專利名稱：一類選擇性α_2A受體激動劑的治療阿爾茨海默病用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類具 有CI2a-腎上腺素受體激動劑活性的化合物，該類化合物作為a 2A-腎上腺素受體受體激動劑具有很好的治療阿爾茨海默病的活性。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默癥(Alzheimer' s disease,AD)亦稱老年性癡呆癥或早老性癡呆癥，是老年期常見的一類慢性、進行性神經(jīng)細胞退行性病變。隨著人口的老齡化，AD已成為僅次于心血管病、腫瘤和中風(fēng)而居第四位的死因，目前全球有AD患者約2430萬人，預(yù)計到2040年全球?qū)⒐灿蠥D患者8100萬。有關(guān)AD的病因、預(yù)防和治療靶點的研究成為當今國際迫切熱點課題之一。AD病人的腦內(nèi)病理特征主要為￠-淀粉樣蛋白(0-amyloid,A P )沉積形成的老年斑(Senile Plaque, SP)、微管相關(guān)蛋白(Tau蛋白)過度磷酸化所致的神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元缺失。近年來許多研究者從各個不同的角度如淀粉樣蛋白沉積、炎癥介質(zhì)、血管因素、膽固醇代謝等方面探討AD的病因、病理機制和治療手段。但到目前為止，AD病因和病理機制尚未完全明了，對AD確切有效的藥物尚少，也沒有對因治療根治AD的藥物。a 2A-腎上腺素受體(a 2A_adrenoceptor, a 2A_AR)屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族成員中的一種亞型，廣泛分布在血小板、腦、脊髓、脂肪細胞、腎、脾等組織器官，其生物學(xué)效應(yīng)主要由Gi/Go蛋白介導(dǎo)。Ci2a-AR激活后通過Gi/Go蛋白調(diào)節(jié)能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，降低細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其調(diào)控的蛋白質(zhì)磷酸化，在調(diào)控交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)去甲腎上腺素神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面起關(guān)鍵性作用。隨著a 2A-AR在大腦皮質(zhì)中的大量發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究轉(zhuǎn)向了 a2A-AR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用。近幾年有少量關(guān)于a 2A-AR激動劑在治療精神分裂癥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗焦慮、改善記憶，以及藥物成癮方面有一定成效的報道。此外，亦有報道a2A-AR激動劑能夠通過抑制額前皮質(zhì)的cAMP，超極化環(huán)核苷酸信號途徑而增強帕金森病癥中衰退的工作記憶。近年國外有極少數(shù)幾篇報道，認為a 2A-AR激動劑可能通過減少微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)在絲氨酸及蘇氨酸殘基上的磷酸化而增加皮質(zhì)神經(jīng)元的生長、進一步對AD產(chǎn)生治療作用。神經(jīng)保護劑，神經(jīng)營養(yǎng)劑，神經(jīng)再生劑是一類新型的用于治療AD的藥物，國內(nèi)外臨床應(yīng)用表明，在AD病變的急性期或慢性期開始使用美金剛，神經(jīng)營養(yǎng)因子，鼠神經(jīng)生長因子等神經(jīng)保護劑，具有良好的治療效果。神經(jīng)保護劑的市場份額也正在逐年增加。目前，我國研制的注射用神經(jīng)生長因子在獲得SFDA頒發(fā)的一類生物制品新藥證書后，已加快了藥物臨床和商品化的進程。a 2A-AR激動劑刺激皮質(zhì)神經(jīng)元生長這一作用對于開發(fā)神經(jīng)保護劑具有重要的意義，為AD的預(yù)防和治療提供了新的途徑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是a 2A-AR激動劑，對阿爾茨海默病有預(yù)防或者治療作用。本發(fā)明所述的化合物包括含治療有效量的化學(xué)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明采用高通量篩選技術(shù)，建立了 a2A-AR激動劑高通量篩選模型并應(yīng)用于化合物大規(guī)模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物并進行功能性驗證尋找到了具有化學(xué)式(I)的a2A-AR激動劑。本發(fā)明的技術(shù)方案為在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染a2A受體，建立a 2A-AR激動劑高通量篩選模型，進行初篩，復(fù)篩，構(gòu)效關(guān)系分析，得到一類具有a 2A受體激動活性的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染a 2A受體的CHO細胞株。步驟二 標準曲線的測定及最佳細胞數(shù)確定。步驟三陽性藥驗證。步驟四采用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株和摸索的最佳檢測條件對化合物進行a 2A受體激動劑的高通量篩選，得到有明顯量效關(guān)系的化合物。


圖I :標準曲線及最佳細胞數(shù)曲線(600cell/iil)圖2 :陽性藥胍法辛(Guanfacine)量效曲線
具體實施例方式以下結(jié)合

本發(fā)明的
具體實施例方式I.建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染a 2A-AR的CHO細胞株。應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的盒交換技術(shù)(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)受體細胞株，并使其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染a2A-AR，培養(yǎng)CH0-a2A細胞使其達到穩(wěn)定生長狀態(tài)。2.標準曲線的測定及最佳細胞數(shù)確定。為驗證實驗體系的正確性以及能篩選出可靠的a2A-AR激動劑，在建立模型時需要測定標準曲線并確定最佳細胞數(shù)。待CHO-a 2A細胞生長到80%的時用0. 5mM EDTA的PBS消化細胞，離心去除上層液體，最后將細胞用刺激緩沖液重懸用于確定最佳細胞數(shù)。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配制標準cAMP梯度稀釋液及腺苷酸環(huán)化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標準曲線測定方法將cAMP的標準溶液mol/L( LANCE cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 ill加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 U I終止液，孵育一個小時后檢測；最佳細胞數(shù)檢測方法將50mM的forskolin母液用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，forskolin與含有細胞的抗體溶液各5 加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入IOu I終止液，孵育一個小時后在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據(jù)forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標準曲線斜率相近的細胞濃度作為最佳細胞數(shù)。標準曲線及最佳細胞數(shù)確定見圖I。3.選用a 2A-AR選擇性激動劑Guanfacine對所建立的高通量篩選模型進行驗證并且根據(jù)量效曲線計算其的EC5Q。
陽性藥測定方法將IOOmM的Guanfacine母液,用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，配置能引起最佳細胞數(shù)Ratio EC90效應(yīng)的forskolin稀釋液。陽性藥Guanfacine2. 5 U I與含有最佳細胞數(shù)的抗體溶液5 加入384孔板中共同孵育15分鐘，再將forskolin稀釋液2. 5 ill加入384孔板中孵育30分鐘，加入10 U I終止液再孵育一個小時后用EnVision微孔板測讀儀檢測。陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進行a2A-AR激動劑的的初篩和復(fù)篩。初篩與復(fù)篩過程相同，初篩只選用一個濃度對8萬個化合物進行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個濃度進行復(fù)篩，過程如下用Janus全自動加樣工作站稀釋化合物并吸取5 u I轉(zhuǎn)移到384孔板中，再用Multidrop自動加樣儀將含有最佳細胞數(shù)的抗體溶液5 ill加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘后，Multidrop自動加樣儀將10 U I終止液加入384孔板中，再次孵育一個小時，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復(fù)篩得到一系列具有a 2A-AR激動作用的化合物。復(fù)篩實驗結(jié)果篩選得到的化合物可以根據(jù)母核的結(jié)構(gòu)總結(jié)為一類，結(jié)構(gòu)式與EC5tl如下
權(quán)利要求
1.下式化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽
2.權(quán)利要求I要求保護的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽用于制備具有作為a 2A受體激動劑的藥理作用的藥物制劑的用途。
3.按照權(quán)利要求2的用途，作為a2A受體激動劑，用于治療阿爾茲海默癥。
全文摘要
一類選擇性α2A受體激動劑的治療阿爾茨海默病用途。本發(fā)明涉及一類具有β1-腎上腺素受體激動活性的化學(xué)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，有很強的體外激動β1-腎上腺素受體的活性，EC50均為nM水平，其中活性最強的化合物的EC50為24.34，可用于治療阿爾茨海默病。
文檔編號A61P25/28GK102977054SQ20121054387
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者嚴明, 何玲, 張陸勇, 周濤濤 申請人:中國藥科大學(xué)