專利名稱：富含具有延伸的α鏈的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血纖蛋白原制備物及血纖蛋白原制備物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明涉及富含具有延 伸的α鏈的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物，及涉及產(chǎn)生這種制備物的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血纖蛋白原(f ibrinogen)是ー種可溶的血楽;糖蛋白，其在人體內(nèi)主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成。其是ニ聚體分子，由通過ニ硫鍵連接的兩對三個稱作Αα、Ββ和Y的多肽鏈組成。所述三條多肽鏈由三個單獨(dú)的基因編碼。主要存在形式(HMW fib)攜帶Aa鏈，其作為625個氨基酸的前體合成，作為610個氨基酸的多肽鏈存在于在血漿中發(fā)現(xiàn)的血纖蛋白原中，B β鏈含有461個氨基酸，Y鏈含有411個氨基酸。所述三條多肽鏈從3個mRNA中單獨(dú)地合成。三條成分鏈(Aa、Ββ和Y)裝配成作為六條鏈的ニ聚體(Aa、Ββ，Υ)2的最終形式，該裝配在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的腔隙中發(fā)生。血纖蛋白原在血液中以高濃度(l_2g/L)循環(huán)，并且表現(xiàn)為高度的異質(zhì)性。據(jù)估計(jì)在每個個體中有大約ー百萬個不同的血纖蛋白原分子循環(huán)。僅占總血纖蛋白原的一小部分(在大多數(shù)情況中不超過幾個百分?jǐn)?shù))的這些變體中的大多數(shù)在功能和結(jié)構(gòu)方面不同。Aa鏈的羧基末端部分的蛋白酶解產(chǎn)生三種主要循環(huán)形式的血纖蛋白原，其具有明顯不同的分子量。血纖蛋白原以高分子量形式合成(HMW，分子量340kDa;循環(huán)中的主要形式的Aa鏈含有610個氨基酸)。一條A a鏈的降解產(chǎn)生LMW形式(MW=305kDa) ;LMW’形式(270kDa)是變體，其中兩條Aa鏈在羧基末端被部分降解。在健康個體的血液中，50_70%的血纖蛋白原是HMW，20-50%是具有一或兩條降解的Aa鏈的血纖蛋白原(de Maat andVerschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12,377)。所述 HMW 和 LMW’ 變體不出不同的凝血時間和血纖蛋白多聚體結(jié)構(gòu)(Hasegawa N, Sasaki S. (1990)Thromb. Res. 57，183)。熟知的可變剪接變體是所謂的gamma prime(Y’)變體和a-ext Fib或Fib420變體。所述α-ext Fib或Fib420變體的分子量為420kDa，占總循環(huán)血纖蛋白原的1-3%(de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) 延伸的 a -ext Fib 同種型與常規(guī)的血纖蛋白原α -鏈不同，其由于可變剪接而存在額外的236個殘基的C末端球形結(jié)構(gòu)域。在文獻(xiàn)中給出了關(guān)于Fib420的功能和特性的矛盾數(shù)據(jù)?；趯ρ獫{衍生的a -ext Fib 的研究，Applegate et al, Blood (2000) 95:2297 推斷 α-ext Fib 的聚合和交聯(lián)性質(zhì)與血漿衍生的HMWFib無明顯不同。他們的結(jié)論是所述額外的C-結(jié)構(gòu)域?qū)τ谀獰o作用，并提示所述結(jié)構(gòu)域的功能也許支持整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。在EP I 495 051中，提示Fib420可能對降解較不敏感，及對血凝塊結(jié)構(gòu)可能有作用。然而，未進(jìn)行證實(shí)及未提示該作用在血凝塊結(jié)構(gòu)或強(qiáng)度中可能是增強(qiáng)或是降低。Mosesson et al. (Biophys.Chem. 112，209:2004)基于臍帶血漿衍生的a -extFib研究了血凝塊的超微結(jié)構(gòu)。他們報道了 α-ext Fib血凝塊的纖維比基于HMW血纖蛋白原的那些纖維更細(xì)及更多分支，但是其具有所有血纖蛋白纖維特有的相同周期性。所述作者提示α-ext Fib中延伸的α-鏈提供與細(xì)胞整聯(lián)蛋白相互作用的位點(diǎn)的功能。詳細(xì)描述本發(fā)明涉及血纖蛋白原制備物，其含有至少95%(w/w)的血纖蛋白原，并且其中至少10%的血纖蛋白原是Fib420形式。在本領(lǐng)域中，F(xiàn)ib420也稱作“ a -ext Fib”、“具有延伸的α -鏈的血纖蛋白原”或者“血纖蛋白原·”。在本發(fā)明中，這些術(shù)語可互換使用。所有這些術(shù)語均是指所述結(jié)構(gòu)(Ααεχ ,Ββ , Y)的對稱分子，其中如在HMW fib中發(fā)現(xiàn)的兩條常規(guī)血纖蛋白原α-鏈由延伸的α鏈置換。
在本發(fā)明中，術(shù)語“血纖蛋白原制備物”是指分離形式的血纖蛋白原，例如血纖蛋白原的血漿分離物或者細(xì)胞上清分離物。其也可以是指合成的血纖蛋白原制備物。本發(fā)明的血纖蛋白原制備物優(yōu)選含有基于總蛋白質(zhì)的至少65%w/w、至少70%>w/w、至少75%w/w、至少80%w/w或者至少85%的血纖蛋白原。更優(yōu)選地，其是純的制備物，其中基本上沒有污染物如其它蛋白質(zhì)存在，其含有基于總蛋白質(zhì)的至少90%w/w、至少95%w/w、至少96%w/w、至少97%w/w或者至少98%的血纖蛋白原。更優(yōu)選地，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物包含基于總蛋白質(zhì)的至少99%w/w或者至少99. 5%w/w的血纖蛋白原。這種純血纖蛋白原制備物特別適合配制用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的組合物，如用于傷ロ治療和手術(shù)修復(fù)的組合物。根據(jù)本發(fā)明，所述制備物中至少10%的血纖蛋白原是Fib420形式。優(yōu)選地，至少15%w/w、至少20%w/w、至少25%w/w或者至少30%w/w的血纖蛋白原是Fib420形式。更優(yōu)選地，至少40%w/w、至少50%w/w、至少60%w/w、至少70%w/w、至少80%w/w或者至少90%w/w是Fib420形式。最優(yōu)選地，至少95%w/w、至少99%w/w或者所有血纖蛋白原均是Fib420形式。本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的一個優(yōu)勢是血纖蛋白原制備物的纖溶酶介導(dǎo)的消化慢于血漿衍生的血纖蛋白原。其對于纖溶酶消化的增強(qiáng)的抗性可有益于治療患有血纖蛋白溶解亢進(jìn)的患者，通常見于獲得性凝血功能障礙情況中。使用本發(fā)明的血纖蛋白原制備物，血凝塊較快速地形成，并且形成的血凝塊與血漿衍生的血纖蛋白原或HMW血纖蛋白原形成的血凝塊相比具有更高的血凝塊堅(jiān)固性(firmness)。這意味著當(dāng)使用本發(fā)明的血纖蛋白原制備物時，血纖蛋白血凝塊穩(wěn)定性增強(qiáng)，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物與現(xiàn)有制備物相比更強(qiáng)效。更強(qiáng)效的血纖蛋白原制備物使得給予的液體量和治療性蛋白質(zhì)的量均降低。這對于靜脈內(nèi)使用以治療稀釋性凝血功能障礙是有利的。目前對于靜脈內(nèi)(i. V)注射血纖蛋白原以補(bǔ)償?shù)湍钚?，需要高劑量的血纖蛋白原(毎次治療、g血纖蛋白原)。這是通過直接注射70mg/kg劑量給予的。由于血纖蛋白原通常在20mg/ml最大濃度可以被溶解,這意味著需要靜脈內(nèi)給予成人大約250ml液體。通過提供更強(qiáng)效的血纖蛋白原以降低整個劑量是有益的。另ー優(yōu)勢是使用本發(fā)明的血纖蛋白原制備物與使用血漿衍生的血纖蛋白原或HMW血纖蛋白原的制備物相比導(dǎo)致的血凝塊形成對因子XIII的依賴性降低。在緩沖液中由α-延伸的Fib (不存在因子XIII)形成的血凝塊的強(qiáng)度高于含有ー些因子XIII的血漿衍生的血纖蛋白原形成的血凝塊的強(qiáng)度。不需要因子XIII以形成堅(jiān)實(shí)的血凝塊。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物沒有因子XIII。使用ROTEM分析可以測量a -ext rhFib和血衆(zhòng)衍生的血纖蛋白原的凝血時間(CT)、血凝塊形成時間(CFT)和血凝塊堅(jiān)固性。ROTEM (PentapharmGmbH, Munich, Germany)表不 Rotation ThromboElastoMetry。該技術(shù)利用在一次性試管中浸沒在(血液)樣品中的旋轉(zhuǎn)軸。在不同凝血條件下弾性(elasticity)的改變導(dǎo)致軸旋轉(zhuǎn)的改變，這在凝血 彈性描記圖中觀測到，反映出機(jī)械凝血參數(shù)(見例如LuddingtonR.J. (2005) Clin Lab Haematol. 200527 (2) : 81)。在相似條件下的ROTEM 系統(tǒng)檢測中，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的性能通常至少同樣好于或者優(yōu)于其中血纖蛋白原變體分布類似于在人血漿中的變體分布(即少于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型)的血纖蛋白原制備物或組合物。這是例如基于血漿衍生的血纖蛋白原的血纖蛋白原濃縮物的情況。這種濃縮物是可商購的。特別地，其血凝塊形成時間低于其中低于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間。優(yōu)選地，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間是其中低于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型的血纖蛋白原制備物如血漿衍生的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間的最多80%、最多60%、最多50%、最多40%、最多30%，、最多20%、最多10%。在實(shí)施例中呈現(xiàn)的使用α-ext rhFib的ROTEM試驗(yàn)表明本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間(CFT)低于純化的血漿衍生的血纖蛋白原在靜脈內(nèi)應(yīng)用產(chǎn)生的CFT。另ー方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的組合物。除了血纖蛋白原之外，所述組合物還可包含激活物，如凝血酶或凝血酶樣蛋白質(zhì)，如reptilase。其也可包含適用于注射用制備物中的賦形劑。所述制備物可以是干燥形式及隨后用例如緩沖鹽水等重建，或者其可以是液體形式，是懸浮液或者溶液。合適的賦形劑材料可包括溶劑和助溶齊U，如こ醇、甘油、PEG、油等；增溶劑、濕潤劑、懸浮劑、乳化劑或者增稠劑，如羧甲基纖維素、水解的明膠、普流羅尼克(pluronics)、聚山梨醇酯等；螯合劑,如EDTA I丐、DTPA等；抗氧化劑和還原劑，如BHT、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉等；抗微生物防腐劑，如苯甲醇、苯酚、苯甲酸酯類(parabens)等；緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑,如氨丁三醇(tromethamine)、磷酸鈉、こ酸鈉、氫氧化鈉等；膨脹劑(bulking agent)、防護(hù)劑和張カ調(diào)節(jié)劑,如丙氨酸、白蛋白、葡聚糖、乳糖、山梨糖醇、氯化鈉、組氨酸等；特殊的添加劑，如西甲娃油(simethicone)作為抗泡沫劑,海藻糖用于降低蛋白質(zhì)聚集。所述組合物可用于其中使用血漿衍生的或者重組的血纖蛋白原的任何應(yīng)用中。主要應(yīng)用是止血及密封組織。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述組合物是藥物組合物。所述藥物組合物包含本發(fā)明的血纖蛋白原制備物及藥物可接受的載體?！八幬锟山邮艿妮d體”是指利用其給予本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的運(yùn)載體、輔助劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑或者載體。藥物可接受的載體的實(shí)例包括但不限于水、緩沖鹽水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、液體聚こニ醇等)、ニ甲基亞砜(DMSO)、油、洗滌劑、懸浮劑或者其合適的混合物。合適的藥物可接受的載體和配制物在Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19thEd. (Mack Publishing Co. , Easton, 1995)及〃 Remington: The Science And Practice OfPharmacy^by Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2005)中描述。所述藥物組合物可局部使用，可包括水溶性、吸水性、水不溶性或者水溶脹性載體。合適的材料包括糖，如單糖和ニ糖，包括乳糖、甘露醇和海藻糖，或者葡聚糖及葡聚糖聚合物等，如Sephadex,其可以不同顆粒大小獲得,淀粉、pullulan衍生物、透明質(zhì)酸酯等。纖維素產(chǎn)品如微晶纖維素(Avicel range)、甲基纖維素、羧甲基纖維素、超細(xì)(microfine)纖維素或者羥基丙基纖維素及其它材料如交聯(lián)的聚こ烯吡咯烷酮(PVP)可以單獨(dú)或混合使用。合適的載體也包括聚こニ醇(PEG)，優(yōu)選分子量為大約1000 ;聚こ烯吡咯烷酮(PVP)，優(yōu)選平均分子量為大約50，000 ;聚(丙烯酸)，PVA，聚(甲基こ烯基醚-馬來酸酐共聚物)，聚(環(huán)氧こ烯)，及葡聚糖，典型平均分子量為大約40，000?？砂瑒┍澜鈩?。這些材料從傷口中吸收水分，迅速擴(kuò)展及因此增強(qiáng)粉末混合物的止血成分的可濕性。合適的實(shí)例包括羧甲淀粉鈉(Explomb' 或Primojel )，其平均顆粒大小范圍為35-55 μ m。大約25%的葡萄糖単元是羧甲基化的；交聯(lián)的聚こ烯吡咯烷酮(Polyplasdone );藻酸鹽和褐藻酸；交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol)?？梢允褂玫臉淠z和凝膠劑包括例如黃苗膠、刺梧桐膠(karaya gum)、可溶淀粉、明膠、果膠、瓜爾豆膠和gelIan gum。特別優(yōu)選的添加劑是Emdex ，即水合形式的dextrates (含有少量淀粉寡糖的噴霧結(jié)晶的葡萄糖)。其是高度精制的產(chǎn)物，由白色自由流動的噴霧結(jié)晶的大孔球體組成，中位粒徑為190-220 μ m。最優(yōu)選的添加劑是NON-PAREILSEEDS : (Sugar Spheres)。這些用于多個藥物単位中，用以獲得改良的含量均勻度、一致和受控制的藥物釋放及高度藥物穩(wěn)定性，大小范圍是 200-2000mm。藥物可接受的載體可包含泡騰組合(effervescent couple)。在泡騰反應(yīng)后產(chǎn)生的氣體可以使血纖蛋白密封劑(fibrin sealant)擴(kuò)展為“泡沫”和/或増加包含所述血纖蛋白密封劑的粉末的可濕性。隨著所述粉末應(yīng)用于傷ロ，泡騰成分溶解、反應(yīng)及釋放，即釋出ニ氧化碳，從而増加止血成分的可濕性，及因此增強(qiáng)血凝塊形成的時間。血纖蛋白密封劑一旦充分反應(yīng)且血凝塊形成，其呈現(xiàn)出穩(wěn)定泡沫形式。所述泡騰組合典型地包含檸檬酸或者檸檬酸氫鈉和碳酸氫鈉，但是也可以使用其它生理學(xué)可接受的酸/堿金屬或者堿土金屬碳酸鹽混合物，例如酒石酸、脂肪酸、反丁烯ニ酸或蘋果酸，以及碳酸(氫)鈉、鉀或鈣或者甘氨酸鈉碳酸鹽。通常地，發(fā)現(xiàn)當(dāng)泡騰組合的成分在化學(xué)分子當(dāng)量基礎(chǔ)上的相對比率在4:3至1:3范圍、更優(yōu)選大約2:3時呈現(xiàn)出優(yōu)選的口味特性，這個比率以酸性成分與堿性成分的分子當(dāng)量比率表示。就檸檬酸與碳酸氫鈉的優(yōu)選組合而言，這些值基于重量表示酸與堿成分的比率為1:1至0.3:1的范圍，優(yōu)選0.5: I。本發(fā)明的藥物組合物適于促進(jìn)組織粘附、改良傷ロ愈合或者適于靜脈內(nèi)給予。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是血纖蛋白密封劑。本發(fā)明的血纖蛋白密封劑典型地包含凝血酶。所述密封劑可以是任何形式，干燥或液體形式。其中可使用本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的干燥的密封劑的合適實(shí)例是Fibrocaps 粉末密封劑，其在W097/44015中被描述，且基于血纖蛋白原和凝血酶的微粒。所述單獨(dú)的成分通過噴霧干燥血纖蛋白原與海藻糖及凝血酶與海藻糖而制備。每種粉末成分均具有主要顆粒大小為大約直至50μπι直徑。所述Fibrocaps 血纖蛋白密封劑是這些成分的混合物，已經(jīng)證實(shí)其是易于使用的穩(wěn)定及有效的局部止血剤。所述產(chǎn)物可立即使用，不用重建，并可用于傷ロ治療、手術(shù)修復(fù)及作為血管外支架(extravascular stent)。在與含水液體如血液接觸時,暴露的凝血酶使暴露的血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿难w蛋白聚合物。本發(fā)明的血纖蛋白原制備物提 供進(jìn)ー步改良的凝血性質(zhì)。
本發(fā)明的組合物可用于傷ロ、傷ロ縫合、切ロ及可發(fā)生出血的其它開放性損傷。傷ロ包括對活生物體中的任何組織的損害。所述組織可以是內(nèi)部組織(如器官)或外部組織(如眼或皮膚)，及可以是硬組織(如骨)或者軟組織(如肝或脾)。傷ロ可以是由任何原因?qū)е?，包括感染、手術(shù)干預(yù)、燒傷或創(chuàng)傷。本發(fā)明的組合物可用于手術(shù)干預(yù)如在胃腸道系統(tǒng)中，如食管、胃、小腸、大腸、直腸，實(shí)質(zhì)性器官如肝、胰腺、脾、肺、腎、腎上腺、淋巴和甲狀腺；在耳、鼻和喉部區(qū)域(ENT)的手術(shù)介入，包括口腔外科手術(shù)，心血管外科手術(shù)，美容外科手術(shù)、神經(jīng)外科手術(shù)，淋巴、膽汁和腦脊液(CSF)瘺，胸腔和肺手術(shù)期間的漏氣，胸腔手術(shù)包括氣管、支氣管和肺手術(shù)，婦科、血管科、泌尿科、骨科(如松質(zhì)切除木)和急救外科手木。作為血管外支架或支持物，本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于一個節(jié)段的外面或者靜脈移植的全部。合適的血管外支架組合物是本發(fā)明的血纖蛋白原制備物與凝血酶的組合物。所 述組合物可以是任何合適形式，液體或干燥形式。在一個實(shí)施方案中，例如如上所述的ー種干燥粉末組合物用作血管外支架。所述干燥粉末組合物在天然存在于血管壁外部的有限量的體液中聚合，從而形成血管外支架。用本發(fā)明的血管外支架組合物包被的靜脈也是本發(fā)明的一部分。所述靜脈可以是需要被保護(hù)以免于過度伸展或者需要支持的任何靜脈，如靜脈曲張。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靜脈是靜脈移植物。在一個實(shí)施方案中，所述組合物在將靜脈移植物導(dǎo)入人或動物身體中之前應(yīng)用。在另ー實(shí)施方案中，所述組合物在靜脈移植物已經(jīng)導(dǎo)入人或動物身體中之后應(yīng)用。另ー方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的血纖蛋白原制備物作為藥物。其可用于制備用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進(jìn)、血纖蛋白原缺乏癥(獲得性或先天性)或者其它出血性疾病的藥物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于在大出血部位減少出血的方法中。優(yōu)選地，使用止血有效量的本發(fā)明的組合物。當(dāng)用作局部止血劑時，可以實(shí)現(xiàn)止血時間(TTH)為大約10分鐘或更少，大約5分鐘或更少，或者大約3分鐘或更少。在本發(fā)明中，TTH是至出血停止的時間。如果使用加壓片(pressure sheet),則TTH的測量典型地從當(dāng)將所述加壓片應(yīng)用于出血部位時開始直至敷料可視化使出血停止和/或觀測到敷料內(nèi)外無出血為止。另ー方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的血纖蛋白原制備物的方法。這種制備物可以使用本領(lǐng)域可利用的技術(shù)通過任何合適的方式制備。為了以經(jīng)濟(jì)可行的方式產(chǎn)生a-extFib，需要高表達(dá)水平的完整的功能性血纖蛋白原，及因此優(yōu)選重組產(chǎn)生方式。在本發(fā)明中，當(dāng)氨基酸序列含有由核苷酸序列編碼的所有氨基酸時，任選地不含在正常細(xì)胞(分泌)加エ期間除去的氨基酸，此時血纖蛋白原或血纖蛋白原鏈?zhǔn)恰巴暾问健?。因此，具?66或847個氨基酸的a -ext鏈?zhǔn)峭暾问絘 -鏈的實(shí)例。血纖蛋白原的重組產(chǎn)生具有優(yōu)于使用血漿衍生的材料的許多優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括其優(yōu)選的安全性、產(chǎn)生沒有任何其它血液污染物的變體的純的均質(zhì)制備物的可能性及無限制供應(yīng)。此外，對于特殊應(yīng)用(例如使用血纖蛋白原作為靜脈內(nèi)止血剤)，需要正確的翻譯后修飾(例如糖基化)。因此，優(yōu)選在真核生物、特別是在哺乳動物系統(tǒng)、更特別是在人系統(tǒng)中表達(dá)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的血纖蛋白原制備物通過包括如下步驟的方法制備
-提供包含核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈；-用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞；-在使得編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核酸序列表達(dá)的條件下維持所述轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞。真核宿主的表達(dá)載體為本領(lǐng)域已知，可以使用常規(guī)用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的任何載體。表達(dá)載體典型地包含與被表達(dá)的核酸序列可操縱地連接的啟動子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化信號，轉(zhuǎn)錄終止序列，上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及增強(qiáng)子。在一個實(shí)施方案中，使用在哺乳動物細(xì)胞如CHO或PER.C6 中表達(dá)的表達(dá)載體。這種載體為本領(lǐng)域已知，合適的實(shí)例包括 pcDNA3· I 質(zhì)粒，GATEWAY (Invitrogen), pCMV/Bsd (Invitrogen), pFN 載體(Promega)及多種其它載體系統(tǒng)。在本發(fā)明中，“血纖蛋白原的α -延伸的多肽鏈”可以是指具有信號序列的866個 氨基酸的血纖蛋白原α鏈，或者是指不具有信號序列的多肽鏈，以及是指其通過遺傳多態(tài)性或糖基化和磷酸化中的差異而產(chǎn)生的任何變體。合適的α延伸鏈氨基酸序列的實(shí)例在SEQ ID No. I中示出。術(shù)語“α鏈”和“ Aa鏈”在本發(fā)明文中可互換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所述真核細(xì)胞必須也含有編碼血纖蛋白原的β和Y鏈的核酸序列以能產(chǎn)生血纖蛋白原分子。從α、β和Υ鏈中重組產(chǎn)生血纖蛋白原先前已經(jīng)描述，見例如 PCT/EP2009/058754、US 6，037, 457 或 W095/023868 所述。在本發(fā)明中，術(shù)語“β鏈”和“Ββ鏈”可互換使用。其是指β鏈的野生型及變體，有或沒有信號序列。合適的血纖蛋白原β鏈氨基酸序列的實(shí)例在SEQ ID No. 2中示出。在本發(fā)明中，術(shù)語“gamma鏈”和“ Y鏈”可互換使用。其是指Y鏈的野生型及變體，有或沒有信號序列。合適的血纖蛋白原Y鏈氨基酸序列的實(shí)例在SEQ ID No. 3和4中示出。優(yōu)選地，編碼血纖蛋白原鏈的核酸序列被優(yōu)化。優(yōu)化的核酸序列可以有效表達(dá)完整形式的重組血纖蛋白原。優(yōu)選地，其被優(yōu)化以在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)，如在COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、CHO細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)。更優(yōu)選地，其被優(yōu)化以在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)。最優(yōu)選地，所述核酸序列被優(yōu)化以在人細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)，如在PER. C6細(xì)胞或HEK293細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)。優(yōu)化的核苷酸序列可以是DNA或RNA。優(yōu)選是cDNA。編碼血纖蛋白原的α延伸的、β或Υ鏈的優(yōu)化的核苷酸序列示出與其各自的非優(yōu)化的對應(yīng)序列具有至少70%相同性。在一個實(shí)施方案中，編碼血纖蛋白原的a-ext Fib、Ββ和Y鏈的優(yōu)化的核苷酸序列與其各自的非優(yōu)化的序列示出70-80%相同性。優(yōu)選地，編碼血纖蛋白原的α延伸的、β或Y鏈的優(yōu)化的核苷酸序列不含有順式作用位點(diǎn)，如剪接位點(diǎn)和poly(A)信號。用于本發(fā)明方法中及編碼血纖蛋白原α延伸的鏈的優(yōu)化的核苷酸序列不含有在編碼人血纖蛋白原α鏈的基因中正常存在的39個堿基對直接重復(fù)序列。所述重復(fù)序列必須被改變而不改變編碼的蛋白質(zhì)序列。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO. 5所示優(yōu)化的核苷酸序列或者這個序列的無信號序列的一部分(核苷酸60-2598)用于表達(dá)α延伸的鏈。
在另ー優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO. 6所示優(yōu)化的核苷酸序列或者這個序列的無信號序列的一部分(核苷酸93-1473)用于表達(dá)β鏈。在另ー優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO. 7或8所示優(yōu)化的核苷酸序列或者這個序列無信號序列的一部分(SEQ ID NO. 7的核苷酸51-1311及SEQID NO. 8的核苷酸51-1359)用于表達(dá)Y鏈。本發(fā)明的核酸序列可以編碼任何類型的血纖蛋白原鏈。優(yōu)選其編碼哺乳動物血纖蛋白原鏈，更優(yōu)選其編碼靈長類動物血纖蛋白原鏈，最優(yōu)選其編碼人血纖蛋白原鏈。組合也是可能的，如一或兩個哺乳動物 血纖蛋白原鏈組合兩或ー個嚙齒動物血纖蛋白原鏈。本發(fā)明方法的重組表達(dá)使得Fib420的表達(dá)水平與重組HMW Fib的表達(dá)水平相似。


圖I :Western印跡分析。泳道I是含有血衆(zhòng)衍生的野生型血纖蛋白原(FIB3,Enzyme Research Laboratories)的對照組。泳道2含有克隆W115的培養(yǎng)上清，該克隆是表達(dá)a -ext rhFib的PER. C6克隆。分子量標(biāo)記(MW)在左側(cè)標(biāo)示。圖2 ROTEM分析。凝血時間、血凝塊形成時間及血凝塊堅(jiān)固性通過ROTEM分析確定。左側(cè)圖示出在緩沖液中的血纖蛋白原制備物，右側(cè)圖示出與所述血纖蛋白原制備物I I混合的血漿。2A :緩沖液中血衆(zhòng)衍生的血纖蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2B :緩沖液中PER. C6衍生的重組HMW血纖蛋白原(α -625)；2C :緩沖液中PER. C6衍生的rhFib-ext血纖蛋白原(α -847)；2D 與血衆(zhòng)混合的血衆(zhòng)衍生的血纖蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2E :與血漿混合的PER. C6衍生的重組HMW血纖蛋白原(α -625)；2F :與血漿混合的PER. C6衍生的rhFib-ext血纖蛋白原(α -847)。圖3 :該圖示出加樣來自纖溶酶降解的血漿衍生的材料的材料的Coomassie染色的蛋白質(zhì)凝膠(ERL FIB3,上圖；a-ext Fib,下圖)。條件在凝膠上方標(biāo)示；圖中還示出保溫時間(0、1、5、30、60和120分鐘及ο/η(過夜))。在凝膠的右側(cè)示出麗標(biāo)記。
實(shí)施例實(shí)施例I :優(yōu)化的cDNA構(gòu)建體的制備編碼a-ext Fib (Fib420)、B β和Y人血纖蛋白原多肽鏈的cDNA由GeneArt (Regensburg, Germany)以密碼子優(yōu)化形式合成(i)除去順式作用位點(diǎn)(剪接位點(diǎn)，poly㈧信號)；(ii)修飾Aa鏈的重復(fù)序列；(iii)増加GC含量以延長mRNA半衰期；(iV)使密碼子使用適合于CHO (密碼子適應(yīng)指數(shù)-CAI->0. 95)。將a -ext Fib (SEQ ID NO. 5)、B β (SEQ ID No. 6)和 Y (SEQ ID NO. 6)鏈的密碼子優(yōu)化的cDNA亞克隆進(jìn)pcDNA3. I衍生物中。將Aa-延伸的鏈(Fib420)克隆進(jìn) pcDNA3. I (+)neo 中，B β 鏈克隆進(jìn) pcDNA3. I (+)hygro 中，Y 鏈克隆進(jìn) pcDNA3. I (-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。
實(shí)施例2 :表達(dá)重組人a -ext Fib的PER. C6細(xì)胞系產(chǎn)生重組人血纖蛋白原的PER. C6細(xì)胞系的產(chǎn)生與PCT/EP2009/058754所述相似?？偟膩碚f，將細(xì)胞在MAb培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，用AMAXA nucleofection裝置(程序A-27)轉(zhuǎn)染，及使用Nucleofector試劑盒T,其具有編碼人血纖蛋白原蛋白的三條不同鏈(Aa -ext、Ββ和Y鏈)并含有優(yōu)化的cDNA鏈(分別為SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 6和SEQ ID no. 7)的三個載體。在轉(zhuǎn)染和在96孔平板中鋪板之后，轉(zhuǎn)移325個克隆，在48孔平板中篩選。在擴(kuò)增途徑(expansion path)結(jié)束時,將24個克隆移至搖瓶中，選擇其中8個在連續(xù)分批培養(yǎng)檢測中進(jìn)行穩(wěn)定性和表達(dá)分析。分批培養(yǎng)產(chǎn)量與使用表達(dá)610或625個氨基酸形式的A α鏈的細(xì)胞系獲得的產(chǎn)量相似，表明Aa鏈的延伸不削弱表達(dá)水平。這個結(jié)果最初未曾預(yù)料，因?yàn)檠獫{衍生的血纖蛋 白原與含有610/625Αα鏈的血纖蛋白原相比僅含有1_3%延伸的A α鏈。使用SDS-PAGE的蛋白質(zhì)分析及Western印跡分析表明所述重組血纖蛋白原以完整形式產(chǎn)生，具有預(yù)期大小的α鏈(圖I)。實(shí)施例3 :從PER. C6細(xì)胞培養(yǎng)基中純化α -延伸的血纖蛋白原根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化重組人α-延伸的血纖蛋白原。簡而言之，將(MM)2SO4加入所述培養(yǎng)上清中至40%飽和度，通過離心收集沉淀。隨后，將沉淀物在TMAE加樣緩沖液(5mM Tris-HCl pH 8. 5，O. 01%Tween_20)中溶解，隨后用相同緩沖液透析。然后將蛋白質(zhì)溶液加樣于Fractogel EMD TMAE (m) 40-90 μ m (3ml) (MerckKGaA, Darmstadt, Germany)離子交換柱上。隨后使用在20個柱體積中0_1M NaCl連續(xù)鹽梯度洗脫重組人α-延伸的血纖蛋白原。將在峰值部分的重組人血纖蛋白原通過加入(MM)2SO4至40%飽和度而再次沉淀，通過離心收集。最后，將所述材料在TBS(50mMTris-HCl, pH7. 4, IOOmM NaCl)中溶解，用TBS透析以除去任何殘余的(NH4)2S04。實(shí)施例4 :ROTEM分析 使用ROTEM分析測量a-ext rhFib和血漿衍生的血纖蛋白原的凝血時間(CT)、血凝塊形成時間(CFT)及血凝塊堅(jiān)固性。ROTEM (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)代表Rotation ThromboElastoMetry。該技術(shù)利用一次性試管中浸沒在(血液)樣品中的旋轉(zhuǎn)軸。在不同凝血條件下彈性(elasticity)的改變導(dǎo)致軸旋轉(zhuǎn)的改變,這在凝血彈性描記圖中觀測到，反映出機(jī)械凝血參數(shù)(見例如Luddington R. J. (2005)Clin LabHaematol. 200527(2):81)。將集合的正常(檸檬酸鹽)血漿與血漿衍生的血纖蛋白原(Haemocomplettan，CSLBehring GmbH, Marburg, Germany)或者 PER. C6 血纖蛋白原(HMW rhFib 或 a -ext rhFib)以1:1混合，均為在TBST(TBS+0. 001% Tween-20)中2mg/ml。也直接使用血纖蛋白原制備物(在TBST中2mg/ml)。加入CaCl2至終濃度為17mM(在血漿中測量)或I. 7mM(在緩沖液中測量)。為了開始凝集，加入α-凝血酶至終濃度為I IU/ml。緩沖液中或者與血漿
I I混合的血纖蛋白原制備物的ROTEM 分析圖在圖2中示出。A10、A20、CFT和MCF值(mm)在表I中示出。AlO和A20反映在加入α -凝血酶后10分鐘和20分鐘時血凝塊的堅(jiān)固性。CFT反映從凝血開始直至檢測到20mm血凝塊堅(jiān)固性的時間。MCF反映最大血凝塊堅(jiān)固性。
結(jié)果表明緩沖液中a -ext rhFib的凝集產(chǎn)生比HMW rhFib (A10=4mm)觀測到的結(jié)果更強(qiáng)的血凝塊(A10=12mm)。血漿衍生的血纖蛋白原的AlO為15mm ;這種在緩沖液中較強(qiáng)的血凝塊形成可以由共純化的血液衍生的FXIII的活性解釋，后者與血纖蛋白単體(部分)交聯(lián)。在純化的重組血纖蛋白原中，不存在FXIII，因此不會發(fā)生交聯(lián)。這可以通過在稀釋的血漿(其含有FXIII)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而補(bǔ)償。在這種情況中，形成較強(qiáng)的血凝塊。令人感興趣地，在這種情況中，α-ext rhFib與HMW rhFib或者血衆(zhòng)衍生的Fib相比形成較強(qiáng)的血凝塊并且更快速地形成，A20值分別為21、18和17mm 。表I
權(quán)利要求
1.血纖蛋白原制備物，其在ROTEM 凝血弾性描記法檢測中在相似條件下具有低于血漿衍生的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間的血凝塊形成時間。
2.權(quán)利要求I的血纖蛋白原制備物，其含有至少95%(w/w)的血纖蛋白原，且其中至少10%(w/w)的血纖蛋白原是Fib420形式。
3.權(quán)利要求I或2的血纖蛋白原制備物，其沒有因子XIII。
4.包含權(quán)利要求1-3的血纖蛋白原制備物及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述組合物適于促進(jìn)組織粘附、改良傷ロ愈合或者適于靜脈內(nèi)給予。
6.權(quán)利要求4或5的藥物組合物，其中所述藥物組合物是血纖蛋白密封劑或者局部止血劑。
7.權(quán)利要求4-6的藥物組合物，其進(jìn)ー步包含凝血酶。
8.權(quán)利要求4-7的藥物組合物，其是干燥形式。
9.權(quán)利要求1-3的血纖蛋白原制備物用作藥物。
10.權(quán)利要求1-3的血纖蛋白原制備物或者權(quán)利要求4-8的藥物組合物用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進(jìn)、血纖蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的方法中。
11.權(quán)利要求1-3的血纖蛋白原制備物或者權(quán)利要求4-8的藥物組合物在制備用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進(jìn)、血纖蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
12.制備Fib420血纖蛋白原制備物的方法，所述方法包括 -提供包含編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列的表達(dá)載體； -用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞； -在使得編碼所述血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列表達(dá)的條件下維持所述哺乳動物細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列是優(yōu)化的序列，優(yōu)選是SEQ ID NO. 5所示的優(yōu)化的序列。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞，優(yōu)選PER.C6細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及富含α-延伸的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物。包含這種制備物的組合物與基于HMW Fib的制備物相比示出改良的凝血性質(zhì)，后者典型地不含有或僅含有少量α-延伸的血纖蛋白原。特別地，由α-延伸的血纖蛋白原產(chǎn)生的血凝塊的形成時間和血凝塊強(qiáng)度得以改良。此外，與血漿衍生的血纖蛋白原相比，α-延伸的血纖蛋白原的纖溶酶介導(dǎo)的降解降低。
文檔編號A61K38/36GK102724995SQ201180005609
公開日2012年10月10日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者A·伯特, J·庫普曼, J·格林伯格 申請人:普羅菲布瑞克斯公司