專利名稱：11s大豆抗原蛋白注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種IlS大豆抗原蛋白注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
大豆在我國普遍種植，具有價格便宜，蛋白質(zhì)含量高等特點，是畜禽業(yè)生產(chǎn)中最主要的蛋白質(zhì)來源。然而，大豆中存在的抗原蛋白物質(zhì)能引起人和動物尤其是在嬰幼兒和幼齡動物中引發(fā)過敏反應(yīng)導致腹瀉甚至死亡，造成重大的損失。據(jù)報道，β-伴大豆球蛋白(β -Conglycinin)和大豆球蛋白(Glycinin)是引起動物致敏的主要成分，分布于大豆種子的子葉中。β_伴大豆球蛋白，簡稱IlS蛋白，是由非共價鍵形成穩(wěn)定的三聚體糖蛋白，相對分子量為180 kD,含α, α’和β三個亞基。大丑球蛋白，簡稱IlS蛋白，分子量為350 KD，由6個亞基組成，每個亞基由一個酸性肽鏈和一個堿性肽鏈通過一個二硫鍵連接起來。這兩種組分約占大豆蛋白的70%左右，是引起過敏反應(yīng)的主要抗原蛋白，也是國內(nèi)外學者對食源性過敏反應(yīng)的主要研究對象。目前，大多研究使用膨化、熱乙醇變性法、熱加工法等處理方法，使致敏因子變性失活；或通過改善酶的作用條件，優(yōu)化酶制劑的組合，利用外源酶對IlS大豆抗原蛋白進行酶解從而去除抗原蛋白；或使用蛋白質(zhì)糖基化工程對蛋白質(zhì)表面的糖鏈進行改造，來改良蛋白質(zhì)性質(zhì)；或利用基因敲除的方法使某些基因無法表達，從而消除大豆中的致敏因子。這些方法不能完全去除致敏物質(zhì)，而且去除條件要求高，成本增力口，雖然有新品種培育出，但需要復雜的食品安全評估過程和農(nóng)業(yè)推廣問題，導致其無法在生產(chǎn)實踐中得到廣泛應(yīng)用。因此實現(xiàn)從動物體的過敏反應(yīng)出發(fā)，探索出一種可以保護動物免受IlS大豆抗原蛋白物質(zhì)危害的方法，不但能夠減少經(jīng)濟損失，而且可以有效的控制該病的發(fā)生，具有長遠的社會效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種IlS大豆抗原蛋白注射液。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一種IlS大豆抗原蛋白注射液，包括以下組分:純化后的IlS蛋白、白油、司班、硬脂酸鋁，以每ImLllS大豆抗原蛋白注射液計，白油為0.41-0.51 mL，司班為0.021-0.035mL，硬脂酸鋁為 0.011-0.021g。進一步地，其包括以下組分:純化后的IlS抗原蛋白、白油、司班、硬脂酸鋁，以每ImLllS大豆抗原蛋白注射液計，白油為0.47 mL，司班為0.03mL，硬脂酸鋁為0.0lgo一種制備上述IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，包括步驟:將IlS蛋白純化，將白油、司班、硬脂酸鋁混合加熱至融化，將純化后的IlS抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸鋁的融化液進行混勻，再乳化得到Iis大豆抗原蛋白注射液。進一步地，上述IlS蛋白的純化包括:將IlS蛋白溶于pH不小于7.4的磷酸鹽緩沖液，凝膠過濾，用磷酸鹽緩沖液洗脫得到的洗脫液經(jīng)透析得純化的IlS大豆抗原蛋白。進一步地，上述白油、司班、硬脂酸鋁混合加熱至融化后11(T120 °C滅菌2(Γ40min。進一步地，上述IlS大豆抗原蛋白，白油、司班、硬脂酸鋁融化液混勻先用渦旋機混勻，再超聲混勻。本發(fā)明的有益效果:(I)本發(fā)明能有效預防動物對大豆及其飼料的食入性過敏。解決了動物對大豆抗原蛋白食入性過敏的危害。(2)具有較好的穩(wěn)定性和水溶性無需苛刻的儲存條件，使用方便。(3)制備工藝簡單可行，已具備擴大生產(chǎn)的條件和技術(shù)，更易實現(xiàn)產(chǎn)品化。總之，本發(fā)明的IlS大豆抗原蛋白注射液具有針對性強，緩釋性高，效果顯著等特點，可用于預防臨床上動物對大豆及其飼料的食入性過敏問題，有望解決豆制品的食入性過敏帶來的危害。本發(fā)明具有制備方法簡單，便于儲存，便于操作，易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
具體實施例方式下面根據(jù)實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明?？傮w而言，本發(fā)明的IlS大豆抗原蛋白注射液的制備包括:(I)抗原的純化及純度分析純化:將IIS蛋白溶于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，Sepharose CL-6B凝膠過濾(1.6X120 cm層析柱)，用磷酸鹽緩沖液洗脫得到的洗脫液經(jīng)透析得IlS蛋白，儲存于_20°C作為抗原備用。 純度分析:將膠板上好并安裝在電泳槽中，分別取10 μ 標準(樣品)蛋白溶解液于EP管內(nèi)，再加入10 μ 2倍樣品緩沖液，上樣量為10 μ 。加樣前，樣品在沸水中加熱3飛min，冷卻后備用。根據(jù)目的抗原蛋白亞基的分子量大小，選擇分離膠和濃縮膠的濃度為5%的凝膠。將膠液沿著玻璃板倒入兩板之間的夾縫至離上板口約1.50 cm處，在分離膠溶液上覆蓋一層f 5 mm的水層用于消泡和密封。靜止放置(45飛O min)待其凝固。蒸餾水沖洗膠面，用吸水紙將膠面吸干。倒好膠后，插好梳子，使梳子孔中無氣泡。上樣及電泳:上樣量分別為10 PL，濃縮膠的電壓為55 80 V，電流為16 18 mA，電泳時間1.5 h，分離膠的電壓為10(Γ125 V，電流為3(T35 mA,電泳時間4 h。染色和脫色:電泳結(jié)束后，撤下膠板切去濃縮膠，輕輕揭下凝膠；37 1:以上溫度，在固定液漂洗20 min;棄去固定液，放入適量新鮮染色液染色45 min。傾去染色液,用自來水漂洗直到水流無顏色為止,倒入適量脫色液進行脫色，每隔1.5 h換一次脫色液,直至蛋白亞基條帶顯色清晰。用Quantity One軟件，用光密度法分析SDS電泳圖片，并計算其純度為90.6%。(2)佐劑制備:采用5種不同的佐劑(弗氏佐劑、白油、氫氧化鋁、PBS、蜂膠)，其中I種佐劑為本發(fā)明的氫氧化鋁膠體，另外4種做對比。(具體見實施例f 5)(3)乳化抗原蛋白取0.5 mL的抗原液加入等體積的佐劑(弗氏佐劑、白油、氫氧化鋁、PBS、蜂膠)，放置在1.5 mL的EP管中，先用渦旋機混勻，再超聲混勻，乳化完成后，4 °C冷藏保存。(4)抗原蛋白注射液檢驗a.乳化完全性試驗
取I滴乳化液滴在一杯清水里，看此液滴是否分散，如果不分散則表明乳化完全，否則還要繼續(xù)乳化。乳化完成后，37 °C室溫保存。
b.穩(wěn)定性試驗
室溫37°C保存一個月，底部有微量水析出，搖勻后再放置一周，沒有出現(xiàn)分層和破乳的現(xiàn)象。
c.無菌檢驗
將制備好的注射液接種至營養(yǎng)肉湯中，37 °C培養(yǎng)18 24 h后再接種至營養(yǎng)瓊脂斜面，37 °C培養(yǎng)48 72 h，同時取佐劑同法操作，作為陰性對照。結(jié)果判定:營養(yǎng)肉湯清亮透明，營養(yǎng)瓊脂斜面無菌落生長。
d.刺激性試驗和熱原性試驗
選取健康家兔5只，一側(cè)后肢股四頭肌內(nèi)分別注射蛋白注射液I mL，另一側(cè)后肢對應(yīng)部位注射生理鹽水I mL作為對照，發(fā)現(xiàn)眼和結(jié)膜、呼吸、飲食、行為活動均表現(xiàn)正常，未見有任何中毒癥狀和死亡，與對照組比較無差別；48 h后將家兔處死，解剖觀察家兔腿部肌肉，其肌肉完整、無充血現(xiàn)象。注射該注射液的家兔并沒有出現(xiàn)熱原性反應(yīng)，家兔體溫正常。
e.小鼠試用試驗及佐劑篩選
采用完全隨機化，將260只昆明鼠(20±2 g)隨機分為弗氏佐劑處理組、白油佐劑處理組、氫氧化鋁佐劑處理組、PBS佐劑處理組、蜂膠佐劑處理組，對照組注射生理鹽水，處理組使用不同佐劑IlS大豆抗原蛋白注射液，每個處理組按體重分別注射IlS大豆抗原蛋白量為 500 Pg Kg'1000 Pg Kg'2000 Pg Kg'3000 Pg Kg-1 和 4000 Pg Kg' 首次免疫，取混合乳化后大豆蛋白抗原，于小鼠頸背部皮下注射。10 d后，同樣方法注射相應(yīng)抗原組分(弗氏完全佐劑蛋白抗原注射液替換為弗氏不完全佐劑蛋白抗原注射液)，連續(xù)10 d后重復I次，第三次注射完成10 d后采集血液，分離血清，測定抗體效價。
取第三次采血后所得的小鼠血清(免疫不同濃度蛋白血清各一份)，利用打孔器在1%的瓊脂糖平板上中心打I個孔，周圍6個孔，孔直徑約3 mm，孔距約4 mm，封底。用微量移液器加樣于孔中，中心孔加入純化的11S，濃度為I mg*mL'周圍6孔依次加入等倍稀釋(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32)的抗血清，于37 °C濕盒中孵育18 24 h，結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠擴散試驗測定抗 血清的效價，抗體效價均在1:16或1:32。
具體的，參見實施例。
實施例1:一種IlS大豆抗原蛋白注射液，其組成為:
IlS大豆抗原蛋白Iml
弗氏佐劑 0.5ml
弗氏不完全佐劑 0.5ml
各取0.5 mL的抗原液加入等體積的弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑，分別放置在1.5mL的EP管中，先用渦旋機混勻，再在超聲波勻質(zhì)機中混勻。并分別取I滴乳化液滴在一杯清水里，看此液滴是否分散，如果不分散則表明乳化完全，否則繼續(xù)乳化，直至乳化完全，分別灌裝于安瓿瓶中121°c高壓30min，于37 1:常溫保存一個月，看有無分層和破乳現(xiàn)象，如果沒有，搖勻后再放置一周，仍沒有出現(xiàn)分層和破乳的現(xiàn)象，方可使用。
將制備好的注射液接種至營養(yǎng)肉湯中，37 °C培養(yǎng)18 24 h后再接種至營養(yǎng)瓊脂斜面，37 °C培養(yǎng)48 72 h，同時取佐劑同法操作，作為陰性對照。結(jié)果判定:營養(yǎng)肉湯清亮透明，營養(yǎng)瓊脂斜面無菌落生長，則可表明注射液無菌符合規(guī)定；若肉湯混濁，營養(yǎng)瓊脂斜面出現(xiàn)菌落繁殖(還需涂片鏡檢)，則不符合規(guī)定。
選取健康家兔5只，一側(cè)后肢股四頭肌內(nèi)分別注射蛋白注射液I mL，另一側(cè)后肢對應(yīng)部位注射生理鹽水I mL作為對照，48 h后將家兔處死，解剖觀察注射部位肌肉組織的變化。有無出現(xiàn)熱原性反應(yīng)。
實施例2:—種IlS大豆抗原蛋白注射液，其組成為:
HS大豆抗原蛋白05ml 白油0.47 mL 司班0.0SmTv 硬脂酸鋁0.0 Ig
白油，司班，硬脂酸鋁，混合加熱融化，116 °C滅菌30 min。在IlS蛋白中加入滅菌的白油、司班、硬脂酸鋁融化液，再乳化。
取0.5 mL的抗原液加入等體積的白油佐劑，制備方法同實施例1。
實施例3:—種IlS大豆抗原蛋白注射液，其組成為:
IlS大豆抗原蛋白0.5ml
氫氧化鋁 0.5ml
無水AlCl3緩慢加入到去離子水中，與適量NaOH反應(yīng)，沉淀用去離子水反復洗滌數(shù)次，離心得到氫氧化鋁膠體，116 °C滅菌30 min。取0.5 mL的抗原液加入等體積的氫氧化鋁佐劑，制備方法同實施例1。
實施例4:一種IlS大豆抗原蛋白注射液,其組成為:
IlS大豆抗原蛋白0.5ml
PBS0.5ml
NaH2PO4-Na2HPO4 0.01 mol.L'NaCl 0.85%,pH7.4,116 °C滅菌 30 min。取 0.5mL的抗原液加入等體積的PBS佐劑，制備方法同實施例1。
實施例5:—種IlS大豆抗原蛋白注射液,其組成為:
IlS大豆抗原蛋白 0.5ml
蜂膠0.5ml
取合格蜂膠研磨，用適量950 g L4酒精純化，并配成30 mg mL4溶液。取0.5mL的抗原液加入等體積的蜂膠 佐劑，制備方法同實施例1。
弗氏佐劑IlS蛋白血清抗體效價檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種IlS大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，包括以下組分:純化后的IlS蛋白、白油、司班、硬脂酸鋁，以每ImLllS大豆抗原蛋白計，白油為0.041-0.05 ImL，司班為0.021-0.035mL，硬脂酸鋁為 0.011-0.021g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IlS大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，其包括以下組分:純化后的Iis大豆抗原蛋白、白油、司班、硬脂酸鋁，以每ImLllS大豆球蛋白計，白油為0.47mL ,司班為0.03mL,硬脂酸招為0.0lg。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述的IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，包括步驟: 將Iis蛋白純化，將白油、司班、硬脂酸鋁混合加熱至融化，將純化后的IlS大豆抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸鋁的融化液進行混勻，再乳化得到IlS大豆抗原蛋白注射液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述IlS蛋白的純化包括:將IIS蛋白溶于pH不小于7.4的磷酸鹽緩沖液，凝膠過濾，用磷酸鹽緩沖液洗脫得到的洗脫液經(jīng)透析得純化的IlS大豆抗原蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述白油、司班、硬脂酸鋁混合加熱至融化后11(T120 °C滅菌2(T40 min0
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備IlS大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，所述IlS大豆抗原蛋白，白油 、司班、硬脂酸鋁融化液混勻先用渦旋機混勻，再超聲混勻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種11S大豆抗原蛋白注射液，按照體積百分比計，其包括以下組分純化后的11S蛋白、白油、司班、硬脂酸鋁，以每1mL11S大豆抗原蛋白注射液計，白油為0.41-0.51mL ，司班為0.021-0.035mL，硬脂酸鋁為0.011-0.021g。其制備方法包括將11S蛋白純化，將白油、司班、硬脂酸鋁混合加熱至融化，將純化后的11S大豆抗原蛋白加入至白油、司班、硬脂酸鋁的融化液進行混勻，再乳化得到11S大豆抗原蛋白注射液。本發(fā)明的優(yōu)點在于，能有效預防動物對大豆及其飼料的食入性過敏。解決了動物對大豆抗原蛋白食入性過敏的危害；具有較好的穩(wěn)定性和水溶性無需苛刻的儲存條件，使用方便；制備工藝簡單可行，已具備擴大生產(chǎn)的條件和技術(shù)，更易實現(xiàn)產(chǎn)品化。
文檔編號A61K9/107GK103202809SQ20131000096
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者吳金節(jié), 寇亞楠, 孫志闊, 王希春, 馬良友, 徐述亮, 陳亮, 王勇, 樊海新, 李寶 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學