專利名稱：用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A₂的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑。鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑包括化學(xué)藥物和基因藥物，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是抗癌癥治療藥物。
背景技術(shù)：
磷脂酶A2 (PLA2)催化甘油磷脂SN-2位酯鍵的水解，生成溶血磷脂，如溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA)或溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)和自由脂肪酸，如花生四烯酸(arichidonic acid，AA)。這些產(chǎn)物直接或間接地調(diào)控細(xì)胞的生理活動(dòng)、炎癥應(yīng)答和相關(guān)基因表達(dá)?；ㄉ南┧嵬ㄟ^(guò)兩種代謝途徑生成包括前列腺素、 血栓烷和白三烯等類花生酸，這些具有生物活性的類脂介質(zhì)通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。LPA是由一個(gè)?；?、一個(gè)甘油骨架和一個(gè)磷酸基團(tuán)組成的最簡(jiǎn)單的甘油磷脂，是一種存在于生物體內(nèi)的有生物活性的天然磷脂小分子，它既是合成細(xì)胞膜磷脂和三脂酰甘油的重要前體，又是細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶作用下水解的產(chǎn)物。作為一種內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，LPA具有多種生物學(xué)功能(Sherbet, G. V. and Patil, D. (2003)Genetic abnormalities of cell proliferation, invasion andmetastasis, with special reference to gynaecological cancers. Anticancer Res. 23，1357-1371)。LPA誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和生存，它的生物學(xué)作用主要通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而實(shí)現(xiàn)。LPA在生殖系統(tǒng)中起到重要的生理禾口病理作用(Fang, X.，Schummer, M.，Mao, M.，Yu, S.，Tabassam, F. H.，Swaby, R.， Hasegawa, Y. , Tanyi, J. L. , LaPushin, R. , Eder, A. et al. (2002) Lysophosphatidic acid is a bioactive mediator in ovarian cancer. Biochim. Biophys. Acta 1582,257-264 ； Conover, C. A. , Hartmann, L. C. , Bradley, S. , Stalboerger, P. , Klee, G. G. , Kalli, K. R. and Jenkins, R. B. (1998)Biological characterization of human epithelial ovarian carcinoma cells inprimary culture :the insulin-like growth factor system. Exp. Cell Res. 238，439-449)。LPA參與卵巢的排卵周期，影響卵母細(xì)胞的成熟；LPA影響精細(xì)胞受精時(shí)的頂體反應(yīng)。迄今為止，在所有不同的病理過(guò)程中，LPA在卵巢癌中的作用被研究得最充分，LPA被證明是卵巢癌的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子(Hirte，H. W.，Kaiser, J. S. and Bacchetti, S. Establishment and characterization offour human epithelial ovarian carcinoma cell lines. Cancer,1994，74，900-906)。磷脂酶A2 (PLA2)主要分為三類分泌型磷脂酶A2 (secreted PLA2, sPLA2)、胞漿型磷脂酶A2(calcium-d印endent cytosolic PLA2, cPLA2)和鈣離子非依賴性磷脂酶 A2(calcium-independent phospholipase A2, iPLA2)。CPLA2 禾口 SPLA2 主要參與激活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的類脂代謝調(diào)節(jié)，IPLA2則主要調(diào)節(jié)基礎(chǔ)水平類脂代謝、參與磷脂重組和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重組以及保持細(xì)胞磷脂水平的穩(wěn)定。PLA2在多種腫瘤組織中有高表達(dá)，是潛在的治療惡性腫瘤的靶標(biāo)。PLA2包括胞漿型磷脂酶A2 (CPLA2)、分泌型磷脂酶A2 (SPLA2)和鈣離子非依賴性磷脂酶A2 (iPLA2)。目前SPLA2已被作為潛在的治療結(jié)腸直腸癌的靶標(biāo)(W02006/076414)，SPLA2的抗體還可用于治療炎癥性疾病(W02004/050850)。而PLA2的復(fù)合抑制劑(包括cPLA2、iPLA2以及SPLA2)可用于治療神經(jīng)損傷及其疾病(W02009009449A2)。iPLA2主要包括iPLA2 β和 IPLA2 y , IPLA2 β主要存在于胞漿中，而iPLA2Y主要存在于過(guò)氧化物酶體中。iPLA2 β在許多細(xì)胞和組織中表達(dá)，在細(xì)胞代謝中起重要作用。iPLA2i3的抑制劑可以作為治療糖尿病(KR200601285^A)、脂肪肝(KR20060124472A)的藥物，并且被發(fā)現(xiàn)可以抑制脂肪組織分化，但是還沒(méi)有專利報(bào)道其在治療癌癥方面的應(yīng)用。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)iPLA2 β在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制iPLA2i3的活性可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、卵巢癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 IPLA2^的抑制劑是治療卵巢癌的有效藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)一種新型有效抑制生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的專一性化學(xué)藥物和基因藥物。本發(fā)明的原理在于通過(guò)iPLA2 β的專一性化學(xué)抑制劑和shRNA來(lái)抑制iPLA2 β 的活性，從而抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑主要包括化學(xué)藥物溴烯醇內(nèi)酯(bromoenol lactone, BEL)和基因藥物iPLA2 β基因的shRNA。其中的化學(xué)藥物溴烯醇內(nèi)酯還包括溴烯醇內(nèi)酯的手性異構(gòu)體S-BEL。1.溴烯醇內(nèi)酯(BEL)通過(guò)抑制iPLA2i3酶的活性來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)大部分的卵巢癌細(xì)胞在無(wú)血清條件下能夠自主增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)。在缺乏外源性生長(zhǎng)因子的條件下，卵巢癌細(xì)胞株大部分細(xì)胞處于G1期，S期、G2/分裂期的細(xì)胞所占比例很少。這表明細(xì)胞數(shù)量的持續(xù)增加是由于緩慢但持續(xù)的細(xì)胞周期。為了探索卵巢細(xì)胞增殖失控的機(jī)制以及潛在的干預(yù)治療的方法，我們研究了生長(zhǎng)因子非依賴型的卵巢癌細(xì)胞的增殖是否與胞內(nèi)PLA2的活動(dòng)有關(guān)。磷脂酶A2潛在地參與了卵巢癌細(xì)胞的遷移以及脂類生長(zhǎng)因子的分泌這些可能構(gòu)成循環(huán)刺激以驅(qū)動(dòng)卵巢癌細(xì)胞的增殖。BEL是iPLA2和鎂離子依賴性磷脂酸磷酸酶的不可逆抑制劑，可溶于乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等溶劑。在美國(guó)西格瑪、開(kāi)曼等多家公司都有銷售，我們采用的BEL購(gòu)買于西格瑪-奧德里奇公司。我們測(cè)定了在無(wú)血清條件下增殖的卵巢癌細(xì)胞中iPLA2i3及CPLA2的抑制劑的具體的藥理作用。與對(duì)照組(只加BEL載體(vehicle)相比，iPLA2的抑制劑BEL (S-BEL同樣具有很好的效果，在本說(shuō)明書(shū)中均以BEL表示)能夠強(qiáng)烈阻止各種卵巢癌細(xì)胞株包括 0VCAR-3, SK0V-3和D0V-13的增長(zhǎng)。BEL對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性。當(dāng)藥量低至0. 5 μ M時(shí)仍然產(chǎn)生顯著效果。在卵巢癌細(xì)胞株4天的培養(yǎng)過(guò)程中采用0. 2 μ M的BEL 處理(濃度較先前報(bào)道的降低了 5到10倍)強(qiáng)烈抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，該結(jié)果表明iPLA2i3 的活性在生長(zhǎng)因子非依賴性的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)中起決定性作用(圖1)，抑制iPLA2i3活性同樣抑制前列腺癌細(xì)胞如DU145、PC3的生長(zhǎng)，說(shuō)明iPLA2i3在生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中都有類似作用。經(jīng)比色染色法所得的分析結(jié)果表明，與BEL相比，吡咯烷(pyrrolidine，CPLA2的抑制劑)在藥理濃度(0.5 Ι.ΟμΜ)下對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，說(shuō)明CPLA2W 活性并不是卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。與此一致的是，若以專一小干擾RNA(SiRNA)阻止 CPLA2Q (CPLA2的一種主要同工酶)的表達(dá)并不會(huì)干擾卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)因子非依賴性的增殖，與對(duì)照組(control siRNA，控制siRNA)相比，cPLA2 α siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯區(qū)別(圖2)。2. IPLA2ShRNA抑制iPLA2 β的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)體外細(xì)胞進(jìn)行iPLA2 β酶法檢測(cè)證實(shí)BEL確實(shí)能夠通過(guò)iPLA2 β產(chǎn)生影響，在所有的卵巢癌細(xì)胞株的細(xì)胞裂解液中添加BEL均能夠明顯抑制iPLA2 β的活性。盡管BEL不影響其他PLA2酶，但它已被證明能夠抑制磷脂酸磷酸水解酶。因此為了證明iPLA2i3參與細(xì)胞增殖，我們運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)的iPLA2i3 shRNA (主要指以iPLA2 β cDNA序列中40-60中的核苷酸的序列為序列1(GTCACCAACT TGTTCTCTAAC)和810-831中的核苷酸的序列為序列 2 (GATCATCAGCATGGACAGCAGC)或二者之一為靶的shRNA)來(lái)下調(diào)參與其他類型細(xì)胞的增殖調(diào)控的iPLA2亞型-iPLA2i3的表達(dá)，結(jié)果表明與未經(jīng)病毒感染(uninfected)或者已感染的非靶序列感染的細(xì)胞(control shRNA)相比，敲減iPLA2i3 (iPLA2 β shRNA)的表達(dá)，強(qiáng)烈抑制0VCAR-3、SK0V-3及Dov_13細(xì)胞生長(zhǎng)的的(圖3)。對(duì)Dov_13及0VCAR-3細(xì)胞進(jìn)行shRNA 處理，比色染色，無(wú)血清條件下培養(yǎng)1天后檢測(cè)到細(xì)胞增長(zhǎng)率明顯下降；而SK0V-3細(xì)胞在培養(yǎng)兩天后能觀察到細(xì)胞增長(zhǎng)率下降。本發(fā)明所述iPLA2 β基因的shRNA包括針對(duì)iPLA2 β基因的所有有效抑制 iPLA2mRNA表達(dá)的shRNA核苷酸片段。3.抑制iPLA2i3活性能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡IPLA2的活性受抑制，細(xì)胞存活率也同樣下降，兩者相關(guān)聯(lián)。我們通過(guò)測(cè)定BEL對(duì) IPLA2^的抑制作用是否影響細(xì)胞凋亡來(lái)評(píng)估這種可能性。大部分卵巢癌細(xì)胞系都能抵制血清饑餓引起的細(xì)胞凋亡。在無(wú)血清條件下培養(yǎng)兩天之后，熒光共軛膜連蛋白質(zhì)V(ArmeXin V)染色分析表明僅有一小部分的0VCAR-3、SK0V-3及Dove-13發(fā)生細(xì)胞凋亡。2 μ M的BEL 抑制細(xì)胞中的iPLA2i3活性，從而導(dǎo)各細(xì)胞系細(xì)胞凋亡百分率的平穩(wěn)上升。通過(guò)shRNA抑制iPLA2i3的表達(dá)同樣增加了卵巢癌細(xì)胞在無(wú)血清條件下的細(xì)胞凋亡。4.抑制iPLA2 β的活性誘導(dǎo)細(xì)胞周期ρ53基因非依賴性的S期&/Μ期阻滯IPLA2活性受到細(xì)胞周期的調(diào)控，在增殖T細(xì)胞、CHO-Kl細(xì)胞中G2/M期和S期的后期能觀察到最高的iPLA2活性，這表明適度的iPLA2活性的調(diào)控對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行是必要的。 我們檢測(cè)了抑制iPLA2i3活性而產(chǎn)生的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是否由于細(xì)胞周期阻滯而引起。將卵巢癌細(xì)胞在2 μ MBEL或者無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 3天用流式細(xì)胞儀對(duì)每日所得細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分布(Phase distribution)分析。我們發(fā)現(xiàn)BEL處理后0VCAR-3、 SK0V-3及Dove-13等p53缺失型(p53 negative)細(xì)胞株在Gl期的細(xì)胞數(shù)量的一致減少， 而S期和(VM期有明顯的細(xì)胞積聚。而不加BEL的對(duì)照組(vehicle) 0VCAR-3和SK0V-3細(xì)胞經(jīng)3天(Day3)培養(yǎng)之后大部分細(xì)胞處于G1期(70% 75% )，小部分處于S期(15% 20% )約10%處于MAi2期(圖4、5)。這證明了 iPLA2i3的活性對(duì)于非生長(zhǎng)因子依賴性的細(xì)胞周期由S期向&/M期過(guò)渡是必需的。INS-I胰島腺瘤細(xì)胞中，由iPLA2受抑制而產(chǎn)生的G1細(xì)胞周期阻滯是依賴于P53腫瘤抑制基因的。而0VCAR-3和SK0V-3是P53基因缺陷型(p53 negative)的細(xì)胞株，這也許是BEL處理不導(dǎo)致G1期細(xì)胞阻滯的原因。因此，我們檢驗(yàn)其他具有正常P53基因(p53wt) 卵巢癌細(xì)胞系(如0VCA-420、0VCA-433)對(duì)BEL的反應(yīng)。對(duì)這兩個(gè)P53陽(yáng)性的細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行BEL處理，細(xì)胞周期分析表明仍有S期及G2/M期細(xì)胞阻滯的現(xiàn)象，但沒(méi)有G1期細(xì)胞阻滯，證實(shí)了在卵巢癌細(xì)胞中iPLA2對(duì)細(xì)胞周期通過(guò)S期和&/M期的作用是不依賴于一個(gè)P53 的(圖5)。經(jīng)BEL處理的細(xì)胞明顯的積累于S期和&/M期，與此一致的是，免疫印跡分析表明在S期及&/M期細(xì)胞中相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子如周期蛋白B、周期蛋白E表達(dá)水平上調(diào)。 SK0V-3和0VCAR-3細(xì)胞中表現(xiàn)出的周期蛋白D1低水平表達(dá)與BEL無(wú)關(guān)。在BEL處理的細(xì)胞中能觀察到c-Myc (基因)表達(dá)水平下調(diào)。在G1期c-Myc表達(dá)達(dá)到峰值從而推動(dòng)細(xì)胞從 G1期向S期過(guò)渡，這一表達(dá)水平的下降反映了 iPLA2受抑制引起的G1期細(xì)胞部分減少。5. shRNA敲減 Ρ1Α2β表達(dá)抑制了裸鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生、發(fā)展為了進(jìn)一步探索1 1^2調(diào)節(jié)體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞增殖的生物學(xué)意義，本發(fā)明人研究了 IPLA2下調(diào)對(duì)卵巢癌SK0V-3和0VCAR-3細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)的影響。Dov_13不能在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，因而不能用于體內(nèi)研究。實(shí)驗(yàn)證明慢病毒介導(dǎo)的shRNA使iPLA2 β的表達(dá)水平穩(wěn)定下降。將未感染(uninfected)的SK0V-3和感染了攜帶一個(gè)非目標(biāo)序列的受控病毒(control virus)的SK0V-3皮下注射對(duì)于裸鼠具有高致瘤性。但是感染了攜帶iPLA2 β shRNA的病毒之后致瘤性減少，這表現(xiàn)為腫瘤體積(tumor volume)減少和生長(zhǎng)速度的減慢(圖6)。 IPLA2^基因敲減同樣顯著減少了 0VCAR-3的在裸鼠體內(nèi)致瘤性。免疫印跡及熒光顯微鏡表明共同表達(dá)的綠色熒光蛋白質(zhì)存在于病毒感染的腫瘤細(xì)胞中，證實(shí)了 shRNA在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)期穩(wěn)定的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果表明了抑制iPLA2i3活性能提供一個(gè)新型的控制腫瘤生長(zhǎng)及惡化的策略。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明涉及溴烯醇內(nèi)酯及iPLA2 β shRNA用于治療卵巢癌。卵巢癌是女性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，對(duì)女性健康造成嚴(yán)重威脅。本發(fā)明提供了一種治療生殖系統(tǒng)惡性腫瘤， 特別是卵巢癌的有效方法，iPLA2i3的基因藥物或化學(xué)抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤的形成發(fā)展都有非常明顯的抑制作用，可以有效控制卵巢癌的發(fā)展，為卵巢癌患者帶來(lái)延長(zhǎng)生命和康復(fù)的機(jī)會(huì)。


圖1，iPLA2的抑制劑BEL抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)圖2，CPLA2化學(xué)抑制劑或siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用圖3，慢病毒介導(dǎo)的shRNA抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)圖4、BEL對(duì)0VCAR3細(xì)胞周期的影響圖 5、BEl 對(duì) 0VCA-420、0VCA-433 生長(zhǎng)周期的影響圖6、shRNA抑制iPLA2活性，從而抑制卵巢癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，腫瘤發(fā)生、發(fā)
展
具體實(shí)施例實(shí)施例1 在裸鼠皮下注射卵巢癌細(xì)胞SK0V3 —周后，每天注射一次BEL(劑量0. 5 Img/ kg)，對(duì)照組注射BEL載體(DMS0)，然后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，一個(gè)月可以觀察到，BEL藥物組與對(duì)照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，藥物處理組和對(duì)照組的腫瘤大小分別為0. 09cm3 和 0. 35cm3，腫瘤減小了 74%。實(shí)施例2 在裸鼠皮下注射感染iPLA2shRNA慢病毒的卵巢癌細(xì)胞SK0V3，對(duì)照組注射shRNA 空載體，然后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，一個(gè)月后可以觀察到，iPLA2shRNA組與對(duì)照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，腫瘤大小分別為0. 07cm3和0. 32cm3，腫瘤減小了 78%。實(shí)施例3 在裸鼠皮下注射iPLA2shRNA慢病毒感染的卵巢癌細(xì)胞0VCAR-3，對(duì)照組注射 shRNA空載體，然后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，在兩個(gè)月后可以觀察到，iPLA2shRNA組與對(duì)照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，腫瘤大小分別為0. 05cm3和0. 25cm3，腫瘤減小了 80%。序列表<110>江南大學(xué)<120>用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑<130><160>2<170>Patentin version 3. 1<210>1<211 >21<212>DNA<213>人工序列<220><223>iPLA2 β cDNA序列中40-60位的核苷酸序列<400>1GTCACCAACT TGTTCTCTAA C 21<210>2<211>22<212>DNA<213X213〉人工序列<220><223>iPLA2 β cDNA序列中810-831位的核苷酸序列<400>2GATCATCAGC ATGGACAGCA GC 2權(quán)利要求
1.用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特征在于鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑主要包括化學(xué)藥物溴烯醇內(nèi)酯和基因藥物iPLA2i3基因的shRNA。
2.如權(quán)利要求1所述用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特征在于其中的化學(xué)藥物溴烯醇內(nèi)酯還包括溴烯醇內(nèi)酯的手性異構(gòu)體S-BEL。
3.如權(quán)利要求1所述用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特征在于其中的基因藥物iPLA2i3基因的shRNA包括針對(duì)iPLA2i3基因的所有有效抑制iPLA2mRNA 表達(dá)的shRNA核苷酸片段。
4.權(quán)利要求1、3所述的用于治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特征在于其中的siRNA主要指以iPLA2 β cDNA序列中40-60中的核苷酸的序列為序列1和 810-831中的核苷酸的序列為序列2或二者之一為靶的shRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及鈣離子非依賴性磷脂酶A2(iPLA2β)的化學(xué)抑制劑溴烯醇內(nèi)酯及短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)用于治療生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。磷脂酶A2參與細(xì)胞膜磷脂的重組及溶血磷脂生長(zhǎng)因子的生成，因而在細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。作為磷脂酶家族的一員，鈣離子非依賴性磷脂酶A2(iPLA2β)在多種腫瘤如卵巢癌、前列腺癌中高表達(dá)。iPLA2β的化學(xué)抑制劑溴烯醇內(nèi)酯(bromoenol lactone，BEL)或它的手性異構(gòu)體S-BEL、iPLA2β基因的shRNA抑制iPLA2β的活性，從而抑制生殖系統(tǒng)腫瘤，如卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤的形成。iPLA2β的化學(xué)抑制劑BEL、S-BEL和iPLA2β基因的shRNA是治療生殖系統(tǒng)腫瘤(卵巢癌)的有效藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102166364SQ201110093299
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者宋元達(dá), 張灝, 趙建新, 陳衛(wèi) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)