一種枝孢霉表達(dá)的磷脂酶c及其產(chǎn)生菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶脫膠領(lǐng)域，具體說是一種枝孢霉表達(dá)的磷脂酶C及其產(chǎn)生菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酶（Phospholipase,PL)是生物體內(nèi)存在的能水解甘油磷脂的酶，水解產(chǎn)物 為各種磷脂酸和氨基醇，如膽胺、膽堿、絲氨酸、乙醇胺等。根據(jù)磷脂酶水解甘油磷脂的位點 不同，可將憐脂酶分為憐脂酶A(PhospholipaseA，PLA)、憐脂酶B(PhospholipaseB，PLB)、 憐脂酶C(PhospholipaseC，PLC)和憐脂酶D(PhospholipaseD，PLD)，如圖 1 所不。
[0003] 磷脂酶可廣泛應(yīng)用于油脂精練、磷脂改性、飼料改良劑、食品工業(yè)和醫(yī)藥等方面。 脫膠是植物油精煉過程中的一個重要環(huán)節(jié)，對提高油的品質(zhì)至關(guān)重要，脫膠主要是脫除磷 月旨，脫膠若不徹底，會影響油品的深加工和油品的穩(wěn)定性，減低油品貨架期。酶法脫膠可以 克服傳統(tǒng)脫膠方法脫膠脫除率低，同時中性油損失高等的問題。而在酶法脫膠工藝中，現(xiàn)有 文獻(xiàn)多報道磷脂酶PLA用于植物油脫膠。磷脂酶PLA(包括PLA1和PLA2)，脫膠后可產(chǎn)生極 性溶血磷脂和極性脂肪酸，PLA脫膠工藝僅僅損失油中總的磷脂分子，來減少精煉損耗。而 磷脂酶PLC酶通過選擇性水解磷酸酯官能團(tuán)與磷脂反應(yīng)，生成甘油二酯（DAG)和磷脂酸基 團(tuán)，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脫膠工藝通過保留原始的磷脂分子而僅去除磷酸酯 官能團(tuán)來減少精煉損耗，不存在PLA脫膠工藝中產(chǎn)生的能提高脫膠油酸價的極性脂肪酸的 問題，PLC用于脫膠優(yōu)勢明顯好于PLA。
[0004] 磷脂酶C(PLC)可來源于動物和微生物。文獻(xiàn)報道磷脂酶C細(xì)菌來源的有： 粘質(zhì)沙雷氏菌武漢株（Serratiamarcescenswuhanstrain)、假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridumperfringens)、諾氏梭狀芽孢桿 菌（Closrtidiumnovyi)、雙酶梭狀芽抱桿菌（clostridiumbifermantans)、洋蔥假單 胞菌（Pseudomonascepacia)、金黃色葡萄球菌（staphylococcusaureus)、錯狀芽抱 桿菌（Bacilluscereus)、蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis)、類鼻疽伯克 氏菌（burkholderiapseudomallei)。憐脂酶C霉菌來源的有：煙曲霉（Aspergillus fumigates)、黃曲霉（Aspergillusflavus)、自佐氏曲霉菌（Aspergillussaitoi)。憐脂 酶C酵母來源的有白色念珠菌（canidiaAlbicans)。JP50-1017183報道斯谷假單胞菌 (Pseudomonasschuylkilliensis)可以產(chǎn)憐脂酶C。JP49-55893 報道來源于streptomyces hachijyoensis的憐脂酶C。
[0005] 在以上所報道的磷脂酶C產(chǎn)生菌株中，除了鼠李糖乳桿菌、米曲霉和黑曲霉等少 部分菌株外大都均存在一定的致病性，因而制約了其的工業(yè)化開發(fā)。另外，雖然以上文獻(xiàn) 公開了這些菌能夠產(chǎn)生胞外磷脂酶C，但是除了錯樣芽孢桿菌（Bacilluscereus)等少數(shù) 幾個細(xì)菌來源的PLC外，大部分并沒有進(jìn)一步公開這些磷脂酶的性質(zhì)，更少有PLC產(chǎn)量、制 備方法和酶學(xué)性質(zhì)的報道。其中，真核微生物特別是絲狀真菌來源的胞外磷脂酶C的報 道則更少，報道的內(nèi)容也更簡單。在以上這些關(guān)于胞外磷脂酶C的報道中，大部分的胞外 PLC都只能作用于相對單一的底物，如有的作用于磷脂酰膽堿/磷脂酰乙醇胺，有的僅能 作用于磷脂酰肌醇等。鮮見有能夠同時高效地作用于多種底物特別是大豆來源含有多種 磷脂的復(fù)雜體系的胞外分泌型的PLC。眾所周知，植物油毛油中的磷脂成分非常復(fù)雜，以 大豆油的毛油為例，其中的磷脂成分有磷脂酰膽堿（PC)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酸（PA)、溶血磷脂酰膽堿（LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE)、溶血磷脂酸（LPA)、磷 脂酰絲氨酸（PS)、甘油磷脂酰膽堿（PG)、雙磷脂酰甘油（DPG)以及鞘磷脂（SM)等（Glonek T.JA0CS. 1998, 75(5) : 569-573)。因此在PLC的酶法脫膠時，如果加入的PLC酶能夠同時對 多種磷脂成分有作用，必然能夠大大提高其脫膠效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于，提供一種分離的表達(dá)磷脂酶C的菌株。
[0007] 本發(fā)明提供的分離的表達(dá)磷脂酶C的菌株，命名為WBRD00050,保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 7508。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種生產(chǎn)磷脂酶C的方法。
[0009] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)磷脂酶C的方法包括：培養(yǎng)前述的菌株以使所述菌株或細(xì)胞生 產(chǎn)磷脂酶C，收獲磷脂酶C。
[0010] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述培養(yǎng)為在適宜所述菌株生長和/或適宜所述 菌株表達(dá)磷脂酶C的條件下培養(yǎng)所述菌株，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)為在適宜所述菌株生長的條 件下培養(yǎng)所述菌株，以增加所述菌株數(shù)量，然后再于適宜所述菌株表達(dá)磷脂酶C的條件下 培養(yǎng)所述菌株，以表達(dá)所述磷脂酶C。
[0011] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述培養(yǎng)為在15-35°C、100-300rpm，培養(yǎng) 48-144h。
[0012] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述收獲包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外 的磷脂酶C的培養(yǎng)物上清液，由此獲得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；優(yōu)選地，所述方法還 包括對所述磷脂酶C酶液進(jìn)行濃縮。
[0013] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種磷脂酶C。
[0014] 本發(fā)明提供的磷脂酶C為用前述方法制得。
[0015] 本發(fā)明提供的磷脂酶C能催化水解大豆混合磷脂中幾乎所有的磷脂成分。
[0016] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種磷脂酶C酶液。
[0017] 本發(fā)明提供的磷脂酶C酶液為用前述方法制得。
[0018] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種脫膠的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的脫膠的方法為使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液進(jìn)行脫膠，優(yōu)選 的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0020] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脫膠 的用途，優(yōu)選的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0021] 本發(fā)明還有一個目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂 改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫(yī)藥工業(yè)的用途。
[0022] 本發(fā)明的產(chǎn)磷脂酶C的真菌-枝孢霉（Cladosporiumsp. )，WBRD00050及使用 該菌株獲得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精煉，該菌株能夠生產(chǎn)出能夠水解去除大豆混 合磷脂中幾乎所有的磷脂成分的磷脂酶C，該磷脂酶C作用范圍廣，脫膠效果良好。由于枝 孢霉（Cladosporiumsp. )WBRD00050是傳統(tǒng)食品中分離的微生物，因而較絕大部分可產(chǎn)胞 外磷脂酶C的微生物更具安全性，因此，可以直接用于食品工業(yè)，安全可靠，例如可以安全 方便的用于油脂精煉。同樣枝孢霉來源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加劑、 飼料改良劑和醫(yī)藥工業(yè)等方面。
【附圖說明】
[0023] 圖1是磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意圖。
[0024] 圖2是枝孢霉磷脂酶C處理磷脂酰膽堿后的TLC檢測結(jié)果圖，其中，泳道1為1，2 二油酸甘油酯；泳道2為1，3二油酸甘油酯；泳道3為三油酸甘油酯；泳道4為磷脂酰膽堿 (PC)，泳道5為枝孢霉PLC水解磷脂酰膽堿的樣品。
[0025] 圖3是大豆混合磷脂的31P-NMR分析圖。
[0026] 圖4是枝孢霉磷脂酶C催化水解大豆混合磷脂的31P-NMR分析圖。
[0027] 圖5是枝孢霉磷脂酶C的最適作用溫度曲線示意圖。
[0028] 圖6是枝孢霉磷脂酶C最適作用pH值曲線示意圖。
[0029] 圖7是枝孢霉磷脂酶C的溫度穩(wěn)定性曲線示意圖。
[0030] 圖8是枝孢霉磷脂酶C的pH穩(wěn)定性曲線示意圖。
[0031] 圖9顯示不同金屬離子、EDTA等對枝孢霉磷脂酶C活性的影響結(jié)果。
[0032] 本發(fā)明的菌株WBRD00050已于2013年4月22日保藏在"中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（CGMCC)"（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研 究所，郵編100101)，保藏號是CGMCCNo. 7508,分類命名為：枝孢霉（Cladosporiumsp.)。
【具體實施方式】
[0033] 以下結(jié)合具體實