一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法，所述方法，包括如下步驟：將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解；降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑。
【專利說明】一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種疫苗的制備，特別涉及一種肺炎多糖蛋白結合疫苗及其制備方法。
【背景技術】:
[0002]肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起鼻竇炎、中耳炎、氣管炎和肺炎等非侵襲性感染以及膿毒癥和腦膜炎等侵襲性感染，是一種引起所有年齡組高發(fā)病率和病死率的主要致病菌。在兒童呼吸系統(tǒng)中，肺炎發(fā)病率居第二位。世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年死于肺炎鏈球菌感染的160萬人中，約有60%人群為5歲以下兒童?？梢姡窝祖溓蚓胺Q威脅兒童健康的“頭號殺手”。目前，中國是全世界發(fā)病率高的五個亞洲國家之一 O
[0003]在中國的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，由于抗生素的過度使用，目前肺炎球菌對于紅霉素和青霉素等常見抗菌素的耐藥性正在升高，《應高度重視兒童肺炎的預防措施)一文中提到例如血清6型對紅霉素的耐藥性已經(jīng)達到百分之百。因此，接種肺炎球菌結合疫苗，是預防兒童患上肺炎球菌疾病的最佳方式。
[0004]目前，國內(nèi)上市的肺炎球菌結合疫苗產(chǎn)品主要有輝瑞的7價肺炎球菌結合疫苗(PCV7)，商品名為Prevenar，包含7種血清型的肺炎鏈球菌，分別為4，6B，9V，14，18C，19F和23F。PCV7的使用， 降低了兒童侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IB))的整體發(fā)病率。但是由于該疫苗價格昂貴，接種四針需要花費3000多人民幣，這或許會使許多家長望而卻步，放棄對孩子的接種。另一方面流行病學調(diào)查顯示，PCV7在美國和歐洲的覆蓋率為86%和74%，而在亞洲的覆蓋率僅為 43% ,參見 World Health Orgnization.Pneumococcal conjugatedvaccine for childhood immunization-WHO position paper.WklyEpidemiol Recj2007，82(12): 93-104。而且廣泛使用PCV7后的檢測研究發(fā)現(xiàn)，非疫苗覆蓋血清型引起的IB)發(fā)病率持續(xù)升高，例如19A，在美國，2000-2005年由19A引起的侵襲性肺炎鏈球菌疾病的增長超過330%。這種血清型替代可能消弱PCV7帶來的益處。因此，開發(fā)價格適中并且適用中國國情的肺炎球菌結合疫苗迫在眉睫。
[0005]由于肺炎鏈球菌莢膜多糖分子量大多大于lOOOKDa，且粘度較大，在與蛋白結合過程中容易交聯(lián)形成分子量更大的結合物凝膠，不利于分離純化，亦不利于控制多糖蛋白結合物中的蛋白與多糖的質(zhì)量比。因此，需要將純化的莢膜多糖進行水解處理。世界專利WO 2008/079732 A2，提到可以用醋酸對18C型和3型莢膜多糖進行降解，其他專利如WO2007/071707 A2提到可以用微流體化法對多糖進行降解。但上述方法對于某些特殊的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分離效果不佳，如在用醋酸對9V型和4型多糖進行酸水解過程中，導致9V型和4型多糖的抗原性丟失，表現(xiàn)為免疫雙擴結果為陰性。
[0006]莢膜多糖的理化性質(zhì)和生物活性與分子量及分子量分布有很大的關系。因此，在質(zhì)量控制中，分子量是一個重要的指標。對于多糖類化合物，其分子量的描述和測定都較小分子困難得多。目前，傳統(tǒng)的測定多糖分子量的方法是通過分子量標準品校正曲線來確定分子量大小以及分子量的分布。這些方法存在的問題在于，當所測樣品的結構和性質(zhì)與分子量標準品不同時，會給測定結果帶來明顯的誤差。參見Wang W，Bo S，Li S, et al.Determination of the Mark-Houwink equation for chitosan with different degreesof deacctylation.1nt J Biol Macromolj 1991, 13:281 □本發(fā)明釆用高效凝膠體積排阻色譜(SEC)與多角度激光散射(MALLS)檢測器、示差折光(RI)檢測器聯(lián)用增加了測定結果的準確性。該方法可以直接反應各型多糖的絕對分子量大小，不會受到實驗條件的影響。操作更加簡捷，提高了工作效率。
[0007]本發(fā)明的目的之一在于提供一種多價或者13價肺炎多糖結合疫苗。其中13價疫苗含有13種血清型，分別為1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，23F。較目前上市的7價肺炎結合疫苗提供更廣泛的保護，而且成本經(jīng)濟。本發(fā)明的目的之二在于公開一種莢膜多糖的水解方法——超聲降解，這種方法簡便易操作，且容易線性放大，多糖回收率達到90%以上。本發(fā)明的目的之三在于應用一種莢膜多糖分子量的測定方法一多角度激光散射法，該方法簡便快速，可以準確獲得分子量大小以及多糖的分散度等信息；本發(fā)明的目的之四在于提供一種多糖蛋白結合物的制備方法，CDAP活化多糖，該方法簡便，結合效率高。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0008]本發(fā)明公開了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗，該疫苗可以是單價，也可以是多價，優(yōu)選的是13價肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗，所述13價肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖選自血清型為1，3，4，5，6A，6B, 7F，9V,14，18C，19A，19F，23F的肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖，結合疫苗中的載體蛋白為CRM197蛋白或TT蛋白。
[0009]肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法很多，但本發(fā)明通過研究，找到一種新的肺炎鏈球菌莢膜多糖 蛋白結合疫苗的制備方法，所述方法，包括如下步驟:
[0010]一，將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解；
[0011]二，肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結合；
[0012]三，結合疫苗的純化。
[0013]其中，所述提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖是根據(jù)現(xiàn)有技術進行制備或從市場上購買得到，如通過培養(yǎng)肺炎鏈球菌，滅活，提取滅活的肺炎鏈球菌莢膜多糖以及對其進行純化的方式得到。
[0014]其中，所述肺炎鏈球菌莢膜多糖的降解方法，包括如下步驟:
[0015]I)將血清型莢膜多糖溶于二純水中，制備成濃度為l_4mg/ml的溶液，低溫充分溶解；
[0016]2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20_40kHz的超聲波處理溶液，處理時間為10-30min，冷凍干燥；
[0017]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目標大小為50KDa-500KDa時得降解多糖。
[0018]優(yōu)選的降解方法，包括如下步驟:
[0019]I)將莢膜多糖溶于二純水中，制備成濃度為l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解；
[0020]2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液。處理時間為10_30min ；
[0021]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小為80KDa_300KDa。
[0022]其中，所述肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結合的方法；包括如下步驟:
[0023]I)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；[0024]2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP( 1-氰基_4_ 二甲氨基-吡啶四氟硼酸)乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為0.5-1.5:1，維持lmin-3min ；
[0025]3)加入 0.3M NaOH調(diào)節(jié) pH 至 9-10，維持 l_5min，加入濃度為 2-lOmg/ml 的 CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1-1.5:1，維持pH9.5，室溫反應l_2h，加入2M甘氨酸終止反應，2-8°C緩慢攪拌6-18h。
[0026]4)利用Sepharose 4FF層析介質(zhì)對結合物分別進行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物，0.22um無菌過濾后，2-8°C存放；
[0027]5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術制備成疫苗制劑。
[0028]優(yōu)選的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結合的方法；包括如下步驟:
[0029]I)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于二純水、2M NaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；
[0030]2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為1:1，維持1.5min-2min ；
[0031]3)加入0.3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5，維持l-5min，加入溶度為5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1.2:1，維持pH9.5，室溫反應l_2h，加入2M甘氨酸終止反應，2-8 °C緩慢攪拌6-18h;
[0032]4)利用Sepharose 4FF層析介質(zhì)對結合物分別進行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價結合物原液。0.22um無菌過濾后，4 °C放置；
[0033]5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術制備成疫苗制劑。
[0034]以上制備方法適用于本發(fā)明所述的13種肺炎鏈球菌莢膜多糖中的任意一種，若制備成多價疫苗，則按照比例將按照前4步制備得到的各型單價結合物混合，加入適量藥用輔料，制備成多價肺炎多糖蛋白結合疫苗，必要時加入鋁佐劑。對于多價疫苗，其中各型多糖的濃度為4-8ug/ml,優(yōu)選的是4ug/ml。
[0035]其中，肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法，可以為:
[0036]肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，方法如下:
[0037]在發(fā)酵罐中接種單菌型肺炎鏈球菌菌株后，pH控制在6.5-8.0,轉速50_200r/min，培養(yǎng)開始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮氣體，溶氧量控制在1-10%，當發(fā)酵液菌濃(0D600nm)達到0.5-1時，改變通氣方式為從發(fā)酵罐的頂部通壓縮氣體，溶氧控制在
0.01-2%，當發(fā)酵液菌濃達到2-2.5時，適量補充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長的平臺期后滅活菌體。[0038]肺炎鏈球菌莢膜多糖的提取，方法如下:
[0039]所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取中，優(yōu)選的步驟是:
[0040]a、取滅活后的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，去除菌體、菌體碎片及培養(yǎng)液中的小分子成分，得濃縮液；
[0041]b、濃縮液緩慢加入乙醇至終濃度為15-35%后，2_8°C靜置過夜；
[0042]C、所得靜置液離心去除沉淀，上清繼續(xù)加乙醇至終濃度為60-90%后，2-8°C靜置過夜；[0043]d、所得靜置液離心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液復溶后，離心去除沉淀，所得上清即為粗糖溶液；
[0044]肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制，方法如下:
[0045]所得粗糖溶液，采用S印harose 4 Fast Flow分子篩排阻層析分離，按照各個型別的肺炎多糖在歐洲藥典5.0版中的標準收集大分子多糖；分離后的多糖采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得肺炎鏈球菌莢膜多糖。
[0046]優(yōu)選的制備方法為:
[0047]取肺炎鏈球菌某型工作種子，接種于含10%脫纖維羊血營養(yǎng)瓊脂平板上，370C ±1°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。驗證無污染物。
[0048]將上述培養(yǎng)物刮下，接種在數(shù)個IL (培養(yǎng)基裝量500ml)三角瓶中，于37°C ±2°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-20h，于此過程中監(jiān)測菌體密度(600nm)。當菌體密度達到2.0-2.5時，采用平板劃線和鏡檢方法驗證無污染物發(fā)生。
[0049]將1.5L上述培養(yǎng)物接種到50L發(fā)酵罐(裝量30L)中，培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度370C ±2°C，pH維持在7.2±0.2，轉速100r/min。接種后，培養(yǎng)開始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮空氣的通氣方式，溶氧量控制在1_10%，較優(yōu)的3-7%，更優(yōu)的5%。培養(yǎng)過程檢測菌濃(0D600nm)o當菌濃達到0.5-1時，將通氣方式改成從發(fā)酵罐的頂部通壓縮空氣(表面通氣)的通氣方式，溶氧量控制在0-2%，較優(yōu)的0.1-1%，更優(yōu)的0.2%。當發(fā)酵液菌濃達到2-2.5，補充600ml 50%的葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長的平臺期，加入終濃度0.5%的苯酚滅活菌體。繼而進入莢膜多糖提取工藝階段。
[0050]肺炎鏈球菌莢膜多糖的提取
[0051]上述已滅活的培養(yǎng)液，采用15000g離心30min去除菌體及菌體碎片，上清液進一步采用微濾或深層過濾的方式去除殘余的顆粒性物質(zhì)。澄清后的溶液采用IOOkDa的超濾系統(tǒng)濃縮并去除培養(yǎng)液中的小分子成分，最終得濃縮液約3L。
[0052]分步醇沉:上述濃縮液邊攪拌邊緩慢加入預冷無水乙醇，每100ml濃縮液加入33.3ml無水乙醇，充分混勻后4°C靜置過夜。15000g離心30min去除沉淀，上清繼續(xù)邊攪拌邊緩慢補加乙醇至終濃度80%，充分混勻后4°C靜置過夜。15000g離心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液600ml復溶。15000g離心30min去除沉淀得上清，即為粗多糖溶液。
[0053]分子篩排阻層析分離:上述上清采用分子篩排阻層析S^harose CL-4B(其他分子篩排阻層析填料 Sephacryl S-200、Sepharose 4 Fast Flow>Superdex 200 等也可以米用)分離，紫外檢測器(波長206nm)和示差檢測器監(jiān)測樣品峰，收集相對分子量kd ( 0.20的樣品峰。分離后的多糖樣品采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得精制多糖，精制多糖產(chǎn)量為90-120mg/L發(fā)酵液。精制多糖存于_20°C以下冰箱中。精制多糖在層析柱上的分布情況為在206nm下有較高吸收峰的情況下，280nm下吸收值(主要代表蛋白峰)非常低，可見提取的多糖具有較高的純度。
[0054]精制多糖特征鑒定
[0055]生化鑒定項目及方法參見歐洲藥典5.0 ；
[0056]采用IH-NMR對精制多糖進行結構特征分析；
[0057]采用Pnl9F特異性血清(購自丹麥國家血清研究所)利用免疫雙擴散或反向電流免疫電泳對精制多糖進行鑒定；
[0058]米用分子篩排阻層析(Sepharose CL-4B或Sepharose CL-2B)測定精制多糖的相
對分子量。
[0059]本發(fā)明還提供一種利用MALLS準確測定13種莢膜多糖分子量的方法。實施過程如下:
[0060]a將超聲降解后的多糖配制成濃度為l_4mg/ml水溶液，
[0061]b利用SEC-R1-MALLS聯(lián)用技術以0.2M NaCl為流動相，SRT-SEC 1000A為色譜分離柱，在流速0.5 mL柱溫30 °C的條件下對超聲降解后多糖水溶液進行檢測。檢測器為多角度激光檢測器(MALLS)以及示差折光檢測儀(RI)。
[0062]c對降解后多糖的分子量及分子量分布的檢測實驗結果如下:
[0063]I 型平均分子量 Mw 為:120.3-132.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0064]3 型平均分子量 Mw 為:84.0-120.5KDa, Mw/Mn=l.18
[0065]4 型平均分子量 Mw 為:124.4-138.2KDa, Mw/Mn=l.24
[0066]5 型平均分子量 Mw 為:104.2-153.2KDa, Mw/Mn=l.26
[0067]6A 型平均分子量 Mw 為:215.8-325.2KDa, Mw/Mn=l.20
[0068]6B 型平均分子量 Mw 為:326.3-456.3KDa, Mw/Mn=l.25
[0069]7F 型平均分子量 Mw 為:318-425.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0070]9V 型平均分子量 Mw 為:212.7-322.3KDa, Mw/Mn=l.32
[0071]14 型平均分子量 Mw 為:231.2-321.2KDa, Mw/Mn=l.25
[0072]18C 型平均分子量 Mw 為:111.8-232.2KDa, Mw/Mn=l.22
[0073]19A 型平均分子量 Mw 為:133.7-213.2KDa, Mw/Mn=l.29
[0074]19F 型平均分子量 Mw 為:168.8-320.0KDa, Mw/Mn=l.36
[0075]23F 型平均分子量 Mw 為:182.3-236.0KDa, Mw/Mn=l.28
[0076]d所述Mw為聞分子的重均分子量，Mw/Mn表不聞分子的分子量分布。
[0077]與現(xiàn)有肺炎結合疫苗相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0078]I，本發(fā)明較PCV7又分別增加了 6種血清型肺炎鏈球菌:包括1，3，5，6A，7F和19A，組成13價的肺炎多糖結合疫苗，覆蓋率提高，交叉保護率提高至90%以上；
[0079]2，本發(fā)明采用的多糖降解方法，使降解后的多糖黏度降低，分子大小更加均一，有利于結合物的分離純化以及結合物的質(zhì)量控制。降解后的莢膜多糖利用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)活化多糖形成氰酯鍵，然后與CRM197蛋白形成共價鍵。該方法簡單易操作、結合效率高、獲得的結合物的穩(wěn)定性良好。
[0080]3，超聲降解13種莢膜多糖的方法，該方法簡單、易操作、容易實現(xiàn)線性放大、回收率高、在保留多糖的抗原完整性的基礎上能夠使多糖的分子量分布趨于均一。能夠很好的滿足產(chǎn)業(yè)化需求。
【具體實施方式】:
[0081]實施例1
[0082]7F超聲降解:
[0083]a 稱取7F多糖250mg，加入二純水，制備成濃度為2.5mg/ml的溶液，4°C過夜溶解。在冰浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液，處理時間為23min。
[0084]b冷凍干燥
[0085]c利用SEC-R1-MALLS聯(lián)用技術以0.2M NaCl為流動相，SRT-SEC 1000A為色譜分離柱，在流速0.5 mL柱溫30 °C的條件下對超聲降解后多糖進行檢測。檢測器為多角度激光檢測器(MALLS)以及示差折光檢測儀(RI )。
[0086]d結果如下表
[0087]表1 7F型多糖降解前后的質(zhì)量比較
【權利要求】
1.一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法，包括將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解；降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑的步驟，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑，包括以下步驟: O取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為0.5-1.5:1，維持lmin-3min ； 3)加入0.3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9-10，維持l_5min，加入濃度為2-10mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1-1.5:1，維持pH9.5，室溫反應l_2h，加入2M甘氨酸終止反應，2-8°C緩慢攪拌6-18h ； 4)利用Sepharose4FF層析介質(zhì)對結合物分別進行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價結合物原液；0.22um無菌過濾后，2-8 °C存放； 5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術制備成疫苗制劑。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑包括以下步驟: 1)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別溶解于二純水、2MNaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為1:1，維持1.5min-2min ； 3)加入(λ3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5，維持l-5min，加入溶度為5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1.2:1，維持pH9.5，室溫反應l_2h，加入2M甘氨酸終止反應，2-8 °C緩慢攪拌6-18h; 4)利用Sepharose4FF層析介質(zhì)對結合物分別進行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價結合物原液；0.22um無菌過濾后，4 °C放置； 5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術制備成疫苗制劑。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述CRM197蛋白可用TT蛋白代替。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解，方法如下: 1)將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為l_4mg/ml的溶液，低溫充分溶解； 2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20-40kHz的超聲波處理溶液；處理時間為10-30min，冷凍干燥； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目標大小為50KDa-500KDa時得降解多糖。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解，方法如下: 1)將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解； 2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液；處理時間為10_30min ； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小為80KDa-300KDa。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為多價疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖選自血清型為I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F中的幾種肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為13價疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型為I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F的肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，制備多價疫苗制劑，則將按照前4步制備得到的各型單價結合物按照比例混合，加入藥用輔料，必要時加入鋁佐劑，制備成多價肺炎多糖蛋白結合疫苗制劑。
9.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，對于多價疫苗，其中結合物混和后，各單價多糖的濃度為4-8ug/ml。
10.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，對于多價疫苗，結合物混和后，各單價多糖的濃度均為4ug/ml。
【文檔編號】A61P31/04GK103830723SQ201210491658
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月26日 優(yōu)先權日:2012年11月26日
【發(fā)明者】趙秋敏, 孫倩, 李軍強, 金永杰, 李亞冰, 劉賀軍, 曹小丹, 李靜, 李劍 申請人:天士力制藥集團股份有限公司