專利名稱：一種牡丹皮提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體地涉及一種中藥提取物及其制備方法和用途，特別是涉及一種牡丹皮提取物及其制備方法，該提取物可用于抗病毒。
背景技術(shù)：
牡丹皮又名丹皮、粉丹皮，為毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收錄于《中國(guó)藥典》，性微寒，味苦、辛，歸心、肝、 腎。具有清熱解毒，活血化瘀之功效。用于治療溫毒發(fā)斑，吐血衄血，夜熱早涼，無汗骨蒸， 經(jīng)閉痛經(jīng)，癰腫瘡毒，跌打傷痛等。牡丹皮的主要化學(xué)成分包括丹皮酚及其苷類、芍藥苷及其苷類、三萜、留醇等。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該植物的藥理活性研究發(fā)現(xiàn)其在治療心腦血管疾病、抗菌、消炎、抗腫瘤、治療皮膚病等方面有很好的功效，具有增強(qiáng)免疫、降血糖、保肝、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，顯示該植物具有很大的藥用前景。GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)的分子量78KDa的分子伴侶， 全稱為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (78-kDa glucose-regulated protein)，又被稱為Bip (免疫球蛋白結(jié)合蛋白)。具有鈣離子結(jié)合能力及保護(hù)子功能，對(duì)于折疊、成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到細(xì)胞外有重要的作用，使蛋白質(zhì)具有正確的功能和結(jié)構(gòu)。已知在短暫高溫、缺氧、低溫、高糖、輻射等ER壓力下，未折疊或非正常折疊蛋白質(zhì)蓄積于ER內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)GRP78的表達(dá)。通過GRP78 過量表達(dá)實(shí)驗(yàn)或反義抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GRP78與針對(duì)ER壓力引起的細(xì)胞死亡的防御反應(yīng)有關(guān) (Lee AS. Trends Biochem Sci. 2001，26 :504-10)。據(jù)報(bào)道，數(shù)種病毒誘導(dǎo)UPR(未折疊蛋白反應(yīng)，unfolded protein response) 伴隨GRP78表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞死亡，包括乙肝病毒(Xu Z. J Virol. 1997，71 (10) 7387-92)、丙肝病毒(Tardif, K. D. et al. J. Virol. 76 :7453-7459)、皰疹病毒(Mao, H. Virus Research. 2001,76(2) :127-135),登革熱病毒(S Wati et al. Journal of Virology. 2009,83 :1沘71-12880)、人巨細(xì)胞病毒(Nicholas J. Buchkovich. Journal of Virology. 2008,82 :31-39)、日本腦炎病毒(Su H. L. et al. J. Virol. 76 :4162-4171)及很大程度依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊及裝配的病毒(S Wati et al. Journal of Virology. 2009,83 12871-12880)。研究顯示，GRP78利用其分子伴侶功能折疊裝配病毒蛋白。GRP78與病毒的核心蛋白有結(jié)合反應(yīng)，提示GRP78參與了蛋白質(zhì)包被核酸的過程(He B. Cell Death Differ 2006， 13(3) :393-403)。GRP78裂解劑SubAB可以使GRP78幾乎消失，不影響病毒蛋白的合成，但可以阻斷病毒顆粒的形成，提示控制GRP78的表達(dá)可達(dá)到影響病毒顆粒裝配及向外釋放的目的 (Nicholas J. Buchkovich. Journal of Virology. 2008,82 :31-39) 用GRP78抗體處理也可以降低病毒進(jìn)入細(xì)胞的蛋白G結(jié)合，并減少感染(Honda et al. J. Virol. 2009,83 :12622-12625)。
有研究表明，苧麻提取物降低了乙肝病毒引起的GRP78上調(diào)，結(jié)果病毒蛋白質(zhì)合成未受影響，但病毒顆粒分泌下降(Huang KL. J Viral H印at. 2009，16 :367-375.)。這些都提示了一個(gè)新的抗病毒途徑抑制GRP78的表達(dá)以提供一個(gè)影響病毒裝配的目標(biāo)，該途徑可能不易發(fā)展耐藥性。目前，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于牡丹皮提取物作用于GRP78而影響病毒分泌方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人在利用中國(guó)專利ZL01121114. 8的草藥芯片篩選可與GRP78結(jié)合的草藥活性成分時(shí)，驚訝地發(fā)現(xiàn)在牡丹皮提取物中存在有一系列活性成分能專一地與GRP78結(jié)合并抑制GRP78的活性。進(jìn)一步經(jīng)由體外實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)牡丹皮提取物對(duì)乙肝病毒的分泌有明顯的抑制作用并且顯示極低的細(xì)胞毒性。為此，本發(fā)明提供一種牡丹皮提取物及其制備方法，以及該牡丹皮提取物用于制備抗病毒藥物的用途。本發(fā)明的第一方面涉及本牡丹皮提取物用于制備作為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78抑制劑的藥物中的用途。進(jìn)一步地，利用該牡丹皮提取物可以以GRP78作為調(diào)控目標(biāo)，用來抗病毒。因此本發(fā)明還涉及牡丹皮提取物用于制備抗病毒藥物中的用途。所述的病毒包括 乙肝病毒、皰疹病毒、丙肝病毒、登革熱病毒、人巨細(xì)胞病毒、日本腦炎病毒以及其他所有依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊及裝配的病毒。本發(fā)明的第二方面涉及上述牡丹皮提取物的制備方法，包括以下步驟1)毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，用有機(jī)醇的水溶液提取合適的次數(shù)；2)合并步驟1)中獲得的提取液，將其濃縮至合適的體積；3)將步驟2、獲得的濃縮液干燥，得到所述的牡丹皮提取物。上述牡丹皮提取物的制備方法中，所述的毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮與提取溶劑的重量比為1 1 10，優(yōu)選的重量比為 1 6 10，進(jìn)一步優(yōu)選的重量比為1 8 10，特別優(yōu)選的重量比為1 10;所述的有機(jī)醇為C1-3有機(jī)醇，優(yōu)選為C1-3 —元醇、C1-3 二元醇，進(jìn)一步優(yōu)選為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙二醇，更優(yōu)選的是乙醇、丙醇、異丙醇，特別優(yōu)選乙醇；所述的提取次數(shù)為1 10次，優(yōu)選提取2 6次，特別優(yōu)選提取3次；所述的有機(jī)醇水溶液中有機(jī)醇的重量百分含量為30% -70%，優(yōu)選的重量百分比含量為40% -60%，更優(yōu)選的重量百分比含量為50% ；特別優(yōu)選的有機(jī)醇水溶液為含乙醇 50%重量百分比的水溶液；所述的濃縮體積為提取液體積的1/20 1/40，優(yōu)選濃縮至提取液體積的1/25 1/35，進(jìn)一步優(yōu)選濃縮至提取液體積的1/30 ；所述的濃縮方式為蒸發(fā)濃縮、減壓濃縮、膜濃縮，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮；所述的干燥方式為減壓干燥、真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選的干燥方式為真空冷凍干燥。本發(fā)明的第三方面涉及一種牡丹皮提取物，其特征在于，該提取物由前面所述的制備方法獲得。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例分別應(yīng)用30^30^^50^^60^^70%的乙醇水溶液制備牡丹皮提取物，獲得的牡丹皮提取物的HPLC譜圖如圖3所示。本發(fā)明的第四方面涉及一種藥物組合物，該組合物含有所述的牡丹皮提取物，和藥學(xué)可接受的輔料。所述的牡丹皮提取物可與適當(dāng)?shù)姆勰┗谆旌弦陨筛稍锓勰?，其中該粉末基底選自乳糖、淀粉、淀粉衍生物(諸如多葡萄糖)、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，或牡丹皮提取物可與適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥上可接受的液體載體混合，該液體載體例如鹽水和葡萄糖溶液。醫(yī)藥上可接受的輔料，諸如粘合劑、甜味劑、增稠劑、芳香劑、崩解劑、涂覆劑、保存劑、潤(rùn)滑劑及/或時(shí)間延遲劑等，可加入至藥物組合物中。適宜地，適當(dāng)?shù)奶鹞秳┌ㄕ崽恰?果糖、葡萄糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame)及糖精；適當(dāng)?shù)谋澜鈩┌ㄓ衩椎矸邸?甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、皂土、藻朊酸及瓊脂；適當(dāng)?shù)姆枷銊┌ū『捎?、白珠?Wintergreen)油、櫻桃香料、柑橘香料及覆盆子果香料；適當(dāng)?shù)耐扛矂┌ū┧峒?/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物及/或彼等的酯、蠟、脂肪醇、玉米朊、蟲膠及谷蛋白粘膠 (glutan)；適當(dāng)?shù)谋４鎰┌ū郊姿徕c、維生素Ε、α -生育酚、抗壞血酸、硬脂酸、油酸鈉、 氯化鈉及滑石；且，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間延遲劑包括單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。所述的藥物組合物可以制成粉末、小袋(sachet)、顆粒、膠囊、藥片、糖漿、溶液、懸浮液、乳化液、軟膏、乳霜、洗劑或貼片等劑型。對(duì)口服給藥，該藥物組合物可調(diào)制成藥片、顆粒、粉末、小袋(sachet)、膠囊、糖漿、溶液、懸浮液或乳化液。對(duì)靜脈內(nèi)和非經(jīng)腸給藥，該藥物組合物可調(diào)制為醫(yī)學(xué)上可接受的糖漿、溶液、懸浮液或乳化液。對(duì)經(jīng)皮膚給藥，該藥物組合物可調(diào)制為軟膏、乳霜、洗劑或貼片。所述的藥物組合物可用于制備抗病毒藥物。其中所述的病毒包括乙肝病毒、皰疹病毒、丙肝病毒、登革熱病毒、人巨細(xì)胞病毒、日本腦炎病毒以及其他所有依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊及裝配的病毒。本發(fā)明的第五方面涉及一種通過抑制GRP78抗病毒的方法，其包括對(duì)需要抗病毒的個(gè)體施用所述的牡丹皮提取物，所述病毒包括乙肝病毒、皰疹病毒、丙肝病毒、登革熱病毒、人巨細(xì)胞病毒、日本腦炎病毒以及其他所有依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行蛋白正確折疊及裝配的病毒。給藥方式可以包括口服、靜脈內(nèi)、非經(jīng)腸或經(jīng)皮膚給藥。推薦的給藥劑量為Img 100mg/kg，優(yōu)選20mg 80mg/kg，進(jìn)一步優(yōu)選的給藥劑量為40mg 60mg/kg。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的制備方法制備的牡丹皮提取物能夠?qū)Ｒ坏嘏cGRP78結(jié)合，并抑制GRP78 的活性，對(duì)乙肝病毒的分泌有明顯的抑制作用并且顯示極低的細(xì)胞毒性。


圖1是實(shí)施例1制備本發(fā)明牡丹皮提取物的工藝流程圖示例；圖2是五種不同濃度乙醇水溶液提取牡丹皮得到產(chǎn)物的收率比較圖；圖3是本發(fā)明牡丹皮提取物的高效液相層析(HPLC)圖譜；圖4是各濃度牡丹皮提取物中能與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78結(jié)合的活性部分的篩選結(jié)果圖，由上至下分別為不同濃度乙醇的牡丹皮提取物的篩選結(jié)果，其中A，30%乙醇的牡
5丹皮提取物；B，40%乙醇的牡丹皮提取物；C，50%乙醇的牡丹皮提取物；D，60%乙醇的牡丹皮提取物；E，70%乙醇的牡丹皮提取物；圖5是本發(fā)明的牡丹皮提取物體外對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞毒性分析上所顯現(xiàn)的細(xì)胞
毒性；圖6是本發(fā)明的牡丹皮提取物體外對(duì)AML12細(xì)胞毒性分析上所顯現(xiàn)的細(xì)胞毒性；圖7是本發(fā)明的牡丹皮提取物體外對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌乙肝病毒顆粒所顯現(xiàn)的抑制活性，其中檢測(cè)目標(biāo)為HBsAg的相對(duì)表現(xiàn)量；圖8是本發(fā)明的牡丹皮提取物體外對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌乙肝病毒顆粒所顯現(xiàn)的抑制活性，其中檢測(cè)目標(biāo)為HBeAg的相對(duì)表現(xiàn)量。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1.應(yīng)用50 %乙醇-水溶液制備牡丹皮提取物實(shí)施例1的牡丹皮提取物的制備方法如圖1的流程圖所示。具體而言，將毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮IOkg于室溫下加入100kg50%乙醇-水溶液中，攪拌浸泡8小時(shí)，之后將提取液濾出，濾渣于室溫下加入80kg50%乙醇-水溶液中，攪拌浸泡8小時(shí)，將提取液濾出，濾渣于室溫下加入60kg50%乙醇-水溶液中，攪拌浸泡8小時(shí)，將三次提取液合并減壓濃縮至1/30體積，濃縮液減壓干燥或真空凍干即得牡丹皮提取物。實(shí)施例2.應(yīng)用不同濃度(30^30^^50^^60^^70%)的乙醇水溶液制備牡丹皮提取物參考圖1所示流程圖，制備牡丹皮提取物。具體地，將5份牡丹皮(各Ikg)于室溫下加入相應(yīng)濃度(30^^40%,50^^60%或70%)的乙醇水溶液(IOkg)中并經(jīng)攪拌浸泡 8小時(shí)。隨后經(jīng)過濾，分離出第一濾液和第一濾渣。將該第一濾渣于室溫下加入對(duì)應(yīng)濃度 (30%、40%、50%、60%或70% )的乙醇水溶液( )中并經(jīng)攪拌浸泡8小時(shí)。隨后經(jīng)過濾，分離出第二濾液和第二濾渣。將該第二濾渣于室溫下加入對(duì)應(yīng)濃度(30%、40%、50%、 60%或70%)的乙醇水溶液￠1 )中并經(jīng)攪拌浸泡8小時(shí)。隨后經(jīng)過濾，分離出第三濾液和第三濾渣。分別合并各濃度乙醇浸提的第一濾液、第二濾液及第三濾液并把濾液經(jīng)減壓濃縮至1/30的體積。將所得的濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥以得到提取物。計(jì)算收率，每組分別重復(fù)做3次，求平均值作圖，不同濃度乙醇水溶液的收率如圖2所示，以40 %、50 %、60 %乙醇水溶液提取所得干燥產(chǎn)物收率較高。實(shí)施例3.利用草藥芯片篩選活性成分利用中國(guó)專利ZL01121114.8中記載的草藥中活性成分高通量篩選方法，篩選實(shí)施例2中獲得的牡丹皮提取物。具體描述如下(篩選結(jié)果示于圖4) ①利用HPLC對(duì)草藥萃取液進(jìn)行分級(jí) 實(shí)施例2中的應(yīng)用五個(gè)不同濃度的乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物，分別取用所得的冷凍干燥粉末適量并將其溶解于50%乙醇水溶液(Iml)中以得到相當(dāng)于Ig生藥/ml 的溶液。將得到的溶液以12000rpm(上海安亭TGL-16B)離心20分鐘，收集澄清上層液。將該澄清上層液以50 %乙醇-水溶液稀釋2倍后以0. 45 μ m的針筒式過濾器過濾。該濾液用 HPLC進(jìn)行分級(jí)(譜圖示于圖3)，方法如下高效液相色譜ShimadzuLc-IOAfeif tt =Kromasil ODS 250X4. 6mm 5-Micron柱溫30°C檢測(cè)波長(zhǎng)2Mnm流速0. 75ml/min洗脫時(shí)間96min最高壓力400bar進(jìn)樣量50μ 1流動(dòng)相水-乙醇梯度程序時(shí)間水相比例乙醇相比例01000
905050
960100以每分鐘收集一管的方式收集96個(gè)流分，將此96個(gè)流分加載于96孔U形底微量滴定板中，將此載有96個(gè)流分的微量滴定板以離心減壓干燥(Thermo Speed Vac)的方式干燥。②以微數(shù)組方式將樣品加載至經(jīng)涂覆的塑料載片上如述于ZL01121114.8的說明書中的方法，利用微數(shù)組器(臺(tái)灣率然Biodot A101) 將①中所述流分點(diǎn)配置于經(jīng)涂覆的塑料載片上。首先將該微量滴定板中的牡丹皮干燥成分以20 % DMS0/0. IM磷酸緩沖液每孔30 μ 1回溶，利用2針具(直徑0. 8mm)將樣品自該96 孔U形底微量滴定板加載至該經(jīng)涂覆的塑料載片上。同時(shí)將濃度為4，10，50，250ng/ml的生物素胼點(diǎn)及1 μ g/ml經(jīng)Cy5標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白配置于該載片上作對(duì)照組。待該塑料載片上的樣品點(diǎn)干燥后O 3小時(shí))，將該塑料載片浸于IM乙醇胺(pH8. 0) 1小時(shí)。③信號(hào)檢測(cè)利用生物素化的GRP78(B_GRP78)和經(jīng)Cy5標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白作為探針以進(jìn)行雜交反應(yīng)。利用2片蓋玻片Q2X22mm)分別蓋住每一個(gè)塑料載片的2個(gè)凹槽，隨后在第一個(gè)凹槽加入 20 μ ITBST (50mM Tris-HCl/0. 15MNaCl/0. 05% tween20,pH7. 3)作為空白對(duì)照，第二凹槽加入20μ 1以TBST為溶劑的10 μ g/ml的B-GRP78，在室溫避光反應(yīng)1小時(shí)。 反應(yīng)完畢，利用該TBST緩沖液清洗芯片4次，雙蒸水清洗芯片4次，于37°C干燥該塑料載片。之后利用2片蓋玻片(22X22mm)分別蓋住該塑料載片的2個(gè)凹槽，在兩個(gè)凹槽中分別加入20 μ 1以TBST為溶劑的2. 5 μ g/ml的經(jīng)Cy5標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白，在室溫避光反應(yīng) 1小時(shí)。反應(yīng)完畢，利用該TBST緩沖液清洗芯片4次，雙蒸水清洗芯片4次，于37°C干燥該塑料載片。干燥完畢后利用激光掃描儀(AXON 4100A)進(jìn)行掃描。顯影上紅色熒光點(diǎn)顯示該分級(jí)液與B-GRP78結(jié)合(掃描圖見圖4)。30%、40%、50%、60%、70%五種濃度的乙醇水溶液提取所得的牡丹皮提取物中均有部分分級(jí)液與GRP78有結(jié)合，以50%乙醇水溶液提取所得的牡丹皮提取物分級(jí)液與GRP78結(jié)合熒光強(qiáng)度最高。實(shí)施例4.對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)稱取實(shí)施例2中制備的50%乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物凍干粉0. lg，加50% 乙醇回溶至10ml，使終濃度為10mg/ml，以0. 22 μ m孔徑無菌濾膜將其過濾除菌，以DMEM 完全培養(yǎng)液稀釋200倍，使其濃度為50 μ g/ml，再以DMEM完全培養(yǎng)液分別稀釋出濃度為 12. 5μ g/ml、25y g/ml 的稀釋液。種植H印G2. 2. 15 細(xì)胞(來自 Dr. Ho，M. S.，Academia Sinica, Taiwan) 5 X IO3 個(gè)細(xì)胞ΛΟΟμ 1于96孔盤中(每孔100 μ 1)，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱 (370C>5% CO2, Forma Scientific)中培養(yǎng)M小時(shí)。確認(rèn)細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，吸出培養(yǎng)液，并在孔中依次加入上述配制好的濃度分別為12. 5 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的牡丹皮提取物稀釋液各100 μ 1，各濃度(12. 5 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml)均設(shè)3復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照組50%乙醇組(含有50%乙醇的DMEM完全培養(yǎng)液，正對(duì)照組)、純培養(yǎng)液組、ADV 組(ADV為adefovir，是一種已經(jīng)體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以有效對(duì)抗乙肝病毒的藥物，并獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市治療慢性乙肝患者)，H2O2組(負(fù)對(duì)照組)，連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)每孔加入100 μ 1以FBS free培養(yǎng)液稀釋10倍的MTT(5mg/ml)。72小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μ 1DMS0于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘。之后以酶聯(lián)免疫分析儀(ImageQuant，GE Healthcare)讀取各孔OD57tlnm值，記錄結(jié)果。以50%乙醇組為標(biāo)準(zhǔn)(50%乙醇組的細(xì)胞存活率為100%)，計(jì)算其他實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，計(jì)算公式為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率％=(實(shí)驗(yàn)孔OD57tlnm值/50%乙醇孔OD57tlnm值)X 100%，然后作圖。如圖5 所示，12. 5 μ g/ml,25 μ g/ml,50 μ g/ml的牡丹皮提取物對(duì)肝癌細(xì)胞未顯示細(xì)胞毒性。其中 12. 5 μ g/ml、25 μ g/ml濃度的牡丹皮提取物不但沒有傷害細(xì)胞，還對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)。實(shí)施例5.對(duì)正常肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)種植AML12 細(xì)胞(商購(gòu)，購(gòu)自 American Type Culture Collection,貨號(hào) CRL-2254) 5 X IO3個(gè)細(xì)胞/100 μ 1于96孔盤中(每孔100 μ 1)，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液中， 置于CO2培養(yǎng)箱(37°C、5% C02，F(xiàn)orma Scientific)中培養(yǎng)M小時(shí)。確認(rèn)細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，吸出培養(yǎng)液，并在孔中加入實(shí)施例4中制備的濃度為50 μ g/ml的牡丹皮提取物(50% 乙醇水溶液提取)稀釋液100 μ 1，設(shè)3復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照組50%乙醇組(含有50%乙醇的 DMEM完全培養(yǎng)液，正對(duì)照組)、純培養(yǎng)液組、ADV組(ADV為adefovir是一種已經(jīng)體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以有效對(duì)抗乙肝病毒的藥物并獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市治療慢性乙肝患者)，H2O2組 (負(fù)對(duì)照組)，連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)每孔加入100 μ IWFBS free培養(yǎng)液稀釋 10 倍的 MTT (商品名噻唑藍(lán)，3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyltetrazolium bromide，3-G，5- 二甲基噻唑_2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽)，稀釋后MTT的濃度為5mg/ ml。72小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μ 1DMS0(二甲基亞砜)于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘。之后以酶聯(lián)免疫分析儀(ImageQuant，GE Healthcare)讀取各孔OD57tlnm值， 記錄結(jié)果。以50%乙醇組為標(biāo)準(zhǔn)(50%乙醇組的細(xì)胞存活率為100% )，計(jì)算其他實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，計(jì)算公式為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率％=(實(shí)驗(yàn)孔OD57tlnm值/50%乙醇孔OD57tlnm 值)X100%，然后作圖。如圖6所示，50 μ g/ml的50%乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物對(duì)
8正常肝細(xì)胞未顯示細(xì)胞毒性。實(shí)施例6.對(duì)肝癌細(xì)胞乙肝病毒分泌的抑制實(shí)驗(yàn)完整具感染性的HBV病毒顆粒(virion)稱為鄧氏顆粒(Dane particles) (Dane, Cameron et al. 1970)，其外套膜由大型(large surface，LS)、中型(middle surface, MS)、及小型或稱主要(small or major surface, SS)表面抗原組成，內(nèi)則包覆由240個(gè)或 180 (core proteins、HBcAg) ^.f^^M^Wi (core particles or capsids) (Crowther, Kiselev et al. 1994 ；Ganem and Prince 2004)，其中包裹部分雙股 DNA 及聚合酶蛋白(polymerase)。因此能夠抑制完整的乙肝病毒分泌，就可以抑制乙肝病毒的的感染性。一般而言，病毒的DNA或者RNA復(fù)制后，需要與病毒蛋白質(zhì)裝配好成為完整的病毒顆粒然后釋放到細(xì)胞外才能感染其他的細(xì)胞，而GRP78參與了蛋白質(zhì)包被核酸的過程(He B. Cell Death Differ 2006,13(3) :393-403)，GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上對(duì)于折疊、成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到細(xì)胞外有重要的作用，使蛋白質(zhì)具有正確的功能和結(jié)構(gòu)的分子伴侶。也就是說只要依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行蛋白折疊及裝配的病毒都可以借由抑制GRP78的途徑來達(dá)到對(duì)其抑制作用。因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抑制病毒的新途徑，即，通過抑制GRP78來抑制病毒顆粒裝配和分泌，以達(dá)到抑制病毒的目的。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)施例6中的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠頊y(cè)試牡丹皮提取物抑制GRP78的活性，以及抗病毒的活性。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下所述。種植H印G2. 2. 15細(xì)胞5 X IO3個(gè)細(xì)胞/100μ 1于96孔盤中(每孔100 μ 1)，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37°C>5% CO2, Forma Scientific)中培養(yǎng)對(duì)小時(shí)。確認(rèn)細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，吸出培養(yǎng)液，并在孔中依次加入實(shí)施例4中制備的濃度為 50 μ g/ml的牡丹皮提取物(50%乙醇水溶液提取)100 μ 1，設(shè)3復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照組50%乙醇組(含有50%乙醇的DMEM完全培養(yǎng)液)、純培養(yǎng)液組、ADV組(ADV為adefovir是一種已經(jīng)體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以有效對(duì)抗乙肝病毒的藥物并獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市治療慢性乙肝患者)、不分泌乙肝表面抗原的肝癌細(xì)胞組0fepG2)，連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，分別吸出培養(yǎng)液置于1. 5ml離心管中，使用HBsAg (乙肝病毒顆粒表面抗原)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒SURASE B-96 (TMB) ,HBeAg (乙肝病毒顆粒e抗原)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒EASE BN-96 (TMB)檢測(cè)，以酶聯(lián)免疫分析儀(ImageQuant，GE Healthcare)分別讀取各孔 OD45tlnm 值(HBsAg)、OD665nm 值 (HBeAg)，記錄結(jié)果并以下面公式計(jì)算后，將各組的HBsAg相對(duì)表現(xiàn)量及HBeAg相對(duì)表現(xiàn)量分別作圖(見圖7、圖8)。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)空白對(duì)照組的表現(xiàn)量％ =(實(shí)驗(yàn)孔OD值/50%乙醇孔OD值)X 100%如圖7、8所示，50 μ g/ml的50 %乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物對(duì)乙肝病毒的分泌有明顯的抑制作用，分別使得HBsAg，HBeAg的表現(xiàn)量下降51. 95 %，47. M % (P < 0. 001)。上述實(shí)驗(yàn)表明50%乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞分泌乙肝病毒，具有抗病毒作用，并且對(duì)細(xì)胞的毒性極低。實(shí)施例7.牡丹皮提取物抗皰疹病毒(HSV-I)活性實(shí)驗(yàn)樣品配制稱取實(shí)施例2中制備的50%乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物凍干粉 20mg,以二甲亞砜配制成濃度為20mg/ml的溶液。然后用Vero細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBC0的DEME 培養(yǎng)基)分別稀釋為 200 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、12. 5 μ g/ml。細(xì)胞毒性測(cè)試=Vero細(xì)胞(由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院提供)在96孔培養(yǎng)板單層培養(yǎng)37°C,5% C02培養(yǎng)M小時(shí)，吸棄上清液，分別加入上述已配制的牡丹皮提取物200μ g/ml、 100μ g/ml、50y g/ml、25y g/ml、12. 5μ g/ml 藥液，每個(gè)濃度 4 孔，每孔 100 μ 1。經(jīng) 37°C， 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，顯示100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、 12. 5 μ g/ml牡丹皮藥液對(duì)Vero細(xì)胞毒性為0，200 μ g/ml牡丹皮藥液對(duì)Vero細(xì)胞毒性為 75%。細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)=Vero細(xì)胞(由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院提供)在96孔培養(yǎng)板單層培養(yǎng)，經(jīng)37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)M小時(shí)，吸棄上清液，細(xì)胞經(jīng)稀釋液(不含牛血清的MEM培養(yǎng)液)洗滌，每孔加入洗滌液100μ 1，吸棄洗滌液，再加入10TCID50病毒液(單純皰疹病毒 HSV標(biāo)準(zhǔn)毒株1型Sm44，由北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院傳代保存)，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中吸附2小時(shí)，吸去病毒液，加入上述已配制的牡丹皮提取物 200 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、12. 5 μ g/ml 藥液，每個(gè)濃度 4 孔，每孔100 μ 1。經(jīng)37°C，5% C02培養(yǎng)72小時(shí)，顯微鏡觀察CPE (病變)，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(阿昔洛韋)，同時(shí)觀察CPE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1 牡丹皮提取物抗皰疹病毒(HSV-I)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.牡丹皮提取物用于制備作為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78抑制劑的藥物的用途，或用于制備抗病毒藥物的用途。
2.權(quán)利要求1中所述的牡丹皮提取物的制備方法，包括以下步驟1)毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeoniasuffruticosa Andr.的干燥根皮，用有機(jī)醇的水溶液提取合適的次數(shù)；2)合并步驟1)中獲得的提取液，將其濃縮至合適的體積；3)將步驟幻獲得的濃縮液干燥，得到所述的牡丹皮提取物。
3.權(quán)利要求2中所述的制備方法，其中所述的毛茛科芍藥屬植物牡丹I^aeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮與提取溶劑的重量比為1 1 10，優(yōu)選的重量比為 1 6 10，進(jìn)一步優(yōu)選的重量比為1 8 10，特別優(yōu)選的重量比為1 10;所述的有機(jī)醇為C1-3有機(jī)醇，優(yōu)選為C1-3 —元醇、C1-3 二元醇，進(jìn)一步優(yōu)選為甲醇、 乙醇、丙醇、異丙醇、乙二醇，更優(yōu)選的是乙醇、丙醇、異丙醇，特別優(yōu)選乙醇；所述的提取次數(shù)為1 10次，優(yōu)選提取2 6次，特別優(yōu)選提取3次；所述的有機(jī)醇水溶液中有機(jī)醇的重量百分含量為30% -70%，優(yōu)選的重量百分比含量為40% -60%，更優(yōu)選的重量百分比含量為50% ；特別優(yōu)選的有機(jī)醇水溶液為含乙醇50% 重量百分比的水溶液；所述的濃縮體積為提取液體積的1/20 1/40，優(yōu)選濃縮至提取液體積的1/25 1/35，進(jìn)一步優(yōu)選濃縮至提取液體積的1/30 ；所述的濃縮方式為蒸發(fā)濃縮、減壓濃縮、膜濃縮，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮；所述的干燥方式為減壓干燥、真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選的干燥方式為真空冷凍干O
4.一種牡丹皮提取物，其特征在于，該提取物由權(quán)利要求2或3的制備方法獲得。
5.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求4所述的牡丹皮提取物，和藥學(xué)可接受的輔料，優(yōu)選地醫(yī)藥上可接受的輔料包括粘合劑、甜味劑、增稠劑、芳香劑、崩解劑、涂覆劑、保存劑、 潤(rùn)滑劑及/或時(shí)間延遲劑，優(yōu)選的甜味劑包括蔗糖、果糖、葡萄糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯 (aspartame)及糖精；優(yōu)選的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、 皂土、藻朊酸及瓊脂；優(yōu)選的芳香劑包括薄荷油、白珠樹(Wintergreen)油、櫻桃香料、柑橘香料及覆盆子果香料；優(yōu)選的涂覆劑包括丙烯酸及/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物及/ 或彼等的酯、蠟、脂肪醇、玉米朊、蟲膠及谷蛋白粘膠(glutan)；優(yōu)選的保存劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉及滑石；優(yōu)選的時(shí)間延遲劑包括單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，所述的藥物組合物的劑型粉末、小袋、顆粒、膠囊、藥片、 糖漿、溶液、懸浮液、乳化液、軟膏、乳霜、洗劑或貼片。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物用于制備抗病毒藥物的用途。
8.一種抗病毒的方法，其包括對(duì)需要抗病毒的個(gè)體施用權(quán)利要求4的牡丹皮提取物。
9.權(quán)利要求1、7的用途或權(quán)利要求8的方法，其中所述的病毒包括乙肝病毒、皰疹病毒、丙肝病毒、登革熱病毒、人巨細(xì)胞病毒、日本腦炎病毒以及其他所有依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊及裝配的病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牡丹皮提取物及其制備方法和用途。其制備方法為牡丹皮藥材用有機(jī)醇水溶液提取、濃縮、干燥，得到所述的牡丹皮提取物。該牡丹皮提取物能夠抑制葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78，用于抗病毒。體外實(shí)驗(yàn)證明牡丹皮提取物具有顯著的抗乙肝病毒分泌作用，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的毒性都較小，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K125/00GK102423346SQ201110440450
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者張大茲, 楊曉源, 黃敏, 黎耀基 申請(qǐng)人:云南白藥中草藥芯片有限公司