專利名稱：聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及制備方法。
背景技術(shù)：
目前，通過(guò)利用生物可降解載體在局部進(jìn)行雙藥投遞是組織學(xué)工程中的一項(xiàng)重要技術(shù)。多種可降解的高分子聚合物可作為投遞載體，其中聚乳酸羥基乙酸(PLGA);由于具有良好的生物相容性、無(wú)毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程 材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國(guó)PLGA已通過(guò)食品藥物管理局認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典。阿司匹林是一種傳統(tǒng)的非留體抗炎藥物，它可以通過(guò)抑制環(huán)氧化物酶l，2(C0X-l，C0X-2)活性進(jìn)而阻斷前列腺素類，血栓烷類等炎癥介質(zhì)的生成。近年來(lái)有研究證實(shí)阿司匹林具有顯著的抗腫瘤效果，在乳腺癌及結(jié)腸癌中具有輔助性治療作用，并且我們的前期研究表明，阿司匹林具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。因而，通過(guò)應(yīng)用生物可降解材料實(shí)現(xiàn)阿司匹林與替莫唑胺同載，從而使阿司匹林增敏替莫唑胺治療效果具有一定的可行性。我們利用噴霧干燥法，制備了阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有高度的侵襲性，目前其治療方式包括手術(shù)切除，及輔助性術(shù)后放射及替莫唑胺化學(xué)治療，但生存期通常不足15個(gè)月。替莫唑胺是一類新型烷化劑，由于其可以通透血腦屏障并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)斷裂誘導(dǎo)凋亡，因而是目前治療膠質(zhì)瘤的常用化療藥物。替莫唑胺口服后迅速吸收，血藥濃度峰值出現(xiàn)在lh，消除速度快，平均半衰期只有1. 7-1. 9h，且在有限的治療劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)。此外，由于DNA修復(fù)酶O6甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)高表達(dá)，P53基因的突變，及抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-XL過(guò)度表達(dá)都限制了替莫唑胺的療效。因此，為了提高其治療效果及避免高劑量造成的毒性反應(yīng)，我們采取了阿司匹林與替莫唑胺的聯(lián)合應(yīng)用并通過(guò)緩釋作用降低了替莫唑胺的治療劑量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明立足于解決當(dāng)前膠質(zhì)瘤化療藥物替莫唑胺血藥半衰期短，消除迅速，具有劑量限制性毒性，及耐藥造成的治療敏感性低的局限性，通過(guò)噴霧干燥法制備了具有緩釋效應(yīng)的阿司匹林-替莫唑胺微球，實(shí)現(xiàn)了二者的同時(shí)投遞，并利用阿司匹林具有的一定抗腫瘤作用提高了替莫唑胺治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果。噴霧干燥法是一種傳統(tǒng)的微球制備方法?；驹硎鞘紫葘⒛倚奈镔|(zhì)分散在預(yù)先液化的包裹材料的溶液中，然后此混合液通過(guò)熱氣流進(jìn)行霧化，使得溶解包裹材料的溶劑迅速液化，最終使囊膜固化，囊心物質(zhì)微膠囊化。利用噴霧干燥法制備微球成本較低，操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因而具有重要的現(xiàn)實(shí)意義而在制藥業(yè)中廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的聚乳酸羥基乙酸(PLGA)包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球，大小均一，表面圓滑，粒徑(Pm)為2. 36±0. 65，載藥率(%)為26±0. 45，包封率(%)為86. 69±1. 51，且毒副作用小，緩釋效果好，持續(xù)釋放時(shí)間為500h。聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺共載微球(PLGA-A-T)的制備方法是稱取一定質(zhì)量的聚乳酸羥基乙酸，阿司匹林，替莫唑胺，各組分摩爾質(zhì)量比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2，將上述微球的各組分溶于乙酸乙酯中制成混合溶液(濃度范圍為30-60M/L)，并通過(guò)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥制備微球，其中進(jìn)風(fēng)溫度為43-45° C，出風(fēng)溫度為38-40° C，待進(jìn)風(fēng)口溫度顯示與設(shè)置溫度顯示相同時(shí)即可進(jìn)行微球的制備。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果可降解生物材料聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺微球，具有一定的緩釋效應(yīng)(持續(xù)釋放時(shí)間為500h)，極大改善了替莫唑胺血漿消除率低的缺陷(半衰期1.7-1. 9h);并實(shí)現(xiàn)了阿司匹林與替莫唑胺的同時(shí)投遞。一定劑量的阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用可提高替莫唑胺的治療效果，從而避免了可能發(fā)生的替莫唑胺劑量限制性毒性。為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化學(xué)藥物治療提供了一種可行的手段。


圖1 :阿司匹林微球(A)，替莫唑胺微球⑶及阿司匹林-替莫唑胺共載微球(C)表面形態(tài)掃描電鏡圖。圖2 :阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球釋放曲線。可見(jiàn)各微球在前20h釋放迅速，隨后釋放變緩，在500h時(shí)，釋放率達(dá)到100%，且3種微球釋放趨勢(shì)一致。圖3 :未處理組，空載微球,阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球?qū)N229和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)。圖4 :未處理組，空載微球，阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球?qū)N229和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)。圖5 :空載微球,阿司匹林微球,替莫唑胺微球及共載微球?qū)N229膠質(zhì)瘤皮下荷瘤模型治療效果評(píng)價(jià)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1 :阿司匹林-替莫唑胺共載微球的制備及表征聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺共載微球(PLGA-A-T):按照摩爾質(zhì)量比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2稱取，各組分分別溶于乙酸乙酯中，制成混合溶液(濃度范圍為30-60M/L)并通過(guò)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥制備微球，其中進(jìn)風(fēng)溫度為43-45° C，出風(fēng)溫度為38-40° C，待進(jìn)風(fēng)口溫度顯示與設(shè)置溫度顯示相同時(shí)即可進(jìn)行微球的制備。I)將載有樣品的燒杯置于噴霧干燥機(jī)載物臺(tái)上，開(kāi)啟攪拌；打開(kāi)空氣壓縮機(jī)，并調(diào)整出氣壓力在5Kg-10Kg之間；打開(kāi)高壓氣體流量計(jì)，使出氣量在10-12L/min左右；將上樣蠕動(dòng)泵的輸液管插入液體中，開(kāi)啟上樣蠕動(dòng)泵，開(kāi)始進(jìn)樣；觀察干燥塔上端噴嘴處的霧化狀態(tài)及干燥塔內(nèi)的干燥情況，同使觀察出風(fēng)口的溫度顯示情況(維持在38-40° C)；2)液料噴干完畢關(guān)斷加熱開(kāi)關(guān)、溶液泵、高壓氣體流量開(kāi)關(guān)和空氣壓縮機(jī)開(kāi)關(guān)，將主收料瓶從旋風(fēng)分離器下口處旋下，進(jìn)行物料收集；所得產(chǎn)物即為制備的阿司匹林-替莫唑胺共載微球，如附圖1、圖2，阿司匹林微球(A)，替莫唑胺微球(B)及阿司匹林-替莫唑胺共載微球(C)表面形態(tài)掃描電鏡圖，可見(jiàn)各微球表面圓滑，粒徑均一，粒徑(ym)為
2.36±0. 65，載藥率(%)為26±0. 45，包封率(%)為86. 69±1. 51，且毒副作用小，緩釋效果好，持續(xù)釋放時(shí)間為500h。實(shí)施例2 :阿司匹林替莫唑胺共載微球抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖
稱取一定質(zhì)量的空載微球,阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球溶于2ml無(wú)血清的培養(yǎng)基中配置成一定濃度的藥物母液。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)LN229和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞到融合度為60%時(shí)，更換為1%胎牛血清培養(yǎng)基，并加入空載微球，阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球母液使各組終濃度分別為O. 02 μ M，5 μ Μ, 10 μ Μ, 10 μ Μ,繼續(xù)培養(yǎng)12h后，用胰酶消化各組細(xì)胞，并以2X IO3每皿接種到直徑為IOcm的大皿中，含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入結(jié)晶紫染液使克隆著色，以此計(jì)數(shù)各皿的克隆形成數(shù)，并以未處理組的平均克隆數(shù)(重復(fù)3次取平均值，下同)為參照，其它各處理組平均克隆數(shù)分別除以未處理組克隆數(shù)，所得比值即為各組的相對(duì)克隆形成率，如圖3所示。與對(duì)照組相比，空載組克隆形成率無(wú)改變，阿司匹林微球組與替莫唑胺微球組略微降低，而共載組克隆形成率顯著降低。實(shí)施例3 :阿司匹林替莫唑胺共載微球促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)LN229和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞到融合度為60%時(shí)，更換為1%胎牛血清培養(yǎng)基，并加入空載微球，阿司匹林微球,替莫唑胺微球及共載微球母液使各組終濃度分別為O. 02 μ M, 5 μ M, 10 μ Μ, 10 μ Μ,培養(yǎng)12h后，更換為10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36h。然后棄培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌細(xì)胞三次，用400ullX Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2-8° C避光條件下孵育15分鐘，加入IOulPI后輕輕混勻于2-8° C避光條件下孵育5分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，如圖4所示，可見(jiàn)與未處理組相比，空載組凋亡率無(wú)改變，阿司匹林微球組與替莫唑胺微球組凋亡率輕微增加，而共載組凋亡率明顯增加。實(shí)施例4 :阿司匹林替莫唑胺共載微球體內(nèi)抑瘤功能檢測(cè)利用100 μ I微量進(jìn)樣器將LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞按5 X IO5每注射點(diǎn)接種于4周齡裸鼠皮下，從而建立瘤源。待皮下腫瘤達(dá)到長(zhǎng)徑3cm時(shí)，取下瘤塊，均勻切碎，并植入各實(shí)驗(yàn)組(n=6)裸鼠皮下，繼續(xù)喂養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)徑達(dá)到5mm左右，各實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始治療。治療方式為皮下瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，治療劑量分別為PLGA (O. 2 μ m/kg)，阿司匹林微球(50 μ m/kg)，替莫唑胺微球(100 μ m/kg)，共載微球(105 μ m/kg)，治療次數(shù)為一次。同時(shí)開(kāi)始觀察治療效果，每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤長(zhǎng)短徑,按公式腫瘤體積=0. 5 X長(zhǎng)徑X短頸2計(jì)算腫瘤體積，持續(xù)監(jiān)測(cè)3周，然后將各處理組裸鼠處死，剝下瘤塊，稱取瘤重，如圖5所示，與空載微球治療組相比，阿司匹林治療組腫瘤生長(zhǎng)體積，瘤重略降低，替莫唑胺治療組也一定程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)能力，而兩藥共載組治療后腫瘤體積及質(zhì)量明顯降低。
權(quán)利要求
1.一種聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球，其特征是表面圓滑，粒徑2. 36 ±O. 65 μ m，載藥率為26 ±O. 45%，包封率為86. 69 ±1. 51%，緩釋時(shí)間為500h。
2.權(quán)利要求1微球的制備方法，其特征是步驟如下聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林和替莫唑胺共載微球稱取聚乳酸羥基乙酸，阿司匹林，替莫唑胺，各組分摩爾比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2 ;將各組分溶于乙酸乙酯中(濃度范圍為30-60M/L)，制成混合溶液，通過(guò)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥法制備微球，其中進(jìn)風(fēng)溫度為43-45° C，出風(fēng)溫度為38-40° C，待進(jìn)風(fēng)口溫度顯示與設(shè)置溫度顯示相同時(shí)即可進(jìn)行微球的制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及制備方法；稱取聚乳酸羥基乙酸、阿司匹林、替莫唑胺，溶于乙酸乙酯中制成混合溶液，并通過(guò)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥制備微球，其中進(jìn)風(fēng)溫度為43-45°C，出風(fēng)溫度為38-40°C，待進(jìn)風(fēng)口溫度顯示與設(shè)置溫度顯示相同時(shí)即可進(jìn)行微球的制備。微球大小均一，表面圓滑，粒徑(μm)為2.36±0.65，載藥率(%)為26±0.45，包封率(%)為86.69±1.51，且毒副作用小，緩釋效果好,持續(xù)釋放時(shí)間為500h。一定劑量的阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用可提高替莫唑胺的治療效果，避免了可能發(fā)生的替莫唑胺劑量限制性毒性。為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化學(xué)藥物治療提供了一種手段。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103006571SQ20121054482
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者康春生, 原續(xù)波, 史振東, 錢(qián)小敏, 韓磊, 浦佩玉 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院