本發(fā)明關(guān)于一種非常簡(jiǎn)易且有效率的方式來(lái)殺死，特別涉及一種利用自組裝的金納米殼層包覆細(xì)菌的納米材料借助激光產(chǎn)生光熱分解與冷光來(lái)殺死與追蹤細(xì)菌的方法，可應(yīng)用于抗藥性細(xì)菌的殺死與追蹤。

背景技術(shù)：
1.傳統(tǒng)殺菌方式1.1抗生素(antibiotic)抗生素是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其它生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)臨床常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下萬(wàn)種?？股厥聦?shí)上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對(duì)霉菌、支原體、衣原體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用。用于治病的抗生素除由此直接提取外；還有完全用人工合成或部分人工合成的。然而，重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生抗藥性。的所以現(xiàn)在提出杜絕濫用抗生素此乃是原因的一，且科學(xué)地使用抗生素是有必要的。通常建議做細(xì)菌培養(yǎng)并作藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選用極度敏感藥物，這樣就避免了盲目性，而且也能收到良好的治療效果?？股氐瓤咕鷦┑囊志驓⒕饔?，有幾種作用機(jī)制：a.阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡，以這種方式作用的抗生素主要是beta-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，不受這類(lèi)藥物的影響。b.與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、打開(kāi)膜上的離子通道，讓細(xì)菌內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出菌體或電解質(zhì)平衡失調(diào)而死。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌肽等。c.與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物（如轉(zhuǎn)移核糖核酸、信息核糖核酸）相互所用，抑制蛋白質(zhì)的合成，這意味著細(xì)胞存活所必需的結(jié)構(gòu)蛋白和酶不能被合成。以這種方式作用的抗生素包括四環(huán)素類(lèi)抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)抗生素、氯霉素等。d.阻礙細(xì)菌脫氧核糖核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，阻礙脫氧核糖核酸復(fù)制將導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞分裂繁殖受阻，阻礙脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)錄成信息核糖核酸則導(dǎo)致后續(xù)的信息核糖核酸翻譯合成蛋白的過(guò)程受阻。以這種方式作用的主要是人工合成的抗菌劑喹諾酮類(lèi)（如氧氟沙星）。e.影響葉酸代謝，抑制細(xì)菌葉酸代謝過(guò)程中的二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶，妨礙葉酸代謝。因?yàn)槿~酸是合成核酸的前體物質(zhì)，葉酸缺乏導(dǎo)致核酸合成受阻，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，主要是磺胺類(lèi)和甲氧芐啶。1.2高溫高壓滅菌釜(autoclave)高溫高壓滅菌釜是用水蒸氣的高溫高壓對(duì)物品進(jìn)行滅菌處理的裝備。通常的處理?xiàng)l件是在高壓1.2-1.5千克/平方厘米飽和蒸汽攝氏121℃下處理25到40分鐘，導(dǎo)致細(xì)菌體蛋白質(zhì)與酵素凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。具體處理?xiàng)l件由待處理物品的體積和數(shù)量決定。高溫高壓滅菌釜被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、醫(yī)藥領(lǐng)域、刺青、身體穿孔、獸醫(yī)學(xué)、牙醫(yī)學(xué)、足病醫(yī)療和修復(fù)整形制備。滅菌釜的大小和功能因其處理的對(duì)象而異。典型的處理對(duì)象包括實(shí)驗(yàn)室玻璃制品、手術(shù)用具、醫(yī)療廢物、病患護(hù)理用品、動(dòng)物籠填充墊，以及培養(yǎng)基。目前，滅菌釜在醫(yī)療廢物（諸如帶有致病菌的醫(yī)院廢物）拋棄前的滅菌處理方面應(yīng)用正在顯著增長(zhǎng)。作此種功用的滅菌釜，通常都是使用原始原理的普通滅菌釜，通過(guò)利用加壓蒸汽和過(guò)熱水來(lái)消毒有潛在致病能力的物品。新一代的廢物處理高壓釜可以在不使用任何加壓容器的情況下對(duì)培養(yǎng)基、橡膠制品、實(shí)驗(yàn)服、手套等達(dá)到相同的殺菌效果。2.生物性模版(template)與金納米粒子作用的簡(jiǎn)介雖然目前有很多自組裝方式來(lái)制備得到納米材料，即便有這些方式來(lái)制得材料，但也很難利用這些如化學(xué)或物理方法來(lái)達(dá)到完全控制自組裝的合成。其自組裝過(guò)程中的很高的準(zhǔn)確度與靈活性也是我們想到發(fā)展的，然而生物性模版在此提供了我們另一種可達(dá)到這些性質(zhì)的自組裝方式，其中細(xì)菌是一極有潛力的生物性模版，但目前只有極少數(shù)發(fā)現(xiàn)對(duì)此探討。2-1.病毒模板病毒大致上是由一蛋白殼層(proteinaceousshell)，衣殼(capsid)所構(gòu)成，并將遺傳物質(zhì)包覆在內(nèi)部，然而以病毒作為模版，它可展現(xiàn)以下的特性：有固定的結(jié)構(gòu)與成分、分散性好、表面有特異性的結(jié)合作用位置、有完全的分散但不同結(jié)構(gòu)的形態(tài)(如球狀、棒狀與管狀病毒)與表面具有孔洞或通道可使物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)部等。故非常適合當(dāng)作一納米構(gòu)筑模板，來(lái)進(jìn)行自組裝的化學(xué)反應(yīng)。Radloffet.al.在2005年提出以直徑約為140納米的虹彩病毒(Chiloiridescentvirus，CIV)當(dāng)作核心，先與直徑2-5納米的金納米粒子混合，使這些小尺寸的金納米與其表面作用后形成一成核點(diǎn)(nucleationsite)，再加入金離子溶液與的混合形成一納米殼層(nanoshell)，得到一金屬介電納米結(jié)構(gòu)(metallodielectricnanostructures)的材料。且發(fā)現(xiàn)通過(guò)加入不同量的電解質(zhì)來(lái)控制并減少病毒表面所帶的電荷，以得到不同厚度的金納米殼層且其表面電漿共振也會(huì)隨其納米殼層的厚度而有所變化。由此結(jié)果對(duì)于虹彩病毒表面與金納米粒子的特殊作用位置有更深一層的了解。2-2.真菌范本真菌的外觀寬達(dá)數(shù)微米與長(zhǎng)達(dá)數(shù)毫米的菌絲構(gòu)成;借助此特性將納米粒子連接或包覆在菌絲上，依照不同需求可將的應(yīng)用在高表面積感應(yīng)器(sensors)、具有光學(xué)活性(opticallyactive)的結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域上。利用簡(jiǎn)單的碳與氮為養(yǎng)分即能生長(zhǎng)的微生物如真菌當(dāng)范本，再利用小分子與納米粒子間的作用，即可于模版上長(zhǎng)出粒子或聚集物最后生成一納米殼層，Sugunanet.al.在2007年提出利用麩胺酸(glutamate)鈉還原氯金酸，生成以麩胺酸離子為保護(hù)劑的高度生物兼容性的15納米的金納米粒子。其中麩胺酸的碳與氮經(jīng)由氧化作用生成二氧化碳與氨，可當(dāng)作真菌的養(yǎng)分來(lái)源，再與小巢狀曲菌(Aspergillusnidulans)真菌于金離子溶液環(huán)境中混合形成覆蓋一層金納米粒子的微米線。利用此制備方式在未來(lái)的研究：可在任何的微生物上自組裝出任何形狀與成分的材料。2-3.細(xì)菌范本細(xì)菌一般是單細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏細(xì)胞核、細(xì)胞骨架以及膜狀胞器，例如粒線體和葉綠體，但是有細(xì)胞壁。根據(jù)細(xì)胞壁的組成成分，細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚(15-80納米)并由肽聚糖(peptidoglycan)所構(gòu)成，脂質(zhì)含量較少(1-4%)，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較薄(10-15納米)由糖蛋白、外膜和脂多糖體(lipopolysaccharide，LPS)所組成且脂質(zhì)含量較多(11-22%)。細(xì)菌與金屬離子之間的相互作用、生物體在其中所扮演的角色一直為科學(xué)家所研究，但關(guān)于金離子(Au3+)的微生物吸附和還原的特性及其應(yīng)用并未有深入了解。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用自組裝的金納米殼層包覆細(xì)菌的納米材料借助激光產(chǎn)生光熱分解與冷光來(lái)殺死與追蹤細(xì)菌的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種利用自組裝的金納米殼層包覆細(xì)菌的納米材料借助激光產(chǎn)生光熱分解與冷光來(lái)殺死與追蹤細(xì)菌的方法，選取細(xì)菌作為生物模板，并使用含金離子的溶液分別與細(xì)菌混合培養(yǎng)，由于細(xì)菌表面有一層由糖蛋白組成的S層，且S層上糖蛋白的羧基和肽鏈上胺基酸殘基的離子化羧基與金離子作用，利用糖蛋白部分的水解產(chǎn)物如還原糖的半縮醛羥基或游離態(tài)的醛基當(dāng)作電子供應(yīng)者，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)后，將金離子還原成金納米粒子沉積在細(xì)菌的表面，形成一細(xì)菌包覆金納米殼層的納米材料，再利用線性與非線性激光照射包覆金納米殼層的細(xì)菌以產(chǎn)生熱從而有效率的殺死細(xì)菌。優(yōu)選地，其中該含金離子的溶液包含：四氯金酸溶液、含碳酸金的錯(cuò)離子溶液、吡啶三氯化金溶液或四氯化金鉀溶液。優(yōu)選地，其中該照射包覆金納米殼層該細(xì)菌其金納米材料在利用非線性激光照射后，能對(duì)包覆以金納米材料的細(xì)菌產(chǎn)生光熱分解效果。優(yōu)選地，其中該金納米殼層包覆細(xì)菌的納米材料在借助非線性激光照射后具有產(chǎn)生冷光的光學(xué)特質(zhì)，得以持續(xù)放光而不會(huì)產(chǎn)生光漂白，隨著照射時(shí)間加長(zhǎng)，產(chǎn)熱效果更為明顯，使得細(xì)菌死亡越多，所產(chǎn)生的冷光越強(qiáng)，借助此來(lái)判斷細(xì)菌的存活。優(yōu)選地，其中該利用線性激光照射時(shí)，該細(xì)菌金納米材料于近紅外光區(qū)波長(zhǎng)范圍為700納米至1400納米內(nèi)達(dá)到良好的吸收，對(duì)該材料利用激發(fā)光波長(zhǎng)為808納米的連續(xù)性線性激光照射時(shí)，使得該材料具有極高效率的升溫效果，以光分解效應(yīng)，來(lái)殺死細(xì)菌。優(yōu)選地，其中該利用非線性激光照射時(shí)，該細(xì)菌金納米材料于近紅外光區(qū)波長(zhǎng)范圍為700納米至1400納米內(nèi)達(dá)到良好的吸收，對(duì)該材料利用激發(fā)光波長(zhǎng)為720至820納米的脈沖式非線性飛秒激光照射時(shí)，使得該材料具有極高效率的升溫效果，以光分解效應(yīng)，來(lái)殺死細(xì)菌。優(yōu)選地，其中被包覆金納米材料的細(xì)菌在被產(chǎn)生的熱能殺死所產(chǎn)生的冷光，作為追蹤與確認(rèn)傷口上細(xì)菌的存活、動(dòng)向與座落的位置。優(yōu)選地，其中該適用的細(xì)菌為大腸桿菌BL21菌株、枯草桿菌、非抗藥性金黃色葡萄球菌或抗藥性金黃色葡萄球菌。優(yōu)選地，其中該含金離子的溶液與細(xì)菌混合培養(yǎng)，能用在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)，以產(chǎn)生包覆金納米殼層的細(xì)菌，并以非線性激光照射，在體內(nèi)亦能產(chǎn)生光熱分解與冷光以殺死細(xì)菌及作為細(xì)菌存活的追蹤。本發(fā)明具有以下有益效果：以生物模板自組裝得到有功能的納米材料雖然是很具有潛力，但至目前為止依舊是一個(gè)未知的領(lǐng)域。目前，也沒(méi)有許多發(fā)現(xiàn)同時(shí)以大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21菌株、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、非抗藥性金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)與抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)做為生物范本，以不加任何還原劑、自組裝的簡(jiǎn)易方式于細(xì)菌表面的S層(S-layer)自組裝成一金納米殼層。在此本發(fā)明已成功的在細(xì)菌表面經(jīng)由氧化還原方式制得一細(xì)菌包覆金納米殼層的納米材料，將具有傳染性的病原菌變換成一新型的光熱材料。并發(fā)現(xiàn)包覆了金納米殼層的細(xì)菌經(jīng)幾周后，依舊俱有生命力。利用線性與非線性激光照射時(shí)，此細(xì)菌金納米材料于近紅外光區(qū)皆具有不錯(cuò)的吸收。且由于金有非常好的光熱轉(zhuǎn)換效率，故可利用線性與非線性激光照射此細(xì)菌金納米材料來(lái)產(chǎn)生光熱分解效應(yīng)，并有效率的殺死細(xì)菌。另一大優(yōu)點(diǎn)為利用非線性激光照射時(shí)，此細(xì)菌金納米材料不僅會(huì)產(chǎn)生光熱分解效應(yīng)，同時(shí)此材料本身具有產(chǎn)生冷光的光學(xué)特質(zhì)，當(dāng)被殺死的細(xì)菌越多，產(chǎn)生的冷光越強(qiáng)，且可持續(xù)放光不會(huì)產(chǎn)生光漂白。我們另以高壓滅菌釜與抗生素處理完此材料讓細(xì)菌死亡后，并照射非線性激光，發(fā)現(xiàn)是無(wú)冷光產(chǎn)生的。由此可知，此材料冷光的生成，需要利用非線性激光照射才會(huì)產(chǎn)生。除了體外實(shí)驗(yàn)成功的外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上也發(fā)現(xiàn)于傷口上亦具有相同的冷光放光效應(yīng)且具非常好的殺菌效果，故可借助此冷光的發(fā)現(xiàn)，此細(xì)菌金納米材料可當(dāng)作一指示劑，來(lái)追蹤與確認(rèn)傷口上細(xì)菌的存活，動(dòng)向與座落的位置。現(xiàn)今，由于隨著人類(lèi)大量濫用抗生素，使得越來(lái)越多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，然而抗生素的使用也有耗盡的一天，故非常需要即刻尋找一方便且有效的殺菌方式。借助此發(fā)現(xiàn)，可提供另一選擇方式，預(yù)期在未來(lái)可應(yīng)用于臨床上：可針對(duì)抗生素過(guò)敏的病患，于其具有細(xì)菌的外部傷口進(jìn)行金納米于細(xì)菌表面的產(chǎn)生，并照射非線性激光，經(jīng)顯微鏡觀察，可依照此材料所放出的冷光的強(qiáng)弱與位置得知細(xì)菌的存活與否，和所在的位置。附圖說(shuō)明圖1：本發(fā)明自組裝細(xì)菌金納米殼層的示意圖。圖2：本發(fā)明自組裝細(xì)菌金納米殼層的簡(jiǎn)單示意圖。圖3-a：為未包覆任何金納米殼層的大腸桿菌BL21菌株。圖3-b：為經(jīng)由含金離子的溶液與大腸桿菌BL21菌株混合后，已包覆金納米殼層的大腸桿菌BL21金納米材料。圖3-c：為利用高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描穿透電子顯微鏡對(duì)大腸桿菌BL21金納米材料的金元素做影像分析圖。圖3-d：為未包覆任何金納米殼層的枯草桿菌。圖3-e：為經(jīng)由含金離子的溶液與枯草桿菌混合后，已包覆金納米殼層的枯草桿菌金納米材料。圖3-f：為利用高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描穿透電子顯微鏡對(duì)枯草桿菌金納米材料的金元素做影像分析圖。圖3-g：為未包覆任何金納米殼層的抗藥性金黃色葡萄球菌。圖3-h：為經(jīng)由含金離子的溶液與抗藥性金黃色葡萄球菌混合后，已包覆金納米殼層的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米材料。圖3-i：為利用高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描穿透電子顯微鏡對(duì)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米材料金元素做影像分析圖。圖4-a：傅立葉轉(zhuǎn)換-紅外線光譜儀鑒定圖；大腸桿菌BL21原本表面的官能基信號(hào)為氫氧(O-H)結(jié)合碳氧(C-O)、碳碳氧(O-C=C)不對(duì)稱伸展和胺基酸的羧根(C(=O)2)對(duì)稱伸展；而金納米殼層于大腸桿菌BL21表面生成后，因S層表層的羧基與金離子(Au3+)經(jīng)配位作用，使得這些官能基信號(hào)都移動(dòng)至較小的波數(shù)。圖4-b：傅立葉轉(zhuǎn)換-紅外線光譜儀鑒定圖；枯草桿菌的信號(hào)為:碳碳氧(O-C=C)不對(duì)稱伸展、胺基酸的羧根(C(=O)2)對(duì)稱伸展；而金納米殼層于枯草桿菌表面生成后，因S層表層的羧基與金離子(Au3+)經(jīng)配位作用，使得這些官能基信號(hào)都移動(dòng)至較小的波數(shù)。圖4-c：傅立葉轉(zhuǎn)換-紅外線光譜儀鑒定圖；抗藥性金黃色葡萄球菌的信號(hào):碳碳氧(O-C=C)不對(duì)稱伸展、胺基酸的羧根(C(=O)2)對(duì)稱伸展；而金納米殼層于抗藥性金黃色葡萄球菌表面生成后，因S層表層的羧基與金離子(Au3+)經(jīng)配位作用，使得這些官能基信號(hào)都移動(dòng)至較小的波數(shù)。圖5-a1：X光繞射圖譜使用來(lái)做已包覆金納米殼層的大腸桿菌BL21金納米材料的鑒定圖。圖5-a2：元素分析使用來(lái)做已包覆金納米殼層的大腸桿菌BL21金納米材料的鑒定圖。圖5-b1：X光繞射圖譜使用來(lái)做已包覆金納米殼層的枯草桿菌金納米材料的鑒定圖。圖5-b2：元素分析使用來(lái)做已包覆金納米殼層的枯草桿菌金納米材料的鑒定圖。圖5-c1：X光繞射圖譜使用來(lái)做已包覆金納米殼層的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米材料的鑒定圖。圖5-c2：元素分析使用來(lái)做已包覆金納米殼層的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米材料的鑒定圖。圖6-a：金納米結(jié)合于細(xì)菌表面的百分比與效率測(cè)定圖。圖6-b：細(xì)菌金納米殼層的三倍頻信號(hào)，以大腸桿菌BL21金納米殼層形成數(shù)周之后來(lái)做偵測(cè)，細(xì)菌依然隨著時(shí)間的增加，細(xì)菌依舊具有活動(dòng)力(箭頭所指)。圖6-c：利用LIVE(西托9，SYTO9)/DEAD(碘化丙啶，propidiumiodide)套組工具，通過(guò)熒光顯微鏡偵測(cè)大腸桿菌BL21金納米殼層形成數(shù)周后的存活概況圖。圖6-d1：穿透式電子顯微鏡觀測(cè)大腸桿菌BL21金納米殼層形成數(shù)周之后，細(xì)菌依舊俱有分裂能力的圖。圖6-d2：穿透式電子顯微鏡觀測(cè)枯草桿菌金納米殼層形成數(shù)周之后，細(xì)菌依舊俱有分裂能力的圖。圖6-d3：穿透式電子顯微鏡觀測(cè)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層形成數(shù)周之后，細(xì)菌依舊俱有分裂能力的圖。圖7-a：隨著含金離子的溶液與大腸桿菌BL21金納米殼層混合培養(yǎng)時(shí)間增加，其紫外光/可見(jiàn)光光譜儀的信號(hào)圖。圖7-b：隨著含金離子的溶液與枯草桿菌金納米殼層混合培養(yǎng)時(shí)間增加，其紫外光/可見(jiàn)光光譜儀的信號(hào)圖。圖7-c：隨著含金離子的溶液與抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層混合培養(yǎng)時(shí)間增加，其紫外光/可見(jiàn)光光譜儀的信號(hào)圖。圖8-a：經(jīng)由連續(xù)式線性激光(紅外光激光)照射純水與大腸桿菌BL21金納米材料，溫度上升的情形圖。圖8-b：經(jīng)由連續(xù)式線性激光(紅外光激光)照射純水與枯草桿菌金納米材料，溫度上升的情形圖。圖8-c：經(jīng)由連續(xù)式線性激光(紅外光激光)照射純水與抗藥性金黃色葡萄球菌金納米材料，溫度上升的情形圖。圖9：利用非線性飛秒激光偵測(cè)的細(xì)菌金納米材料的雙光子吸收光譜。圖10-a1：尚未照射激光的大腸桿菌BL21金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-a2：尚未照射激光的枯草桿菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-b1：已照射線性激光的大腸桿菌BL21金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-b2：已照射線性激光的枯草桿菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-c1：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將大腸桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖10-c2：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將枯草桿菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖10-d1：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法(colonyformingunit，CFU)來(lái)計(jì)算線性激光照射后，大腸桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖10-d2：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法(colonyformingunit，CFU)來(lái)計(jì)算線性激光照射后，枯草桿菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖10-e1：照射非線性飛秒激光后的大腸桿菌BL21金納米殼層材料的影像。圖10-e2：照射非線性飛秒激光后的枯草桿菌金納米殼層材料的影像。圖10-f1：照射非線性飛秒激光后的大腸桿菌BL21金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-f2：照射非線性飛秒激光后的枯草桿菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖10-g1：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將大腸桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖10-g2：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將枯草桿菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖10-h1：使用高壓滅菌釜?dú)⑺来竽c桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖10-h2：使用高壓滅菌釜?dú)⑺揽莶輻U菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖10-i1：使用氨芐西林(ampicillin)殺死大腸桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖10-i2：使用氨芐西林(ampicillin)殺死枯草桿菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖10-j1：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法來(lái)計(jì)算非線性激光照射、高壓滅菌釜與氨芐西林處理后，大腸桿菌BL21金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖10-j2：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法來(lái)計(jì)算非線性激光照射、高壓滅菌釜與氨芐西林處理后，枯草桿菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖11-a1：?jiǎn)为?dú)的大腸桿菌BL21菌株照射非線性飛秒激光后的影像圖。圖11-a2：?jiǎn)为?dú)的枯草桿菌菌株照射非線性飛秒激光后的影像圖。圖11-b1：照射非線性飛秒激光后，大腸桿菌BL21金納米材料的影像圖。圖11-b2：照射非線性飛秒激光后，枯草桿菌金納米材料的影像圖。圖12-a1：?jiǎn)为?dú)的大腸桿菌BL21菌株照射線性激光后的影像圖。圖12-a2：?jiǎn)为?dú)的枯草桿菌菌株照射線性激光后的影像圖。圖12-b1：大腸桿菌BL21金納米材料照射線性激光后的影像圖。圖12-b2：枯草桿菌金納米材料照射線性激光后的影像圖。圖13-a1：尚未照射激光的無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-a2：尚未照射激光的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-b1：萬(wàn)古霉素(vancomycin)作用之后，LIVE(西托)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色并觀察無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的影像。圖13-b2：萬(wàn)古霉素(vancomycin)作用之后，LIVE(西托)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色并觀察抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的影像。圖13-c1：已照射線性激光的無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-c2：已照射線性激光的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-d1：利用LIVE(西托)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖13-d2：利用LIVE(西托)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖13-e1：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法(colonyformingunit，CFU)來(lái)計(jì)算線性激光照射后，無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖13-e2：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法(colonyformingunit，CFU)來(lái)計(jì)算線性激光照射后，抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖13-f1：照射非線性飛秒激光后，無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的影像。圖13-f2：照射非線性飛秒激光后，抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的影像。圖13-g1：照射非線性飛秒激光后的無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-g2：照射非線性飛秒激光后的抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具染色后的影像。圖13-h1：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖13-h2：利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌存活率數(shù)值化。圖13-i1：使用高壓滅菌釜?dú)⑺罒o(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖13-i2：使用高壓滅菌釜?dú)⑺揽顾幮越瘘S色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖13-j1：萬(wàn)古霉素殺死無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖13-j2：萬(wàn)古霉素殺死抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌后，并使用非線性激光偵測(cè)是否有冷光產(chǎn)生的影像。圖13-k1：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法來(lái)計(jì)算非線性激光照射、高壓滅菌釜與萬(wàn)古霉素處理后，無(wú)抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖13-k2：使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法來(lái)計(jì)算非線性激光照射、高壓滅菌釜與萬(wàn)古霉素處理后，抗藥性金黃色葡萄球菌金納米殼層材料的細(xì)菌的存活率。圖14-a1：?jiǎn)为?dú)的無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光70毫瓦后的影像圖。圖14-a2：?jiǎn)为?dú)的無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光80毫瓦后的影像圖。圖14-a3：?jiǎn)为?dú)的無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光90毫瓦后的影像圖。圖14-b1：照線非線性飛秒激光70毫瓦后，無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖14-b2：照射非線性飛秒激光80毫瓦后，無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖14-b3：照射非線性飛秒激光90毫瓦后，無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖15-a1：?jiǎn)为?dú)的抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光70毫瓦后的影像圖。圖15-a2：?jiǎn)为?dú)的抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光80毫瓦后的影像圖。圖15-a3：?jiǎn)为?dú)的抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株照射線性激光90毫瓦后的影像圖。圖15-b1：照線性非線性飛秒激光70毫瓦后，抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖15-b2：照線性非線性飛秒激光80毫瓦后，抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖15-b3：照線性非線性飛秒激光90毫瓦后，抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料的影像圖。圖16-a：大腸桿菌BL21金納米殼層材料照射非線性飛秒激光后的雙光子冷光光譜圖。圖16-b：枯草桿菌金納米殼層材料照射非線性飛秒激光后的雙光子冷光光譜圖。圖16-c：抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米殼層材料照射非線性飛秒激光后的雙光子冷光光譜圖。具體實(shí)施方式有關(guān)本發(fā)明所采用的技術(shù)、手段及其功效，以下列舉較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明于后，相信本發(fā)明上述的目的、構(gòu)造及特征，當(dāng)可由的得一深入而具體的了解。本發(fā)明設(shè)計(jì)的利用細(xì)菌包覆金納米殼層的納米材料借助激光產(chǎn)生光熱分解與冷光來(lái)殺死與追蹤細(xì)菌的方法，在此，本發(fā)明是選用了大腸桿菌BL21菌株、枯草桿菌與抗藥性金黃色葡萄球菌作為生物模板。本發(fā)明使用含金離子的溶液分別與這三種細(xì)菌混合培養(yǎng)，由于細(xì)菌表面有一層由糖蛋白(glycoproteins)組成的S層，且S層上糖蛋白的羧基和肽鏈上胺基酸殘基的離子化羧基當(dāng)作與金離子作用處，利用糖蛋白部分的水解產(chǎn)物如還原糖的半縮醛羥基或游離態(tài)的醛基當(dāng)作電子供應(yīng)者，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)后，將四氯化金離子還原成金納米粒子沉積在細(xì)菌的表面，形成一細(xì)菌包覆金納米殼層的納米材料(bacteriacoatedwithAunanoshells)(如圖1、圖2)。本發(fā)明使用了許多的鑒定方式來(lái)觀察此材料=>(1)由穿透式電子顯微鏡鑒定可知：圖3-a、圖3-b與圖3-g為未包覆任何金納米殼層的細(xì)菌形態(tài)(依序?yàn)榇竽c桿菌BL21菌株、枯草桿菌與抗藥性金黃色葡萄球菌)；圖3-d、圖3-e與圖3-h為已包覆了金納米殼層的細(xì)菌形態(tài)(所產(chǎn)生的金納米粒子直徑小于7納米);(2)我們同時(shí)也使用了傅立葉轉(zhuǎn)換-紅外線光譜儀來(lái)鑒定:如大腸桿菌BL21原本表面的官能基信號(hào)為氫氧(O-H)結(jié)合碳氧(C-O)、碳碳氧(O-C=C)不對(duì)稱伸展和胺基酸的羧根(C(=O)2)對(duì)稱伸展。但金納米殼層于細(xì)菌表面生成后，因S層表層的羧基與金離子經(jīng)配位作用，使得這些官能基信號(hào)都移動(dòng)至較小的波數(shù)(即較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，為紅位移)，相同的結(jié)果也在枯草桿菌與抗藥性金黃色葡萄球菌發(fā)現(xiàn)(如圖4-a、4-b、4-c)；(3)X光繞射與元素分析被使用來(lái)做此材料的鑒定(如圖5-a1、5-a2、5-b1、5-b2、5-c1、5-c2)；(4)利用高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描穿透電子顯微鏡對(duì)金元素做影像分析：圖3-c、圖3-f與圖3-i依序?yàn)榇竽c桿菌BL21菌株、枯草桿菌與抗藥性金黃色葡萄球菌的暗場(chǎng)金元素影像圖；以上數(shù)種方式鑒定可知金納米殼層已成功的自組裝形成于細(xì)菌表面的S層。圖6-a為隨著含金離子的溶液分別與這三種細(xì)菌混合培養(yǎng)時(shí)間增加，而金納米結(jié)合于細(xì)菌表面的百分比與效率測(cè)定圖，經(jīng)混合后，部分金納米粒子已經(jīng)結(jié)合于細(xì)菌表面；隨著時(shí)間增加，結(jié)合比率增加更多；同時(shí)，隨著細(xì)菌與金成長(zhǎng)液混合時(shí)間的增加，會(huì)產(chǎn)生不同狀態(tài)或金殼層厚度的細(xì)菌金納米材料，再分別測(cè)其紫外光/可見(jiàn)光光譜，發(fā)現(xiàn)其特性吸收峰的強(qiáng)度會(huì)因金納米粒子的尺寸、形狀和聚集程度而有所不同，在此，觀察其表面電漿共振的波長(zhǎng)范圍由可見(jiàn)光至近紅外光區(qū)，最主要是來(lái)自于金納米產(chǎn)生后形成聚集、最后變成聚集狀態(tài)的金殼層的貢獻(xiàn)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，吸收強(qiáng)度也隨的增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，于細(xì)菌表面由金納米粒子形成致密的金納米殼層，故于近紅外光區(qū)同時(shí)也有扁長(zhǎng)且寬的吸收產(chǎn)生，隨著混合的時(shí)間增加吸收值也會(huì)跟著增加(如圖7-a、7-b、7-c)。圖6-b為使用反射式的光學(xué)倍頻(harmonicgeneration)顯微鏡擷取倍頻影像，此為一非侵入式的非線性影像技術(shù)，在此，利用所得的金殼層的細(xì)菌繼續(xù)于金成長(zhǎng)液中混合數(shù)周后，利用三倍頻信號(hào)來(lái)觀察細(xì)菌的形態(tài)?？砂l(fā)現(xiàn)隨著觀察時(shí)間增加，細(xì)菌依舊具有活動(dòng)力，能在無(wú)機(jī)環(huán)境下繼續(xù)存活(如圖6-b)。圖6-c為利用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具，通過(guò)熒光顯微鏡偵測(cè)大腸桿菌BL21金納米殼層形成數(shù)周后，大部分已包覆了金納米殼層的細(xì)菌依舊保有生命力。再借助穿透式電子顯微鏡觀測(cè)大腸桿菌BL21金納米殼層形成數(shù)周之后，細(xì)菌依舊具有分裂的能力(如圖6-d1、6-d2、6-d3)。這些結(jié)果顯示，在不加入任何還原劑的環(huán)境下，確實(shí)能夠通過(guò)自然氧化還原力于細(xì)菌表面S層產(chǎn)生金納米殼層，并且于長(zhǎng)時(shí)間下，細(xì)菌依然保有應(yīng)有的生命力與生理功能。由于金有非常好的光熱轉(zhuǎn)換效率，在此先利用連續(xù)性線性的激光(紅外光激光)來(lái)做此實(shí)驗(yàn)，通過(guò)升溫效率的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試(如圖8-a、8-b、8-c)：經(jīng)由激光照射細(xì)菌金納米材料，溫度上升的情形。結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的細(xì)菌金納米材料有極好的升溫效果，故在初步實(shí)驗(yàn)可知此材料經(jīng)激光照射后確實(shí)具有升溫效果，且適合當(dāng)一光熱治療劑。另一方面，也想了解利用非線性激光照射此細(xì)菌金納米材料是否也會(huì)有相同的加熱殺菌效果。首先，先測(cè)定雙光子照射后此材料的吸收狀況(如圖9)。經(jīng)由上述實(shí)驗(yàn)確認(rèn)后，準(zhǔn)備開(kāi)始做線性與非線性激光照射此材料的實(shí)驗(yàn)。首先，先使用連續(xù)性線性的激光(紅外光激光)照射此細(xì)菌金納米材料，再使用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具，通過(guò)熒光顯微鏡偵測(cè)細(xì)菌的存活率(如圖10-a1、10-a2、10-b1、10-b2)；為了方便了解光熱殺菌效率，利用軟件將存活率數(shù)值化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL21與枯草桿菌金納米材料存活率皆降到非常低(如圖10-c1、10-c2)，為了重復(fù)確認(rèn)存活率，另使用CFU細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，也得到相同的結(jié)果，即細(xì)菌的存活率也皆降到非常低(如圖10-d1、10-d2)。另一方面，開(kāi)始使用非線性飛秒激光照射，此細(xì)菌金納米材料來(lái)了解細(xì)菌的存活率，驚訝地發(fā)現(xiàn)隨著照射時(shí)間的增加，產(chǎn)生的冷光也隨的增強(qiáng)(如圖10-e1、10-e2與圖11-a1、11-a2、11-b1、11-b2)。相反的，即便使用線性激光對(duì)此菌納米材料照射，卻是無(wú)法產(chǎn)生冷光(如圖12-a1、12-a2、12-b1、12-b2)。然而，也再次使用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將照射完非線性激光的細(xì)菌存活率數(shù)值化(圖10-f1、10-f2與圖10-g1、10-g2)，結(jié)果顯示存活率也降到非常低。由此，可知此令人振奮的結(jié)果，隨著非線性激光照射細(xì)菌金納米材料時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的冷光也越強(qiáng)，而死掉的細(xì)菌量也越多。為了做比較，也使用了高壓滅菌釜與氨芐西林等兩種不同的作用方式使細(xì)菌死亡，再利用相同參數(shù)的非線性激光來(lái)觀測(cè)，皆無(wú)法觀測(cè)到產(chǎn)生的冷光(如圖10-h1、10-h2與圖10-i1、10-i2)。由目前結(jié)果可知，可使用短時(shí)間照射的非線性飛秒激光即可殺死幾乎所有的細(xì)菌(如圖10-g1、10-g2與圖圖10-j1、10-j2)，相較于高壓滅菌釜與氨芐西林等兩種殺菌方式，無(wú)論是革蘭氏陰性菌(大腸桿菌BL21)與格蘭氏陽(yáng)性菌(枯草桿菌)，或線性與非線性激光照射，本發(fā)明的方法提供了一非常有效率的殺菌方式；除此的外，隨著非線性激光照射細(xì)菌金納米材料時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的冷光也越強(qiáng)，而死掉的細(xì)菌量也越多，為令人意外與驚喜的另一發(fā)現(xiàn)?？股厥悄壳白顝V泛用來(lái)殺死細(xì)菌的藥物，不同抗生素可對(duì)不同的細(xì)菌有殺菌作用，盤(pán)尼西林是人類(lèi)最早用來(lái)對(duì)抗細(xì)菌感染的抗生素，但使用不久后就發(fā)現(xiàn)有些金黃色葡萄球菌可制造一種盤(pán)尼西林酵素(penicillinase)來(lái)破壞盤(pán)尼西林，因而對(duì)盤(pán)尼西林產(chǎn)生抗藥性。之后，科學(xué)家合成出一種不會(huì)被盤(pán)尼西林酵素(penicllinase)破壞的抗生素二甲氧基苯青霉素(methicillin)，可用來(lái)殺死金黃色葡萄球菌(不論它是否會(huì)制造盤(pán)尼西林酵素penicillinase)；金黃色葡萄球菌是一種革蘭式陽(yáng)性球菌，普遍存在于自然環(huán)境中與人體上的某些部位他是造成人類(lèi)感染的一種常見(jiàn)且重要的細(xì)菌，可引起人體許多部位的感染，包括皮膚傷口的感染、骨關(guān)節(jié)的感染、甚至深部組織的感染。之后，這一類(lèi)藥物就成為治療金黃色葡萄球菌感染最重要的抗生素。然而，近20年來(lái)卻也有愈來(lái)愈多的內(nèi)酰胺也殺不死的抗二甲氧基苯青霉素的金黃素葡萄球菌，稱抗藥性金黃色葡萄球菌。依據(jù)國(guó)內(nèi)臨床報(bào)告，由金黃色葡萄球菌所分離出的抗藥性金黃色葡萄球菌的比例高達(dá)50%至80%，因此臨床上在處理金黃色葡萄球菌感染的病人時(shí)，大部分就是在處理抗藥性金黃色葡萄球菌感染的問(wèn)題。此外，相關(guān)研究指出，抗藥性金黃色葡萄球菌細(xì)菌不只對(duì)盤(pán)尼西林與內(nèi)酰胺等抗生素具有抗藥性，它同時(shí)也對(duì)許多其它類(lèi)的抗生素具有抗藥性，也就是所謂的多重抗藥性細(xì)菌(multidrug-resistantbacteria)。也因如此，在治療此類(lèi)受感染病人時(shí)能使用的抗生素種類(lèi)非常有限，甚至只有萬(wàn)古霉素可使用?？顾幮越瘘S色葡萄球菌的傳播一般是經(jīng)由接觸傳播，特別是人類(lèi)的彼此接觸，其中以手的接觸是傳播中最重要的途徑；如醫(yī)院內(nèi)，經(jīng)由醫(yī)院工作人員的雙手接觸病人，很容易將抗藥性金黃色葡萄球菌由此途徑傳染給其它病人。因此如何防止抗藥性金黃色葡萄球菌傳播，或甚至殺死抗藥性金黃色葡萄球菌是目前最重要且最迫切被解決的議題。在此，欲利用此細(xì)菌納米材料的方法來(lái)殺死抗藥性的金黃色葡萄球菌。因此選用了無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌與抗藥性的金黃色葡萄球菌來(lái)研究。先使用連續(xù)性線性的激光(紅外光激光)照射此細(xì)菌金納米材料，再使用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具，通過(guò)熒光顯微鏡偵測(cè)細(xì)菌的存活率，尚未照射激光的材料，細(xì)菌皆處于活著狀態(tài)(如圖13-a1、13-a2)，為了確認(rèn)抗藥性的金黃色葡萄球菌具抗藥性，我們使用了的萬(wàn)古霉素添加于此兩種細(xì)菌金納米材料，發(fā)現(xiàn)大部分的無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)死亡狀態(tài)，而抗藥性的金黃色葡萄球菌只有部分死亡(如圖13-b1、13-b2)；再照射激光后并利用軟件將存活率數(shù)值化(如圖13-c1、13-c2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌與抗藥性的金黃色葡萄球菌金納米材料存活率皆降到非常低(如圖13-d1、13-d2)；另使用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，也得到相同的結(jié)果(如圖13-e1、13-e2)。另一方面，開(kāi)始使用非線性飛秒激光照射，此細(xì)菌金納米材料來(lái)了解細(xì)菌的存活率，此兩株細(xì)菌金納米材料也呈現(xiàn)隨著照射時(shí)間的增加，產(chǎn)生的冷光也隨的增強(qiáng)(如圖13-f1、13-f2、圖14-a1、14-a2、14-a3、14-b1、14-b2、14-b3與圖15-a1、15-a2、15-a3、15-b1、15-b2、15-b3)。而再使用LIVE(西托9)/DEAD(碘化丙啶)套組工具將照射完非線性激光的細(xì)菌存活率數(shù)值化(如圖圖13-g1、13-g2與圖13-h1、13-h2)，結(jié)果顯示存活率也降至非常低。另外，相同的結(jié)果顯示，隨著非線性激光照射細(xì)菌金納米材料時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的冷光也越強(qiáng)，而死掉的細(xì)菌量也越多。而高壓滅菌釜與萬(wàn)古霉素等兩種不同的作用方式使細(xì)菌死亡，再利用相同參數(shù)的非線性激光來(lái)觀測(cè)，皆無(wú)法觀測(cè)到產(chǎn)生的冷光(如圖13-i1、13-i2與圖13-j1、13-j2)。由目前結(jié)果可知，可使用短時(shí)間照射的非線性飛秒激光即可殺死幾乎所有的細(xì)菌(如圖13-h1、13-h2與圖13-k1、13-k2)，相較于高壓滅菌釜與抗生素等兩種殺菌方式，無(wú)論是是否為抗藥性金黃色葡萄球菌，或線性與非線性激光照射，本發(fā)明的方法提供了一非常有效率的殺菌方式；除此的外，隨著非線性激光照射細(xì)菌金納米材料時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的冷光也越強(qiáng)，而死掉的細(xì)菌量也越多，在金黃色葡萄球菌上也是行的通的。由于發(fā)現(xiàn)冷光的產(chǎn)生，也針對(duì)此細(xì)菌金納米材料來(lái)偵測(cè)此冷光的雙光子光譜，藍(lán)色曲線表示照射完非線性激光后細(xì)菌金納米材料的光譜；紅色曲線表示未包覆金納米殼層的細(xì)菌照射完非線性激光后的光譜(如圖16-a、16-b、16-c)。結(jié)果顯示，只需給予足量的非線性激光能量，即會(huì)產(chǎn)生冷光，可了解此材料本身具有產(chǎn)生冷光的光學(xué)特質(zhì)。結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，再繼續(xù)給予能量即可產(chǎn)生更強(qiáng)的冷光并使殺死更多的細(xì)菌。由于未來(lái)欲借助此細(xì)菌金納米材料應(yīng)用于臨床上，故在此也做了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在小鼠耳朵內(nèi)皮上造成一個(gè)小傷口，并于傷口上分別接種無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌與抗藥性的金黃色葡萄球菌后，在于傷口上持續(xù)加入含金離子的溶液培養(yǎng)，借助此方式可在傷口上自組裝產(chǎn)生細(xì)菌金納米殼層材料，接著并照射非線性激光，可發(fā)現(xiàn)隨著照射時(shí)間的增加，冷光產(chǎn)生的強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)，由此可證明無(wú)論無(wú)抗藥性的金黃色葡萄球菌與抗藥性的金黃色葡萄球菌，確實(shí)可使用此法于傷口上產(chǎn)生細(xì)菌金納米殼層材料，并經(jīng)由激光的照射產(chǎn)生冷光，且使細(xì)菌死亡。隨著細(xì)菌逐漸對(duì)抗生素產(chǎn)生多重抗藥性的情形下(如超級(jí)細(xì)菌)，在未來(lái)抗生素必定不是唯一臨床的殺菌方式，故本發(fā)明另一有效率且新穎的殺菌方法是非常急迫與必要的，期望在未來(lái)可將此發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)上。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，故舉凡運(yùn)用本發(fā)明專利精神所作的任何修飾或變更等，皆仍應(yīng)同理包括于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。