuǎn)基因小鼠大 體外觀。圖8 :DRP轉(zhuǎn)基因抑制TLR配體誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。其中， 圖8a為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞DRP的表達(dá)鑒定；圖8b為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨 噬細(xì)胞炎癥因子定量RT-PCR分析；圖8c為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子ELISA 分析(“*”，P < 0. 05 ;“**”，P < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖9 :DRP轉(zhuǎn)基因抑制LPS誘導(dǎo)的血清中炎癥因子的產(chǎn)生(“**”，P < 0. 01 ;“***， P < 0. 001)。圖10 :DRP轉(zhuǎn)基因降低LPS誘導(dǎo)的小鼠死亡率。圖11 :DRP轉(zhuǎn)基因抑制LPS誘導(dǎo)的血清中AST和ALT的水平(“**”，P < 0. 01)。實(shí)施方式本發(fā)明人通過大量的研究和動(dòng)物模型試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DRP在細(xì)菌感染性疾病中，能有 效抑制細(xì)菌感染后所導(dǎo)致的炎性因子的產(chǎn)生、改善器官功能狀態(tài)、提高患者的生存率。在 此，基礎(chǔ)上本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，針對炎癥相關(guān)基因進(jìn)行應(yīng)用研究是炎癥分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究 的熱點(diǎn)，將炎癥抑制基因的核苷酸和蛋白質(zhì)應(yīng)用于炎癥的預(yù)防和治療是人工干預(yù)細(xì)菌性感 染的有效技術(shù)，因此無論是在功能基因組研究，還是炎癥相關(guān)地基因治療方面均具有廣闊 地應(yīng)用前景。發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)DRP則能使炎性因子的產(chǎn)生減少。在LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克的模型中，觀察到DRP能夠顯著降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 的水平，減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷，提示DRP可能具備治療內(nèi)毒素休克等炎癥性疾病的 應(yīng)用前景。由此，本發(fā)明提供了將DRP抗炎分子應(yīng)用于細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防和治療中的 方法和策略，特別是可用于內(nèi)毒素休克和感染所導(dǎo)致的肝臟損傷。本發(fā)明針對具有抗炎作用的新型抗炎分子DRP，對免疫細(xì)胞中巨噬細(xì)胞在微生物 成分作用下的炎癥因子的產(chǎn)生進(jìn)行了研究，并且驗(yàn)證了應(yīng)用該分子的序列對內(nèi)毒素休克動(dòng) 物的治療和保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)證明1)過表達(dá)DRP可以抑制巨噬細(xì)胞系炎癥因子的產(chǎn)生；2)過 表達(dá)DRP可以抑制血清中炎性因子的產(chǎn)生并提高內(nèi)毒性休克小鼠的生存率；3)過表達(dá)DRP 可以抑制內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致的肝臟損傷；4)DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞 炎癥因子的產(chǎn)生；5)DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制血清中炎癥因子產(chǎn)生并提高內(nèi)毒性休克小鼠的生 存率；6)DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致的肝臟損傷；本發(fā)明針對DRP基因的不同的核苷酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用以抑制炎癥因子的表達(dá)和 細(xì)菌感染所致的內(nèi)毒素性休克和肝臟損傷。這些發(fā)明證實(shí)DRP的相關(guān)產(chǎn)物可望成為治療和 預(yù)防細(xì)菌性感染的有效手段。DRP蛋白(多肽)如本文所用，術(shù)語“死亡抵抗蛋白(多肽)”、“DRP蛋白(多肽)”、“DRP”、“Nrdpl”、 “FLRF”或者“RBCC”可互換使用，是指SEQ ID NO 1的序列(即GenBank No. AF077599)所 編碼的蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)具有抗炎作用的變異或修飾形式。例如，所述DRP蛋白可選自 (a)SEQ ID N0:2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有抑制炎性因子的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等動(dòng)物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本 發(fā)明中DRP蛋白或多肽優(yōu)選由人DRP基因或其同源基因或家族基因編碼。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50 個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè) 以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的DRP蛋白 質(zhì)或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有抑制炎性因子的活性?？刹捎幂椛浠虮┞队谡T變劑下來產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知 的分子生物學(xué)技術(shù)來獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽?？衫镁幋a所述蛋白質(zhì)或多肽的編 碼序列來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并觀察該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對炎癥的抗性是否有所改良來篩選和鑒別 所得蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術(shù)語還包括DRP蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與DRP蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及 利用抗DRP蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含DRP蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 DRP蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有DRP蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較 佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。 DRP蛋白編碼基因 如本文所用，術(shù)語“DRP基因”或“DRP蛋白編碼序列”可互換使用，均是指一種編 碼本發(fā)明所述的DRP蛋白或多肽的序列，其可為SEQ ID N0:1的序列、在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達(dá)對炎性 因子的產(chǎn)生和影響具有一定的抑制作用。本發(fā)明的DRP基因可選自(i)SEQ ID N0:1的序 列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu) 選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的DRP基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放 閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備 的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò) 增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的DRP基因優(yōu)選獲自人，獲自其它動(dòng)物的與人DRP基因高度同源 (如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更 優(yōu)選85 %以上如85 %、90 %、95 %、甚至98 %序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮 的等同范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明還涉及包含DRP基因的載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞， 以及通過轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)DRP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列 可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的DRP蛋白。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼DRP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，術(shù)語“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、動(dòng)物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi) 復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟 動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含DRP編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯 控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體 還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中優(yōu)選使用PCDNA3. 1載體、 PIRES2-EGFP載體、或Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或 是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌， 鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；動(dòng)物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用大腸桿菌細(xì)菌細(xì) 胞或小鼠巨噬細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用 于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。本發(fā)明中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”、或“轉(zhuǎn)化動(dòng)物”可互換使用，均指通過常規(guī)轉(zhuǎn)基因的 方法獲得的轉(zhuǎn)入本發(fā)明DRP基因并穩(wěn)定高表達(dá)DRP蛋白或多肽的細(xì)胞、器官、組織或個(gè)體。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
1=1 o藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明的DRP蛋白 或其編碼序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實(shí)施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現(xiàn)有技術(shù)中已知可治療或預(yù) 防細(xì)菌感染性疾病，例如細(xì)菌感染后炎癥因子的過量產(chǎn)生；內(nèi)毒素性休克或死亡；器官的 炎性損傷；多器官功能衰竭。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和 “由……構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副 反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和 /或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用 后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上
10可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些 載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳 化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中DRP蛋白或其編碼序列有效成分占組合物總重量的0. 001 99. 9wt% ；優(yōu)選為組合物總重量的1 95wt%，較優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。 余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次 服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中DRP 蛋白或其編碼序列的含量為0. 01 2000mg/劑，優(yōu)選0. 1 1500mg/劑，更優(yōu)選1 lOOOmg/劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用1 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用1 3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為1齊U。應(yīng)理解，所用DRP蛋白或其編碼序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重 程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個(gè)體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的 效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或 液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用(1)直接裸DNA或者蛋白質(zhì)注射 法；(2)將DRP的cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復(fù)合物連接，以增強(qiáng)其 生物效應(yīng)；(3)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與帶正電荷的脂類形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷 所致的穿越細(xì)胞膜的困難；⑷用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)DNA、mRNA和蛋白質(zhì)后介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，既有利 于大分子的順利進(jìn)入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與膽固醇 結(jié)合使其胞漿保持時(shí)間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)可使其特異 性轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì) 胞)也可較好地將DRP相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；(8)電打孔(electroporation)，即借助于 電流將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)入靶細(xì)胞。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和治療細(xì)菌感染性疾病的其它活性物 質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組臨床常用抗生素包括3 -內(nèi)酰胺類(青霉素類和頭孢 菌素類)、氨基糖甙類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類、抗真菌抗生素、抗結(jié)核類抗生素) 的一種或多種。本發(fā)明的DRP相關(guān)的核苷酸和蛋白質(zhì)藥物相互間可以聯(lián)合應(yīng)用，還可以與其它藥 物和治療手段聯(lián)合，用于細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明揭示了 DRP及其編碼序列的新功能，即抑制細(xì)菌感染所導(dǎo)致的炎癥因子 的表達(dá)、保護(hù)內(nèi)毒素休克機(jī)體的肝臟功能、提高感染個(gè)體的生存率；2.本發(fā)明提供了一種可有效抑制細(xì)菌感染所導(dǎo)致的炎癥因子的表達(dá)、保護(hù)內(nèi)毒素 休克機(jī)體的肝臟功能、提高感染個(gè)體的生存率的新型藥物。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1 過表汰DRP對巨噬細(xì)胞系RAW264. 7炎癥因子的產(chǎn)牛的抑制作用首先采用pcDNA3. 1 (購自Invitrogen公司)作為真核表達(dá)載體，將帶有BamHI/ Kpnl酶切位點(diǎn)的DRP的cDNA產(chǎn)物插入該載體的相應(yīng)位置，在E. Coli菌株DH_5 a內(nèi)擴(kuò) 增該載體，測序鑒定后純化得到DRP的真核表達(dá)載體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染試劑JetPei購自 Polyplus公司)小鼠RAW264.7細(xì)胞(購自ATCC)，然后將所得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(1X105個(gè) 細(xì)胞/ml RPMI 1640培養(yǎng)基)，以100ng/ml LPS (又稱脂多糖，為TLR4的配體，購自Sigma 公司)處理不同時(shí)間后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，制備cDNA用于定量RT-PCR(94°C，30Sec ； 58°C,30Sec ；72°C,30Sec ；共30循環(huán))檢測炎癥因子mRNA水平；或者用培養(yǎng)上清通過 ELISA(所用試劑盒購自R&D公司)檢測炎癥因子蛋白水平。定量RT-PCR分析和ELISA分析的結(jié)果分別如圖la和圖lb所示。結(jié)果顯示DRP 真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264. 7細(xì)胞抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥因子TNF a和IL-6 的產(chǎn)生。該結(jié)果表明過表達(dá)DRP可以抑制巨噬細(xì)胞系炎癥因子的產(chǎn)生。實(shí)施例2 過表達(dá)DRP對血清中炎性因子的產(chǎn)生的抑制作用及其對內(nèi)毒性休克小 鼠生存率的影響首先采用Adeno-X病毒載體系統(tǒng)(購自Clontech公司)中的pShuttle2作為克 隆載體，在Sail和Xhol酶切位點(diǎn)間插入DRP的cDNA，在HEK293細(xì)胞中將穿梭質(zhì)粒與病 毒DNA進(jìn)行重組，并且擴(kuò)增后，用腺病毒純化試劑盒(購自Clontech公司)。將1 X 107PFU Ad-DRP尾靜脈注射入小鼠(6周雄性SDF級C57BL6小鼠，購自Sipper BK公司)，48h后腹 腔內(nèi)注射LPS (15mg/kg)。4h后眼球取血法收集小鼠血清，用ELISA法(購自R&D公司)檢 測血清中炎性因子TNF a、IL-6以及IL_1 ^的表達(dá)水平，并動(dòng)態(tài)觀察小鼠的生存率。對血清中炎性因子TNF a、IL-6以及IL-1 ^表達(dá)水平的ELISA分析結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示Ad-DRP腺病毒在小鼠體內(nèi)的過表達(dá)可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的血清中炎性 因子TNFa、IL-6以及IL_1 ^的水平。該結(jié)果表明過表達(dá)DRP可以抑制血清中炎性因子 的產(chǎn)生。小鼠生存率試驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示Ad_DRP腺病毒在小鼠體內(nèi)的過表 達(dá)可以提高小鼠的生存率至40% (LPS注射后72h)。該結(jié)果表明過表達(dá)DRP可以提高內(nèi) 毒性休克小鼠的生存率。^MM 3 d寸表達(dá).DRP X寸內(nèi)毒素休克所致器官損傷的抑泡K乍用構(gòu)建DRP的復(fù)制缺陷型腺病毒載體(同實(shí)施例2)。將1 X 107PFU Ad-DRP尾靜脈注射入小鼠(同實(shí)施例2)，48h后腹腔內(nèi)注射LPS(15mg/kg)。4h后收集小鼠血清，采用生 化自動(dòng)分析儀(購自SRL公司)檢測血清中AST和ALT水平作為肝臟損傷標(biāo)志。24h后收 取小鼠肝臟、脾臟和大腦，觀察大體病理改變，并且切片做HE染色，觀察肝臟的顯微病理改 變(重點(diǎn)觀察壞死、空泡形成以及炎性細(xì)胞浸潤等)。DRP腺病毒載體對小鼠血清中AST和ALT的影響試驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯 示Ad-DRP腺病毒在小鼠體內(nèi)的過表達(dá)可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的血清中AST和ALT的水平。 該結(jié)果表明過表達(dá)DRP可以抑制內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致的肝臟損傷。DRP腺病毒載體對小鼠器官保護(hù)作用試驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示，DRP腺病毒載體抑制 LPS誘導(dǎo)的肝臟顯微病理觀察結(jié)果如圖4和6所示。結(jié)果顯示Ad-DRP腺病毒在小鼠體內(nèi) 的過表達(dá)可以減少肝臟、脾臟和大腦的充血和出血狀況，并且可以在顯微水平降低肝臟組 織內(nèi)的壞死、空泡和炎性細(xì)胞浸潤。該結(jié)果表明過表達(dá)DRP可以抑制內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致的 器官損傷，尤其是肝臟損傷。實(shí)施率DRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈髞碓锤骨痪奘杉?xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生的抑制作用
采用pIRES2-EGFP載體(來自于北京生物技術(shù)研究所所贈(zèng))作為表達(dá)載體，使用 Ub啟動(dòng)子，將DRP的編碼cDNA插入Bglll/Sall位點(diǎn)，通過顯微注射的方法將線性化后的載 體注射入小鼠卵子，移植入雌性C57BL6小鼠(同實(shí)施例2)子宮，然后檢測新生鼠是否表達(dá) DRP (檢測鼠尾DNA中DRP的表達(dá))，建立轉(zhuǎn)基因小鼠。給DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射lml肉湯 (購自Sigma)，三天后以PBS沖洗腹腔獲得巨噬細(xì)胞。然后分別用lOOng/ml LPS, 1 u M CpG 0DN(由上海生工合成，然后去內(nèi)毒素純化)，10iig/ml poly(I:C) (p(I:C)(購自Sigma), 1 u g/ml 肽聚糖 PGN(p印tidoglycan，購自 Sigma)，20 ii g/ml R837 (購自 Invivogeng 公 司)處理腹腔巨噬細(xì)胞(IX 105個(gè)細(xì)胞/ml RPMI 1640培養(yǎng)基)。2h后收集細(xì)胞做定量 RT-PCR(方法同實(shí)施例1)分析，4h后收集培養(yǎng)上清用于ELISA (所用試劑盒購自R&D公司) 分析。DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果如圖7和圖8a所示。結(jié)果顯示我們所得小鼠鼠尾基 因組DNA中包含DRP序列，而且轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)DRP的mRNA和蛋白質(zhì)。 該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因小鼠成功建立而且腹腔巨噬細(xì)胞能夠應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。DRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖8b，c所示。 結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在受到TLR配體刺激后表達(dá)的炎性因子TNFa的 mRNA和蛋白均明顯降低。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥 因子的產(chǎn)生。實(shí)施例5 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)ρ逯醒装Y因子產(chǎn)生的抑制作用以及對內(nèi)毒性休克小鼠 生存率的影響給DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(實(shí)施例4中獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠)腹腔內(nèi)注射LPS(購自Sigma 公司，15mg/kg)。4h后收集小鼠血清，ELISA法檢測血清中炎性因子的表達(dá)水平(方法同實(shí) 施例2)，并動(dòng)態(tài)觀察小鼠生存率。對血清中炎性因子TNF a以及IL_1 0表達(dá)水平的ELISA分析結(jié)果如圖9所示。結(jié) 果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠血清中炎性因子TNFa和IL_1 0的水平在LPS刺激后較對照組顯 著降低。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制血清中炎癥因子產(chǎn)生。小鼠生存率試驗(yàn)的結(jié)果如圖10所示。結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS刺激后的生存率較對照組顯著升高。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以提高內(nèi)毒性休克小鼠的生存率。t施徹丨6 :DRP轉(zhuǎn)對內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致肝員傷的{呆護(hù)作用DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(實(shí)施例4中獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠)腹腔內(nèi)注射LPS(購自Sigma公 司，15mg/kg)。4h后收集小鼠血清，檢測血清中AST和ALT水平(方法同實(shí)施例3)作為肝 臟損傷標(biāo)志。試驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS刺激后的血清中AST和 ALT的水平較對照組顯著降低。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制內(nèi)毒素休克所導(dǎo)致的肝臟 損傷。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120> 一種新型抗炎分子DRP的抗炎作用、實(shí)施方法及用途<130)092741<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3129<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222> (214). . (1167)<220><221>misc_feature<222> (2703). . (2703)<223>n = a，c，g，t 或 u<400>1gggcgagtac tcctgattgt gacatcacat tcatcccctg ggcgatggag cttgtcactg 60ggaaggaata ctcagtcgga gaatagccaa caagatgggt tactgggaga atctcttcag 120tggcactgag tggaggcatc agggggttgg agccttgtga acagggaacc tgccccccaa 180cacttggaag gacctgggtt tcagtgatga gac atg ggg tat gat gta acc cgt 234Met Gly Tyr Asp Val Thr Arg15ttc cag ggg gat gtt gac gaa gat ctt ate tgc cct att tgc agt gga 282Phe Gin Gly Asp Val Asp Glu Asp Leu lie Cys Pro lie Cys Ser Gly101520
gtcttggaggagccagtacaggcacctcattgtgaacatgetttctgc330
ValLeuGluGluProValGlnAlaProHisCysGluHisAlaPheCys
253035
aacgcctgcateacccagtggttctctcagcaacagacatgtccagtg378
AsnAlaCyslieThrGlnTrpPheSerGlnGlnGlnThrCysProVal
40455055
gacCgtagtgttgtgacggtcgcccatCtgCgCccagtaccteggate426
AspArgSerValValThrValAlaHisLeuArgProValProArglie
606570
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30531031權(quán)利要求
死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下 組的一種或多種因細(xì)菌感染引起的疾病和/或征狀細(xì)菌感染后炎癥因子的過量產(chǎn)生；內(nèi) 毒素性休克或死亡；器官的炎性損傷；多器官功能衰竭。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述細(xì)菌感染是由選自下組的一種或多種 細(xì)菌引起的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌或 糞腸球菌。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白選自(a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；(b)與SEQID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性 的蛋白；(c)(a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有預(yù)防 或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQID NO 1 的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或 征狀的分子。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射 法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、 復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。
7.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及 其編碼序列占藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%。
9.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.一種預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀的方法，所述方法包括給予需要預(yù) 防或治療的對象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型抗炎分子DRP的抗炎作用、實(shí)施方法及用途。具體涉及死亡抵抗蛋白(death resistant protein，DRP)在抵抗細(xì)菌感染中的用途和應(yīng)用方法。本發(fā)明提供這種分子在抗細(xì)菌感染過程中的應(yīng)用方法及相應(yīng)的免疫學(xué)原理。本發(fā)明公開了這種分子在抗細(xì)菌感染中的用途和策略，特別是應(yīng)用于細(xì)菌感染導(dǎo)致的感染性休克、內(nèi)毒素性休克的預(yù)防和治療。本發(fā)明證實(shí)了這種分子可以抑制細(xì)菌感染后炎癥因子的產(chǎn)生，提高內(nèi)毒素性休克中機(jī)體的存活率，保護(hù)肝臟等臟器在感染后免于炎性損傷。
文檔編號A61P31/04GK101897951SQ20091005224
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者曹雪濤, 汪晨, 陳濤涌 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)