一種磷脂酶c的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶脫膠領(lǐng)域，具體的，涉及一種磯脂酶C。
【背景技術(shù)】
[0002] 催化水解磯脂的酶都可W稱為磯脂酶，它們廣泛分布與自然界中，發(fā)揮了多種多 樣的功能，從蛇毒的毒性（Janssen et al. 1999)到信號(hào)傳導(dǎo)（Singer et al. 1997)到人 類消化，都是磯脂酶參與的生物學(xué)特性和過程值e Maria et al. 2007)。雖然磯脂酶的底 物都是磯脂，但是它們可W作用于磯脂分子上的不同位點(diǎn)，根據(jù)水解位點(diǎn)不同，磯脂酶被 分為五種；phospholipase Al(PLAl),地OS地olipase A2(PLA2),地OS地olipase B(PLB), phospholipase C任LC)和地os地olipase D(PLD)。比如，PLAl和PLA2可分別水解甘油 基sn-1，sn-2位置上的脂肪酸醜基醋鍵。PLA1和化A2可W相應(yīng)的催化產(chǎn)生游離脂肪酸和 2-ac}dlyso地OS地olipid或者l-ac}d lysophospholipid。溶血磯脂上的脂肪酸再繼續(xù)被 phospholipase B(PLB)水解而游離出來。PLC被定義為一種磯酸二醋酶，可W水解甘油磯酸 鍵，產(chǎn)生甘二醋。PLD可作用于磯脂產(chǎn)生磯脂酸（Ramra化iani and化and2011)。磯脂酶是一 類很重要的可水解磯脂的酶，因?yàn)樗馕恢貌煌舍尫懦龆喾N不同的底物，比如溶血磯脂 (lysophospholipids),游離脂肪酸（free fatty acids, FFAs),甘二醋（dia巧Iglycerols, DGs)，磯酸膽堿（choline地os地ate)和磯脂酸鹽（phosphatidates)?，F(xiàn)今，磯脂酶已經(jīng)被 應(yīng)用于面包制造，蛋黃工業(yè)和植物油脫膠（Clausen2001)。
[0003] 磯脂廣泛存在于所有的生物體內(nèi)，它們和糖脂、膽固醇一起，是生物膜結(jié)構(gòu)的 重要組成部分值e Maria et al.2007)。磯脂主要在H個(gè)方面發(fā)揮了重要的作用；保 持了生物膜結(jié)構(gòu)的完整性（White et al.2001)，參與了許多代謝有關(guān)和神經(jīng)系統(tǒng)的 疾?。↙eel998)，W及作為信號(hào)物質(zhì)調(diào)控了許多生物過程（Hannun et al.2001)。磯 脂分子通常由非極性的二醜基部分和極性的含磯部分組成，醜基部分的特性和含磯部 分的構(gòu)成決定了該個(gè)磯脂的分類，特點(diǎn)W及生物學(xué)功能。植物油中的磯脂主要包括 phosphatidylcholine (lecithin, PC,磯月旨酉先膽堿），phosphatidylethanolamine 牌， 磯脂醜己醇胺），地OS地atid}dinositol (PI,磯脂醜肌醇），地OS地atidic acid(PA, 磯脂酸），地os地atid}dse;rine(PS，磯脂醜絲氨酸），地os地atid}dglyce;rol(PG， 磯脂醜甘油），di地os地atid}dglyce;rol值PG,二磯脂醜甘油）及N-ac}d phosphatidylethanolamine (NAPE,己醜基磯脂醜己醇胺）等。植物油中的磯脂包括水化磯 脂和非水化磯脂。水化磯脂和非水化磯脂的不同主要在于和磯脂酸的羥基相連的官能團(tuán)不 同。水化磯脂包括PC、PE、PI，都含有極性較強(qiáng)的基團(tuán)，例如膽堿、己醇胺、肌醇等，因此具有 比較強(qiáng)的親水性。非水化磯脂包括具有非脂類性質(zhì)的含磯物質(zhì)，W酸的形式存在的磯脂酸 和聚磯脂酸，還包括溶血磯脂（Padley et al. 1994)。
[0004] 植物油，比如豆油，菜巧油，葵花巧油和玉米油，是一種重要的營養(yǎng)來源。從油料種 子中提取的毛油需要進(jìn)一步提純，W去除會(huì)影響油品穩(wěn)定性，顏色和風(fēng)味的雜質(zhì)。磯脂是一 類主要的雜質(zhì)，在傳統(tǒng)精煉工藝中，需要W很高的成本進(jìn)行脫膠來去除。油中的磯脂會(huì)導(dǎo)致 油品在后續(xù)脫色、氨化和脫莫的過程中顏色變深。此外，磯脂會(huì)降低精煉油的氧化穩(wěn)定性并 抑制脫氨催化劑的表現(xiàn)。磯脂的總量和種類與油料種子的生長，儲(chǔ)藏，處理?xiàng)l件和萃取方式 有關(guān)，一般來說，不超過毛油重量的3%。在傳統(tǒng)精煉過程中，通過加水來脫除磯脂。磯脂由 DAG和一個(gè)極性磯酸醋組成，加水可引起磯酸醋的水化，將磯脂吸附于油水界面。水化的磯 脂可吸附中性油，因此形成了含有磯脂和中性油的乳狀液或者膠。該種粘性的膠可通過離 也從油中分離，該個(gè)過程稱為水化脫膠。但是該一步精煉的步驟會(huì)導(dǎo)致與雜質(zhì)正比例相關(guān) 的TAG和DAG得率損失。磯脂的強(qiáng)乳化性質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致吸附油品，從而造成得率損失。另一部 分的得率損失來自于，離也后油膠界面上，油的不完全回收。殘留在油中的磯脂，還會(huì)在接 下來的精煉步驟中導(dǎo)致進(jìn)一步的得率損失。比如脫酸時(shí)，又產(chǎn)生乳狀液。因此，傳統(tǒng)的油脂 精煉中，主要的得率損失都是源于磯脂產(chǎn)生的乳狀液，而該種損失是和磯脂的存在總量成 正比的。
[0005] 酶法脫膠，已經(jīng)發(fā)展到工業(yè)化規(guī)模，對(duì)傳統(tǒng)的水法脫膠是一種補(bǔ)充和替代。與化學(xué) 催化不同的是，酶是高度專一并且只作用于目標(biāo)分子，而那些與目標(biāo)分子相似的分子卻不 會(huì)受到影響。許多商業(yè)化的用于酶法脫膠的酶，已經(jīng)在市場(chǎng)上推出，大部分都是屬于PLA。 PLA將磯脂雜質(zhì)上的脂肪酸脫除，形成在少水環(huán)境中乳化效果差的溶血磯脂，來起到脫膠的 目的，但是該個(gè)過程中，產(chǎn)生的游離脂肪酸會(huì)殘留在油中，需要在后期通過皂化來脫除，而 該一步又會(huì)產(chǎn)生乳化劑帶來油損。
[000引而PLC只與油中的磯脂雜質(zhì)反應(yīng)，而并不攻擊油體本身。PLC可將磯脂水解為水溶 性的磯酸基，W及油溶性的甘二醋，因此減少了磯脂雜質(zhì)的乳化能力，也就降低了后續(xù)的油 損。與PLA不同的是，PLC不會(huì)產(chǎn)生額外的游離脂肪酸。值得指出的是，用PC-PLC脫膠，又 可W產(chǎn)生DAG，該對(duì)得率又是一個(gè)提高。而提高的DAG含量沒有超出油品中DAG天然含量的 范圍（10%)(Yas址awa and Katsuragi，2004)，并且不會(huì)影響油品質(zhì)量的指標(biāo)，例如煙點(diǎn)。
[0007] 現(xiàn)在已知的 PC-PLC,主要來源于 Bacillus sp.和 Pseudomonas sp.。
[0008] 根據(jù)對(duì)底物分子的特異性，PLC可分為phosphatidylinosito；L-specific phospholipase C(PI-PLC，EC numberS. 1.4. 11)和 phosphatidylcholine-specific phospholipase C(PC-PLC，EC numbers. 1.4. 3)。PI-PLC可特異性水解磯脂醜肌醇（PI),而 PC-PLC可水解磯脂醜膽堿（PC)和磯脂醜己醇胺（P巧。毛油中各個(gè)磯脂的含量并不是恒定 的，會(huì)因?yàn)槲锓N來源、壓棒或浸出工藝不同，而發(fā)生變化。W大豆油為例，PC含量為47%，PI 含量為24%，陽含量為20%，PA含量為9%。但現(xiàn)已成功商品化開發(fā)的化rifine值SM公司） 的工作抑范圍為6-7,是一種中性PC-PLC，可水解PE和PC，但不能水解PI，因此無法實(shí)現(xiàn) 磯脂的完全去除。此外，在深度酶法脫膠中，要共同添加PC-PLC和PLA1來實(shí)現(xiàn)對(duì)磯的完全 脫除，PLA1的工作抑為4-5,因此當(dāng)化rifine和PLA1混合使用時(shí)，無法找到一個(gè)合適的抑 范圍，使兩種酶同時(shí)W較高酶活工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種磯脂酶C，該磯脂酶C可水解磯脂醜膽堿和磯脂醜己醇胺，具有 于酸性抑區(qū)域或中性抑區(qū)域或堿性抑區(qū)域附近有效水解磯脂的能力，具有廣泛的抑區(qū) 域的耐受性（PH4-11)，并且具有一定程度的熱穩(wěn)定性可大量節(jié)省在生產(chǎn)中對(duì)抑和溫度調(diào) 節(jié)和調(diào)控花費(fèi)的成本，在與PLA1聯(lián)合使用是，該2種酶能同時(shí)W較高酶活工作。具有廣泛 pH區(qū)域的耐受性，對(duì)于酶的發(fā)酵生產(chǎn)W及工業(yè)化應(yīng)用都有很重要的意義。另外，該磯脂酶C 對(duì)鋒離子敏感，不依賴鋒發(fā)揮水解能力。本發(fā)明還提供了該磯脂酶C的融合蛋白，該融合蛋 白不僅能同時(shí)水解磯脂底物中的主要磯脂；磯脂醜己醇胺（P巧，磯脂醜肌醇（PI)和磯脂醜 膽堿（PC)，具有更廣泛的水解底物特性，且其酶活比親本酶混合液酶活高出20%。
[0010] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種磯脂酶C。
[0011] 本發(fā)明提供的所述磯脂酶C選自；（1)氨基酸序列如SEQ ID N0:1或7所示的多 膚，或（2)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或7所示的多膚的保守性變體。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的保守性變體是：將SEQ ID NO: 1或7氨基酸 序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)（如1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，最佳地1-3個(gè)）氨基酸 殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQ ID NO: 1或7所示的氨基酸序列相同功能 的多膚變體。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述磯脂酶C由SEQ ID N0:2或6所示多核巧酸 編碼。
[0014] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種分離的多核巧酸，所述多核巧酸編碼所述的 磯脂酶C。較佳地，所述多核巧酸的核巧酸序列如SEQ ID N0:2或6所示。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種包含前述多核巧酸的重組表達(dá)載體。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種包含前述多核巧酸或重組表達(dá)載體的重組菌株。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)磯脂酶C的方法。
[0018] 本發(fā)明提供的方法包括；培養(yǎng)本發(fā)明提供的重組菌株W表達(dá)所述磯脂酶C，收獲 磯脂酶C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述收獲包括破碎細(xì)胞來收集含有表達(dá)在胞內(nèi)的 磯脂酶C上清液，由此獲得含有磯脂酶C的磯脂酶C酶液。優(yōu)選地，所述方法還包括對(duì)所述 磯脂酶C酶液進(jìn)行濃縮或純化。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)磯脂酶C酶液的方法。本發(fā)明提供的方法包括；培養(yǎng)本 發(fā)明提供的重組菌株W表達(dá)所述磯脂酶C，分離和收集含有表達(dá)在胞內(nèi)的磯脂酶C的上清 液，由此獲得含有磯脂酶C的磯脂酶C酶液。