五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。通過給予過量石膽酸造成小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型，或膽管結(jié)扎造成小鼠肝外膽汁淤積模型，分別協(xié)同給予五味子醇乙后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現(xiàn)為小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量也顯著降低，以及尿液排出總膽汁酸及總膽紅素含量上升。結(jié)果表明，五味子醇乙能夠預防治療石膽酸和膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損傷。證實了上述作用的機制可能涉及調(diào)控CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介導的膽汁酸代謝及外排。
【專利說明】五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應 用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域。更具體地，涉及五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性 肝病藥物中的應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 膽汁淤積（cholestasis)，是由膽汁生成障礙或/和膽汁排泌障礙使肝細胞排泌 的膽汁成分反流入血中產(chǎn)生潴留所致的一組疾病共同的臨床癥狀，并最終可能發(fā)展成為 致命性的肝疾病，例如原發(fā)性膽汁性肝硬化和硬化性膽管炎等。若血液中僅膽汁酸增高 而膽紅素正常，稱為膽汁淤積或淤膽，若血中膽汁酸和膽紅素均增高則稱為膽汁淤積性黃 疸。根據(jù)膽汁淤積發(fā)生部位不同，通常以肝門為界限分為肝內(nèi)膽汁淤積（Intrahepatic cholestasis)和肝外膽汁游積（Extrahepatic cholestasis)兩大類。
[0003] 肝內(nèi)膽汁淤積是肝細胞排泌膽汁障礙，然而并無膽道阻塞以致肝細胞內(nèi)膽汁淤滯 和血中膽汁成分增多。石膽酸（LCA)是一種毒性較強的疏水性次級膽汁酸，是由膽固醇轉(zhuǎn) 化而來。在慢性膽汁淤積性疾病患者的血中可檢測到LCA水平的顯著增加，并且研究發(fā)現(xiàn) 在患者體循環(huán)中累積的LCA被認為能導致肝損害。如果在小鼠體內(nèi)加入外源性石膽酸，就 會反饋性抑制膽汁酸的釋放，從而造成肝內(nèi)膽汁淤積、膽管部分梗阻以及膽管炎。因此，LCA 作為一種肝內(nèi)膽汁淤積的造模藥物廣泛用于膽汁淤積治療藥物的研發(fā)中。目前對于此類疾 病的治療并沒有特別有效的方法。
[0004] 肝外膽汁淤積是指肝細胞排泄膽汁功能障礙、膽汁分泌的抑制或膽汁流障礙(如 膽管通道梗阻)，致使膽汁到達十二指腸的量減少。膽管結(jié)扎術(shù)（Bile duct ligation，BDL) 是目前最為廣泛應用的肝外膽汁淤積的造模方法。手術(shù)將總膽管雙側(cè)結(jié)扎并在中間剪斷， 阻斷膽汁往十二指腸方向的流出，淤積在膽管和膽囊中，從而導致肝細胞外的膽汁淤積。該 造模方法長期作用后亦可造成膽汁淤積性肝纖維化。目前亦無針此類疾病的有效治療方 法。
[0005] 另外，世界上唯一上市的能夠緩解膽汁淤積癥狀的藥物是熊去氧膽酸（UDCA)，但 該藥物并不能最終提高膽汁淤積性肝病患者的生存率，因此臨床上亟需尋找其它能夠預防 或治療膽汁淤積性肝病的藥物。
[0006] 五味子醇乙是中藥五味子中的有效成分之一。五味子提取物被報道具有顯著的肝 保護作用，能夠用于多種肝毒性藥物如四氯化碳、對乙酰氨基酚等化學毒物所致肝損傷的 保護與治療。目前對于五味子醇乙的研究顯示，其具有以下作用和用途：（1)抗肝毒，減少 過量的SGPT ; (2)防止CC14或硫代乙酰胺所致的中毒；（3)促進饑餓小鼠肝臟糖原的生物 合成。然而五味子醇乙能否預防和治療膽汁淤積尚未有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有膽汁淤積預防和治療藥物的局限，旨在通過 動物實驗揭示五味子醇乙能否預防和治療LCA和BDL所誘導的小鼠膽汁淤積性肝病，探討 其內(nèi)在機制，并提供五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應 用。
[0009] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 本發(fā)明公開了五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。 還提供了一種用于預防和治療膽汁淤積性肝病的藥物組合物，該藥物組合物包含有五 味子醇乙，以五味子醇乙為主要活性成分。
[0010] 上述藥物組合物在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用也在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
[0011] 優(yōu)選地，上述的膽汁淤積性肝病是指肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷或肝外膽汁淤積性肝 損傷。
[0012] 更優(yōu)選地，上述膽汁淤積性肝病是指石膽酸或膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損 傷。
[0013] 同時，上述的預防和治療膽汁淤積性肝病是指降低肝外膽汁淤積肝病模型血清中 ALT、AST和ALP的活性，減輕肝組織壞死程度，降低血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量；或 是指降低肝外膽汁淤積模型血清中ALT、AST的活性，減輕肝組織壞死程度，降低血清中的 總膽汁酸與總膽紅素含量，以及增加尿液排出總膽汁酸及總膽紅素含量。
[0014] 另外，本發(fā)明還提供五味子醇乙在制備67/^2477基因表達促進劑中的應用，五味 子醇乙在制備如基因表達促進劑中的應用，以及五味子醇乙在制備基因表達 促進劑中的應用。以五味子醇乙為主要活性物質(zhì)的基因表達促進劑能夠顯著上調(diào)^7/^477、 如77W、基因的表達，從而調(diào)控CYP3A11、UGT1A1、0ATP1A4介導的膽汁酸代謝及外 排，達到預防和治療膽汁淤積性肝病的目的。
[0015] 本發(fā)明首先通過給予過量石膽酸造成小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型，協(xié)同給予五味子醇 乙（12. 5?200 mg/kg)后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現(xiàn)為小鼠血清中 ALT、AST和ALP的活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽 紅素含量也顯著降低。結(jié)果表明五味子醇乙能夠預防治療石膽酸所誘導的膽汁淤積性肝損 傷。
[0016] 另外，本發(fā)明還通過膽管結(jié)扎造成小鼠肝外膽汁淤積模型，協(xié)同給予五味子醇乙 (200 mg/kg)后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現(xiàn)為小鼠血清中ALT、AST的 活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量降低，以 及尿液排出總膽汁酸及總膽紅素含量上升。結(jié)果提示五味子醇乙能夠預防治療石膽酸及膽 管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝病。
[0017] 綜上所述，五味子醇乙能夠預防治療石膽酸和膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損 傷。同時，辦本發(fā)明還對該作用的機制進行了研究，通過肝臟基因與蛋白表達分析證實了 五味子醇乙能夠顯著上調(diào)67/^477、基因的表達，表明了五味子醇乙預防 治療石膽酸和膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損傷的機制可能涉及調(diào)控CYP3A1UUGT1A1、 0ATP1A4介導的膽汁酸代謝及外排。
[0018] 因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，可以將五味子醇乙用于制備臨床上預防或治療膽汁淤 積性肝病的藥物。
[0019] 另外，五味子醇乙還可以應用于67/^477、W7J7、6M7P7私基因介導調(diào)控的其 他疾病的預防和治療，如膽固醇結(jié)石、高脂蛋白血癥等。五味子醇乙可以促進cr/^477、 如7^7、基因的表達，參與調(diào)控膽汁酸代謝及外排，而膽汁酸代謝與膽固醇結(jié)石、 或高脂蛋白血癥的形成有密切關系。膽汁酸代謝可從下述幾方面影響體內(nèi)膽固醇的平衡： (1)膽汁酸的生物合成是內(nèi)源性膽固醇的主要代謝去路，膽汁酸的生物合成又主要是通過 其本身的反饋作用進行調(diào)控的；（2)肝細胞通過膽汁排泄膽固醇，主要依靠膽汁酸的乳化 及形成混合微團的作用，因而膽汁酸合成、分泌的質(zhì)和量都對膽固醇的排泄有影響；（3)膽 汁酸在食物膽固醇的吸收過程中起協(xié)助作用，吸收的膽固醇直接調(diào)控腸壁細胞及肝細胞內(nèi) 膽固醇的合成；因此，高脂蛋白血癥時的代謝紊亂必然涉及膽汁酸的代謝異常。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明克服了現(xiàn)有膽汁淤積預防和治療藥物的局限，提供五味子醇乙及以其為主要活 性成分的藥物在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。發(fā)現(xiàn)了五味子醇乙能夠預 防治療石膽酸或膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損傷。
[0021] 首先通過給予過量石膽酸造成小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型，協(xié)同給予五味子醇乙 (12. 5?200 mg/kg)后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現(xiàn)為小鼠血清中 ALT、AST和ALP的活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽 紅素含量也顯著降低。結(jié)果表明五味子醇乙能夠預防治療石膽酸所誘導的膽汁淤積性肝損 傷。另外，本發(fā)明還通過膽管結(jié)扎造成小鼠肝外膽汁淤積模型，協(xié)同給予五味子醇乙（200 mg/kg)后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現(xiàn)為小鼠血清中ALT、AST的活性 顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量降低，以及尿 液排出總膽汁酸及總膽紅素含量上升。結(jié)果提示五味子醇乙能夠預防治療石膽酸及膽管結(jié) 扎所誘導的膽汁淤積性肝病。
[0022] 同時，辦本發(fā)明還對該作用的機制進行了研究，通過肝臟基因與蛋白表達分析證 實了五味子醇乙能夠顯著上調(diào)基因的表達，表明了五味子醇乙 預防治療石膽酸和膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損傷的機制可能涉及調(diào)控CYP3A11、 UGT1A1、0ATP1A4介導的膽汁酸代謝及外排。
[0023] 因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，可以將五味子醇乙用于臨床上膽汁淤積性肝病的預防 或治療，且療效好、無毒副作用，同時五味子醇乙成本低，易獲得，具有很好的推廣應用價 值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為五味子醇乙減輕石膽酸所致肝壞死程度結(jié)果圖。
[0025] 圖2為五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血清ALT指標的升高結(jié)果圖。
[0026] 圖3為五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血清AST指標的升高結(jié)果圖。
[0027] 圖4為五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血清ALP指標的升高結(jié)果圖。
[0028] 圖5為五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血中總膽汁酸升高結(jié)果圖。
[0029] 圖6為五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血中總膽紅素升高結(jié)果圖。
[0030] 圖7為五味子醇乙在石膽酸模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因表達 影響結(jié)果圖。
[0031] 圖8為五味子醇乙在石膽酸模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因表達 影響結(jié)果圖。
[0032] 圖9為五味子醇乙在石膽酸模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因表達 影響結(jié)果圖。
[0033] 圖10為五味子醇乙在石膽酸模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關蛋白表達影響結(jié) 果圖。
[0034] 圖11為五味子醇乙在石膽酸模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關蛋白表達定量統(tǒng) 計結(jié)果。
[0035] 圖12為五味子醇乙減輕膽管結(jié)扎所致肝壞死程度結(jié)果圖。
[0036] 圖13為五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清ALT指標的升高結(jié)果圖。
[0037] 圖14為五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清AST指標的升高結(jié)果圖。
[0038] 圖15為五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清ALP指標的升高結(jié)果圖。
[0039] 圖16為五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清中總膽汁酸升高結(jié)果圖。
[0040] 圖17為五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清中總膽紅素升高結(jié)果圖。
[0041] 圖18為五味子醇乙增加膽管結(jié)扎所致小鼠尿液中總膽汁酸排出量結(jié)果圖。
[0042] 圖19為五味子醇乙增加膽管結(jié)扎所致小鼠尿液中總膽紅素排出量結(jié)果圖。
[0043] 圖20為五味子醇乙在膽管結(jié)扎模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因6：沙為77 的表達影響結(jié)果圖。
[0044] 圖21為五味子醇乙在膽管結(jié)扎模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因設^^的 表達影響結(jié)果圖。
[0045] 圖22為五味子醇乙在膽管結(jié)扎模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關基因 的表達影響結(jié)果圖。
[0046] 圖23為五味子醇乙在膽管結(jié)扎模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關蛋白表達影響 結(jié)果。
[0047] 圖24為五味子醇乙在膽管結(jié)扎模型中對小鼠膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關蛋白表達定量 統(tǒng)計結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0048] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本【技術(shù)領域】常規(guī)試 齊IJ、方法和設備。
[0049] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0050] 實施例1過量石膽酸造成的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型的治療 1、材料與方法 (1)主要儀器： 5417-R低溫高速離心機(德國Eppendorf公司）；全波長酶標儀(美國Thermo公司）； Mini_protein3 電泳系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；ImageQuant LAS 4000曝光成像儀（美國General Electric公司）；梯度PCR儀（德 國 Eppendorf 公司）；7500 Real Time PCR System (美國 Applied Biosystems 公司）。
[0051] (2)藥品和試劑 五味子醇乙（純度> 98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；石膽酸(純度> 98%，上海 阿拉丁試劑有限公司），羧甲基纖維素鈉（CMC，純度彡98%，美國Sigma公司）；玉米油（藥用 級，上海阿拉丁試劑有限公司）；孕烷烯酮16-腈（PCN，純度彡98%，美國Sigma公司）；熊去 氧膽酸（UDCA，藥用級，上海阿拉丁試劑有限公司）；ALT、AST、ALP、總膽汁酸、總膽紅素檢測 試劑盒(南京建成生物工程研究所）；Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、RT-qPCR試劑盒(大連 Takara公司）；引物（上海Invitrogen公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，美國Millipore公 司）；CYP3A11 -抗(美國 Santa cruz 公司）；UGT1A1 -抗(美國 Abeam 公司）；GAPDH-抗(上 海生工生物工程有限公司）；RIPA裂解液(上海博彩生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定 試劑盒(美國Thermo公司）；ECL發(fā)光液(北京英格恩生物科技公司）；其它試劑均為分析純 級別。
[0052] 2、實驗動物及給藥方案 C57BL/6小鼠，雄性，周齡8?9周，由中山大學(廣州市大學城)實驗動物中心提供，許 可證號為SCXK (粵）2011-0029,正常小鼠用維持飼料喂養(yǎng)。
[0053] 五味子醇乙（12. 5,25,100 mg/kg)超聲分散于預高壓滅菌的0· 5%(w/w) CMC ;石膽 酸（125 mg/kg)與 PCN (50 mg/kg)溶于玉米油。
[0054] 小鼠隨機分成7組，每組6?12只，組別為空白對照組、高劑量五味子醇乙組、石 膽酸造模組、石膽酸+低劑量五味子醇乙組、石膽酸+中劑量五味子醇乙組、石膽酸+高劑 量五味子醇乙組以及石膽酸+PCN組。
[0055] 五味子醇乙給藥方式為灌胃，連續(xù)給藥7天，第天兩次。石膽酸和PCN的給藥方式 均為腹腔注射，其中PCN連續(xù)給藥7天，每天一次，而石膽酸在第四天開始協(xié)同給藥，共給藥 4天，每天兩次。
[0056] 最后一次給藥后24h處理解剖小鼠，解剖后對在體(在體是指在腹腔內(nèi)未分離出 來的）的肝臟及膽囊的形態(tài)進行拍照，然后收集血清以及肝臟，每組取三只小鼠部分肝臟置 于10%(v/v)甲醛中固定，其它樣本在-80°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0057] 3、肝組織與血清化學檢測 肝組織切片與H&E染色由中山大學實驗動物中心病理切片室完成，血清中的ALT、AST、 ALP、總膽汁酸、總膽紅素檢測方法按照試劑盒的說明書來完成。
[0058] 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計 各組實驗數(shù)據(jù)均以mean土S. E. M.表示，采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析， 采用unpaired Student's t test進行兩組間比較，P〈 0.05被認為有顯著性差異。其中 *表示與非造?？瞻讓φ战M比較P〈〇. 05, #表示與空白對照組比較P〈0. 01，μ表示與空白 對照組比較Ρ〈〇. 001，#表示與造?？瞻讓φ战M比較Ρ〈〇. 05, ##表示與造模空白對照組比較 Ρ〈0. 01，###表示與造?？瞻讓φ战M比較Ρ〈0. 001。
[0059] 5、實驗結(jié)果 (1)五味子醇乙減輕石膽酸所致肝壞死程度 如附圖1Α所示，與空白對照組相比，石膽酸造模組小鼠的肝臟解剖可見明顯的肝壞死 病理改變，表現(xiàn)為肝包膜下出現(xiàn)無數(shù)明顯的白色的壞死病灶點，同時膽囊呈現(xiàn)異常的擴張。 協(xié)同給予200 mg/kg五味子醇乙或者50 mg/kg PCN組小鼠肝包膜下的壞死病灶點數(shù)目明 顯減少，肝臟形態(tài)趨于正常，而且膽囊恢復至正常形態(tài)。
[0060] 如附圖1B的H&E染色結(jié)果所示，與空白對照組相比，石膽酸造模組小鼠出現(xiàn)大面 積的肝細胞壞死，協(xié)同給予200 mg/kg五味子醇乙或者50 mg/kg PCN組小鼠無顯著的肝細 胞壞死。附圖1A和1B表明了五味子醇乙能顯著減輕石膽酸所致肝壞死的程度。
[0061] (2)五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血清ALT、AST和ALP的升高 如附圖2、附圖3和附圖4所示，與空白對照組相比，石膽酸造模組小鼠的ALT、AST和 ALP水平分別上升至5572 U/L、6548 U/L和666 U/L，表明了石膽酸能夠造成嚴重的肝損傷 以及膽管損傷。
[0062] 分別協(xié)同給予12. 5、50、200 mg/kg的五味子醇乙能劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)石膽酸誘導 的ALT、AST和ALP水平上調(diào)，其中ALT水平分別降至石膽酸造模組的40%、18%和1% ;AST 水平降至石膽酸造模組的39%、22%和3% ;ALP水平降至石膽酸造模組的44%，31%和16%。 該結(jié)果表明了五味子醇乙能劑量依賴性的保護石膽酸所致小鼠的肝損傷和膽管損傷。
[0063] (3)五味子醇乙劑量依賴性逆轉(zhuǎn)石膽酸所致小鼠血中總膽汁酸和總膽紅素水平的 升高 如附圖5和附圖6所示，與空白對照組相比，石膽酸造模組的小鼠血中總膽汁酸和總膽 紅素水平上升至18. 3倍和15. 4倍，表明了石膽酸能導致嚴重的膽汁淤積。分別協(xié)同給予 12. 5、50、200 mg/kg的五味子醇乙能劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)石膽酸誘導的血中總膽汁酸和總膽 紅素水平上調(diào)，其中，血中總膽汁酸水平降至石膽酸造模組的61%、11%和4%;血中總膽紅 素水平降至石膽酸造模組的38%、21%和8%，表明了五味子醇乙能劑量依賴性的減輕石膽 酸所致小鼠的膽汁淤積。
[0064] 6、五味子醇乙對膽汁酸代謝或轉(zhuǎn)運相關基因的影響 (1) RT-qPCR 按照Trizol試劑的說明書提取得到小鼠肝細胞總RNA，按照RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄 得到cDNA，按照qPCR試劑盒說明書檢測特定基因分/7為77 (NM_007818,小鼠)、 (NM_201645,小鼠)和 fl3i/77a￥(NM_030687,小鼠）的 mRNA 表達量，以基因 fe/7i*(NM_008084， 小鼠）作為內(nèi)參基因。
[0065] 所使用的引物序列如下所述： 內(nèi)參基因使用引物Gapdh-F和Gapdh-R ; Gapdh-F :AGGTCGGTGTGAACGGATTTG (SEQ ID NO :1 所示）； Gapdh-R:GGGGTCGTTGATGGCAACA (SEQ ID N0:2 所示）。
[0066] 基因分/?為77 使用引物 Cyp3all_F 和 Cyp3all_R ; Cyp3all-F :GGATGAGATCGATGAGGCTCTG (SEQ ID NO :3 所示）； Cyp3all-R:CAGGTATTCCATCTCCATCACAGT (SEQ ID N0:4 所示）。
[0067] 基因 使用引物 Ugtlal-F 和 Ugtlal-R ; Ugtlal-F :GCTTCTTCCGTACCTTCTGTTG (SEQ ID NO :5 所示）； Ugtlal-R:GCTGCTGAATAACTCCAAGCAT (SEQ ID 吣：6所示）。
[0068] 基因 使用引物 0atpla4_F 和 0atpla4_R。
[0069] 0atpla4-F :CCCTGGGGACATCGACTCTT (SEQ ID NO :7 所示）； 0atpla4-R:CCATCATTCTGCATCGTAGGAC (SEQ ID 勵：8所示）。
[0070] (2) Western blot 按照RIPA裂解液或者核蛋白提取試劑盒的說明書得到相應的組織總蛋白或者核蛋白 產(chǎn)物，蛋白濃度測定采用BCA法，蛋白分離過程中，聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8% (w/v)，分 離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，然后用含5%(w/w)脫脂奶粉的TBST溶液常溫下封閉lh，再 分別用不同的一抗（GAPDH，CYP3A11，UGT1A1)在4°C孵育過夜，之后用TBST洗膜兩次，每次 5min，然后在常溫下分別孵育相應來源的二抗lh，再接著用TBST洗膜三次，每次5min，最后 按照ECL發(fā)光液的說明書曝光得到蛋白條帶。
[0071] (3)如附圖7、附圖8和附圖9所示，共檢測了與膽汁酸代謝或轉(zhuǎn)運相關的3個 基因的表達：檢測結(jié)果顯示五味子醇乙能顯著上調(diào)分/7為77、 的mRNA水平。如附圖10所示，五味子醇乙能顯著上調(diào)CYP3A11和UGT1A1 的蛋白水平。附圖11為附圖10中蛋白條帶的定量統(tǒng)計結(jié)果，蛋白水平的結(jié)果與基因水平 結(jié)果一致。該結(jié)果顯示了五味子醇乙預防與治療膽汁淤積性肝病作用的機制可能涉及對 CYP3A11、UGT1A1、0ATP1A4介導的膽汁酸代謝及外排的調(diào)控作用。
[0072] 實施例2膽管結(jié)扎造成的小鼠肝外膽汁淤積模型的治療 1、材料與方法 (1)主要儀器同實施例1。
[0073] (2)藥品和試劑：熊去氧膽酸（UDCA，上海阿拉丁試劑有限公司）；其余同實施例1。
[0074] 2、實驗動物及給藥方案 C57BL/6小鼠，雄性，周齡8?9周，由中山大學(廣州市大學城)實驗動物中心提供，許 可證號為SCXK (粵）2011-0029,正常小鼠用維持飼料喂養(yǎng)。
[0075] 五味子醇乙（200 mg/kg)超聲分散于預高壓滅菌的0· 5%(w/w)CMC ;熊去氧膽酸 (25 mg/kg)溶于生理鹽水。
[0076] 小鼠隨機分成5組，每組6?8只，組別為假手術(shù)空白對照組、假手術(shù)+五味子醇 乙組、膽管結(jié)扎空白對照組、膽管結(jié)扎+五味子醇乙組以及膽管結(jié)扎+熊去氧膽酸組。
[0077] 五味子醇乙給藥方式為灌胃，連續(xù)給藥7天，每天兩次(單次劑量為100 mg/kg)。 UDCA的給藥方式為腹腔注射，連續(xù)給藥7天，每天一次。
[0078] 而膽管結(jié)扎術(shù)在第四天給藥前進行。用乙醚將小鼠麻醉后沿腹中線左側(cè)肋骨下方 處剪開約2 cm的切口，用手術(shù)鑷輕輕牽引出十二指腸，在十二指腸與肝連接處可見一條白 色的韌性細管，即為膽管。小心將膽管周圍覆蓋的脂肪樣組織分離，分別將靠近十二指腸方 向和靠近肝臟方向結(jié)扎，然后將兩段結(jié)扎之間的膽管剪斷。沿腹部切口進行縫合。假手術(shù) 組除不結(jié)扎及剪斷膽管外，其余操作均與膽管結(jié)扎術(shù)相同。
[0079] 第6天上午給藥后立即轉(zhuǎn)入代謝籠中，連續(xù)收集24h尿液。尿液采集完畢立即置 于冰浴，并于當日進行相應指標檢測。第7天給藥后4h處理解剖小鼠，解剖后對在體的肝 臟及膽囊的形態(tài)進行拍照，然后收集血清以及肝臟，每組取三只小鼠部分肝臟置于1〇%(ν/ v)甲醛中固定，其它樣本在_80°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0080] 3、肝組織與血清化學檢測方法同實施例1。
[0081] 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同實施例1。
[0082] 5、實驗結(jié)果 (1)五味子醇乙減輕膽管結(jié)扎所致肝壞死程度 如附圖12A所示，與假手術(shù)空白對照組相比，膽管結(jié)扎空白對照組小鼠的肝臟解剖可 見明顯的肝壞死病理改變，表現(xiàn)為肝包膜下出現(xiàn)眾多明顯的紅色星狀病灶點。協(xié)同給予200 mg/kg五味子醇乙或者25 mg/kg UDCA組小鼠肝包膜下的壞死病灶點數(shù)目明顯減少，肝臟 形態(tài)趨于正常。如附圖12B所示，H&E染色結(jié)果顯示與假手術(shù)空白對照組相比，膽管結(jié)扎空 白對照組小鼠出現(xiàn)較大面積的肝細胞壞死。協(xié)同給予200 mg/kg五味子醇乙或者25 mg/ kg UDCA組小鼠肝壞死程度明顯減少。附圖12A和12B的結(jié)果表明了五味子醇乙能顯著減 輕膽管結(jié)扎所致肝壞死的程度。
[0083] (2)五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血清ALT、AST的升高 如附圖13、附圖14和附圖15所示，與假手術(shù)空白對照組相比，膽管結(jié)扎空白對照組小 鼠的ALT、AST和ALP水平分別上升至904 U/L、1548 U/L和1072 U/L，提示石膽酸能夠造 成嚴重的肝損傷以及膽管損傷。分別協(xié)同給予200 mg/kg的五味子醇乙能逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎誘 導的ALT、AST水平上調(diào)，其中ALT水平降至石膽酸造模組的39%，AST水平降至石膽酸造模 組的65%。但五味子醇乙對膽管結(jié)扎誘導的ALP水平上調(diào)無明顯逆轉(zhuǎn)作用。該結(jié)果表明了 五味子醇乙能保護膽管結(jié)扎所致小鼠的肝損傷。
[0084] (3)五味子醇乙逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎所致小鼠血中總膽汁酸和總膽紅素的升高，以及增 加尿中總膽汁酸和總膽紅素排出量 如附圖16?19所示，與假手術(shù)空白對照組相比，膽管結(jié)扎空白對照組的小鼠血中總膽 汁酸和總膽紅素水平上升至34. 9倍和24. 0倍，同時肝中總膽汁酸水平上升至1. 63倍，提 示石膽酸能導致嚴重的膽汁淤積。協(xié)同給予200 mg/kg的五味子醇乙能逆轉(zhuǎn)膽管結(jié)扎誘導 的血中總膽汁酸和總膽紅素。其中，血中總膽汁酸水平降至膽管結(jié)扎空白對照組的67% ;血 中總膽紅素水平降至膽管結(jié)扎空白對照組的66%。另外，五味子醇乙能顯著增加尿液當中總 膽汁酸和總膽紅素的排出量，分別上升至膽管結(jié)扎空白對照組的113%、154%。表明了五味子 醇乙能在一定程度上減輕膽管結(jié)扎所致小鼠的膽汁淤積。
[0085] 6、五味子醇乙對對膽汁酸代謝或轉(zhuǎn)運相關基因的影響 (l)RT-qPCR同實施例1。
[0086] (2) Western blot 同實施例 1。
[0087] (3)如附圖20?22所示，共檢測了與膽汁酸代謝或轉(zhuǎn)運相關的3個基因的表達： 檢測結(jié)果顯示五味子醇乙能顯著上調(diào) 的mRNA水平。如附圖23所示，五味子醇乙能顯著上調(diào)CYP3A11和UGT1A1的蛋白水平。附 圖24為附圖23中蛋白條帶的定量統(tǒng)計結(jié)果，蛋白水平的結(jié)果與基因水平結(jié)果一致。該結(jié) 果顯示了五味子醇乙預防與治療膽汁淤積性肝病作用的機制可能涉及對CYP3A1UUGT1A1、 0ATP1A4介導的膽汁酸代謝及外排的調(diào)控作用。
[0088] 實施例3五味子醇乙對膽固醇結(jié)石、商脂蛋白血癥等的治療 本發(fā)明還初步研究了五味子醇乙對膽固醇結(jié)石、高脂蛋白血癥的影響和治療作用，結(jié) 果顯示，五味子醇乙能夠顯著降低血清膽固醇含量，降低血脂含量，對膽固醇結(jié)石和高脂蛋 白血癥的預防和治療效果明顯。 SEQUENCE LISTING <110>中山大學 〈120>五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用 <130> <160> 8 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Gapdh-F <400> 1 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Gapdh-R 〈400> 2 ggggtcgttg atggcaaca 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Cyp3all-F 〈400> 3 ggatgagatc gatgaggctc tg 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Cyp3all-R <400> 4 caggtattcc atctccatca cagt 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Ugtlal-F 〈400> 5 gcttcttccg taccttctgt tg 22 <210> 6 <211> 22 〈212> DNA 〈213> Ugtlal-R 〈400> 6 gctgctgaat aactccaagc at 22 <210> 7 <211> 20 〈212> DNA 〈213> 0atpla4-F <400> 7 ccctggggac atcgactctt 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> 0atpla4-R 〈400> 8 ccatcattct gcatcgtagg ac 22
【權(quán)利要求】
1. 五味子醇乙在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。
2. -種用于預防和治療膽汁淤積性肝病的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包 含有五味子醇乙。
3. 權(quán)利要求2所述藥物組合物在制備預防和治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應用，其特征在于，所述的膽汁淤積性肝病是指肝內(nèi)膽汁 淤積性肝損傷或肝外膽汁淤積性肝損傷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應用，其特征在于，所述的膽汁淤積性肝病是指石膽酸或 膽管結(jié)扎所誘導的膽汁淤積性肝損傷。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應用，其特征在于，所述的預防和治療膽汁淤積性肝病 是指降低肝外膽汁淤積肝病模型血清中ALT、AST和ALP的活性，減輕肝組織壞死程度，降 低血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量；或是指降低肝外膽汁淤積模型血清中ALT、AST的活 性，減輕肝組織壞死程度，降低血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量，以及增加尿液排出總膽 汁酸及總膽紅素含量。
7. 五味子醇乙在制備67/^477基因表達促進劑中的應用。
8. 五味子醇乙在制備如77J7基因表達促進劑中的應用。
9. 五味子醇乙在制備基因表達促進劑中的應用。
【文檔編號】A61P3/06GK104083359SQ201410266847
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】黃民, 畢惠嫦, 曾行, 陳攀, 范曉梅, 姜伊鳴 申請人:中山大學