一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，將鈦金屬預(yù)處理，配制可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)的混合液，再加入成骨細(xì)胞和預(yù)處理鈦金屬，真空干燥，得到涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬，最后浸入胰酶溶液中15-45秒，超聲洗凈，真空干燥，得到本發(fā)明所述能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的改性醫(yī)用鈦金屬。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，制備條件溫和，在制備過(guò)程中無(wú)有害物質(zhì)產(chǎn)生，本發(fā)明所得產(chǎn)品能有效識(shí)別成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦金屬表面的快速生長(zhǎng)，將本發(fā)明所得產(chǎn)品作為植入體植入體內(nèi)后，有利于成骨細(xì)胞在鈦金屬表面固定生長(zhǎng)。
【專利說(shuō)明】一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料的表面改性領(lǐng)域，具體為一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，醫(yī)用鈦金屬被作為牙種植體和骨種植體等種植材料廣泛應(yīng)用在牙列缺損、骨頭損失等疾病治療，在挽救人的生命方面發(fā)揮了重要作用。然而該類手術(shù)的感染率很高，可能會(huì)導(dǎo)致大量抗生素治療、去除種植體甚至死亡等嚴(yán)重后果。種植體相關(guān)感染高發(fā)的主要原因有兩點(diǎn):菌斑在種植體表面聚集和種植體骨結(jié)合界面抵抗能力低下。因此，需要提高鈦金屬的抗菌性能和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)功能。
[0003]分子印跡的概念由3011訪6111在1975年首先提出，近年來(lái)分子印跡技術(shù)發(fā)展極為迅速。當(dāng)模板分子(印跡分子)與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過(guò)聚合過(guò)程這種作用就會(huì)被記憶下來(lái)，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對(duì)模板分子及其類似物具有選擇識(shí)別特性。本發(fā)明利用分子印跡的技術(shù)，在鈦金屬表面引入與成骨細(xì)胞相匹配的作用點(diǎn)，以期提高鈦金屬的促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，經(jīng)過(guò)改性之后的鈦金屬提高涂層的穩(wěn)定性，增強(qiáng)粘附效果，同時(shí)通過(guò)加入抗菌性物質(zhì)，在提高鈦金屬的促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)能力的同時(shí)增強(qiáng)鈦金屬的抗菌能力。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0006]一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]步驟一、鈦金屬預(yù)處理，將鈦金屬在10-2501 0.5-2001/1丙酮溶液中超聲處理2-3次，每次15-45分鐘，然后放入2，3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液中浸泡20-30小時(shí)，真空干燥，得到預(yù)處理鈦金屬；
[0008]步驟二、涂層制備，取交聯(lián)劑溶液、溶菌酶溶液和硝酸銀溶液混合進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)的混合液，向所述混合液中加入成骨細(xì)胞和預(yù)處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預(yù)處理鈦金屬，真空干燥得到涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬；
[0009]步驟三、成骨細(xì)胞的移除，將步驟二得到的涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬浸入胰酶溶液中30-50秒，再浸入蒸餾水超聲5-10分鐘，使所述成骨細(xì)胞從所述交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)內(nèi)移除，并使預(yù)處理鈦金屬表面形成具有與成骨細(xì)胞相匹配的空間結(jié)構(gòu)的涂層，即得所述能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的改性醫(yī)用鈦金屬。
[0010]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟一中2,3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液的用量為5-101111，體積分?jǐn)?shù)為5-10%。
[0011]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟二中所述交聯(lián)劑溶液及溶菌酶溶液的配置方法分別為:取0.1-0.58交聯(lián)劑與3-81111 75-85%乙醇溶液混合得到交聯(lián)劑溶液；取1-28溶菌酶與30-1001111水混合制得溶菌酶溶液；取
0.01-0.058硝酸銀與1-5“蒸餾水混合制得硝酸銀溶液。
[0012]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟二中所述的交聯(lián)劑可為環(huán)氧樹脂或環(huán)氧氯丙烷。
[0013]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟二中所述成骨細(xì)胞的用量為1-51111，所述成骨細(xì)胞密度為2-10\104加1。
[0014]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟三中所述胰酶溶液為用量為2-101111，所述胰酶溶液濃度為0.25-1% ；所述整理水用量為30-501111。
[0015]優(yōu)選的是，所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，所述真空干燥條件為壓強(qiáng)0.1-0.3腿^，溫度為80-1201，干燥時(shí)間為10-30分鐘。
[0016]本發(fā)明帶來(lái)的有益效果是:本發(fā)明中采用分子印跡的方法，先將溶菌酶中的胺基與交聯(lián)劑中的環(huán)氧基產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，形成一個(gè)交聯(lián)的空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)再引入成骨細(xì)胞，在加熱條件下將成骨細(xì)胞包覆在交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)中，同時(shí)2,3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷中的環(huán)氧基也參與交聯(lián)反應(yīng)，生成了共價(jià)鍵，與鈦金屬穩(wěn)固連接，穩(wěn)定的粘附在鈦金屬表面，增加了涂層在鈦金屬表面的穩(wěn)定性；在胰酶的作用下將成骨細(xì)胞移除，鈦金屬表面留下成骨細(xì)胞的“印跡”，即為與成骨細(xì)胞相匹配的空穴，具有對(duì)成骨細(xì)胞分子有效識(shí)別的功能，當(dāng)鈦金屬表面的空穴與成骨細(xì)胞接觸時(shí)，成骨細(xì)胞在鈦金屬表面固定生長(zhǎng)；同時(shí)在溶菌酶本身具有抗菌、消炎的作用，屬于接觸性殺菌，而硝酸銀中的銀離子也具有殺菌作用，為擴(kuò)散殺菌，兩者的協(xié)同作用，大大提高了所得鈦金屬的抗菌性。在對(duì)鈦金屬進(jìn)行改性前，先通過(guò)丙酮溶液進(jìn)行除油處理，除去鈦金屬表面的氧化膜，有效防止涂層脫落，促進(jìn)涂層的穩(wěn)定性，同時(shí)使用的溶菌酶來(lái)源于人體，具有良好的生物相容性，使鈦金屬制成的植入體與人體具有很好的生物相容性，減少排斥反應(yīng)造成的不良影響本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和，無(wú)有害副產(chǎn)物生成。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明所述兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法備方法流程不意圖圖；
[0018]圖2為本發(fā)明所得產(chǎn)品與普通鈦片進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)的結(jié)果示意圖；
[0019]圖3為本發(fā)明所得產(chǎn)品與普通鈦片進(jìn)行細(xì)胞毒性分析的結(jié)果示意圖。
圖4為本發(fā)明所得產(chǎn)品與普通鈦片進(jìn)行細(xì)胞毒性分析的結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0021]如圖1所示，一種兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法備方法，其中，包括以下步驟:
[0022]步驟一、鈦金屬預(yù)處理，將鈦金屬在10-2501 0.5-2001/1丙酮溶液中超聲處理2-3次，每次15-45分鐘，然后放入體積分?jǐn)?shù)為5-10%的2，3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液中浸泡20-30小時(shí)，在0.1-0.3腿^溫度80-1201真空干燥10-30分鐘，得到預(yù)處理鈦金屬；
[0023]步驟二、涂層制備，取0.1-0.58交聯(lián)劑與3-8“ 85%乙醇溶液混合得到交聯(lián)劑溶液；取1-28溶菌酶與30-1001111水混合制得溶菌酶溶液；取0.01-0.058硝酸銀與1-51111蒸餾水混合制得硝酸銀溶液；然后將所述三種溶液混合進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)的混合液，同時(shí)溶菌酶中的胺基對(duì)硝酸銀中的銀離子有吸附作用，然后向所述混合液中加入1-501密度為2-10\104加1的成骨細(xì)胞，攪拌均勻后，再加入面積為1 X 1^2的預(yù)處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預(yù)處理鈦金屬，在0.2-0.3腿^溫度80-1201真空干燥10-30分鐘，得到涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬；
[0024]步驟三、成骨細(xì)胞的移除，將步驟二得到的涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬浸入2-1001濃度為0.25-1%的胰酶溶液中靜置30-50秒，取出浸入30-5001蒸餾水超聲5-10分鐘，在0.1-0.31？3溫度80-1201真空干燥10-30分鐘，使所述成骨細(xì)胞從所述交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)內(nèi)移除，并使預(yù)處理鈦金屬表面形成具有與成骨細(xì)胞相匹配的空間結(jié)構(gòu)的涂層，即得所述能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的改性醫(yī)用鈦金屬。
[0025]所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟二中所述交聯(lián)劑溶液及溶菌酶溶液的配置方法分別為:取0.1-0.交聯(lián)劑與3-81111 75-85%乙醇溶液混合得到交聯(lián)劑溶液；取1-28溶菌酶與30-1001111水混合制得溶菌酶溶液；取0.01-0.058硝酸銀與1-5“蒸餾水混合制得硝酸銀溶液。
[0026]所述的兼具抗菌性及促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法中，步驟二中所述的交聯(lián)劑可為環(huán)氧樹脂或環(huán)氧氯丙烷。
[0027]實(shí)施例1
[0028]步驟一、鈦金屬預(yù)處理,將鈦金屬在101111 211101/1丙酮溶液中超聲處理3次，每次30分鐘，然后放入1001體積分?jǐn)?shù)為5%的2,3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液中浸泡25小時(shí)，在0.31？^溫度801真空干燥30分鐘，得到預(yù)處理鈦金屬；
[0029]步驟二、涂層制備，取0.138交聯(lián)劑與5“ 85%乙醇溶液混合得到交聯(lián)劑溶液；取
1.58溶菌酶與50“水混合制得溶菌酶溶液；取0.018硝酸銀與蒸餾水混合制得硝酸銀溶液；然后將所述三種溶液混合進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)的混合液，同時(shí)溶菌酶中的胺基對(duì)硝酸銀中的銀離子有吸附作用，然后向所述混合液中加入1-51111密度為2-10\104加1的成骨細(xì)胞，攪拌均勻后，再加入面積為的預(yù)處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預(yù)處理鈦金屬，在0.3腿^溫度1001真空干燥30分鐘，得到涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬；
[0030]步驟三、成骨細(xì)胞的移除，將步驟二得到的涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬浸入101111濃度為0.25%的胰酶溶液中靜置50秒，取出浸入5001蒸餾水超聲10分鐘，在0.31？3溫度1001真空干燥30分鐘，使所述成骨細(xì)胞從所述交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)內(nèi)移除，并使預(yù)處理鈦金屬表面形成具有與成骨細(xì)胞相匹配的空間結(jié)構(gòu)的涂層，即得所述能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的改性醫(yī)用鈦金屬。
[0031]1、抗菌能力實(shí)驗(yàn)
[0032]將本發(fā)明所得產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄菌、大腸埃希氏菌、白假絲酵母、枯草芽孢桿菌黑色變種進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。每個(gè)試樣表面接種101濃度為105的菌液在371培養(yǎng)1(1后，試樣用
輕輕漂洗3次以去除未粘附的細(xì)菌，然后試樣上粘附的細(xì)菌用超聲振蕩(401) 5111111洗脫到11111蒸餾水中，洗脫液用來(lái)檢測(cè)試樣表面粘附細(xì)菌中的活菌數(shù)。用倍比稀釋和涂布培養(yǎng)法檢測(cè)活菌數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
[0033]2、細(xì)胞活性檢測(cè)
[0034]將普通鈦片和本發(fā)明產(chǎn)物分別置于24孔板中(每組設(shè)三個(gè)平行孔)。101密度為2X1071111的細(xì)胞懸液接種于試樣表面，然后培養(yǎng)1、4和7(1。到預(yù)定時(shí)間點(diǎn)后，試樣用邱=7.4的磷酸鹽緩沖液輕柔漂洗三次后轉(zhuǎn)移到新的24孔板內(nèi)。每孔加入200 9 1濃度為511^/1111的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽和800 ^ 1無(wú)血清無(wú)酚紅0121培養(yǎng)基。371孵育處后吸棄上清，加入11111 二甲基亞砜溶解生成的結(jié)晶物，每孔取2009 1溶解液轉(zhuǎn)到96孔培養(yǎng)板，用分光光度計(jì)于490=0處測(cè)其00值。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0035]3、細(xì)胞毒性分析
[0036](1)試驗(yàn)原理:以乳酸脫氫酶(10?)的活性作為細(xì)胞毒性指標(biāo)來(lái)評(píng)估本發(fā)明產(chǎn)物的細(xì)胞毒性大小，其原理為乳酸脫氫酶(10?)是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，10?即被釋放到細(xì)胞外山0?催化乳酸形成丙酮酸鹽，和四唑鹽類(1^1)反應(yīng)形成紫色的結(jié)晶物質(zhì)，可通過(guò)50011111酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0037](2)試驗(yàn)步驟:分別普通鈦片和本發(fā)明產(chǎn)物分別放入24孔板中，然后將1乂104個(gè)細(xì)胞的成骨細(xì)胞接種到24孔板中，并培育1天。分別收集培養(yǎng)液，離心后取上清用于[0?活性檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
[0038]4、試驗(yàn)結(jié)果
[0039]從圖2中可以看出，由本發(fā)明所得產(chǎn)品對(duì)金黃色葡萄球菌6538)、大腸埃希氏菌25922)、白假絲酵母10231)、枯草芽孢桿菌黑色變種9372)都具有很強(qiáng)的殺菌性，其殺菌率達(dá)99%以上。
[0040]從圖3中可以看出普通鈦片和本發(fā)明產(chǎn)物的00值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，但是可以看出，普通鈦片隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加00值的增長(zhǎng)緩慢，相比之下，本發(fā)明產(chǎn)物的00值在隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加快速增長(zhǎng)，在培養(yǎng)7天時(shí)，本發(fā)明產(chǎn)品相較于普通鈦片的00值成倍增長(zhǎng)。由此可以得出，本發(fā)明產(chǎn)品具有明顯的細(xì)胞增殖活性效果。
[0041]從圖4中可以知道本發(fā)明產(chǎn)品與普通鈦片相比，普通鈦片的10?活性⑴/1)值為236，而本發(fā)明產(chǎn)品的10?活性⑴/1)值為223，低于普通鈦片的10?值，表明本發(fā)明產(chǎn)物無(wú)細(xì)胞毒性。
[0042]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、鈦金屬預(yù)處理，將鈦金屬在10-25ml0.5-2mol/L丙酮溶液中超聲處理2_3次，每次15-45分鐘，然后放入2，3-環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液中浸泡20-30小時(shí)，真空干燥，得到預(yù)處理鈦金屬； 步驟二、涂層制備，取交聯(lián)劑溶液、溶菌酶溶液和硝酸銀溶液混合進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)的混合液，向所述混合液中加入成骨細(xì)胞和預(yù)處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預(yù)處理鈦金屬，真空干燥得到涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬； 步驟三、成骨細(xì)胞的移除，將步驟二得到的涂層中包覆有成骨細(xì)胞的鈦金屬浸入胰酶溶液中30-50秒，再浸入蒸餾水超聲5-10分鐘，使所述成骨細(xì)胞從所述交聯(lián)空間結(jié)構(gòu)內(nèi)移除，并使預(yù)處理鈦金屬表面形成具有與成骨細(xì)胞相匹配的空間結(jié)構(gòu)的涂層，即得所述能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的改性醫(yī)用鈦金屬。
2.如權(quán)利要求1所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟一中2，3_環(huán)氧丙基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液的用量為5-10ml，體積分?jǐn)?shù)為5-10%。
3.如權(quán)利要求1所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟二中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的各種溶液的配置方法分別為:取0.1-0.5g交聯(lián)劑與3-8ml75-85%乙醇溶液混合得到所述交聯(lián)劑溶液；取l_2g溶菌酶與30_100ml水混合制得所述溶菌酶溶液；取0.01-0.05g硝酸銀與l_5ml蒸餾水混合制得所述硝酸銀溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟二中所述的交聯(lián)劑可為環(huán)氧樹脂或環(huán)氧氯丙烷。
5.如權(quán)利要求1所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟二中所述成骨細(xì)胞的用量為l_5ml,所述成骨細(xì)胞密度為2-10X 104/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟三中所述胰酶溶液為用量為2-10ml，所述胰酶溶液濃度為0.25-1%;所述蒸餾水用量為 30-50ml。
7.如權(quán)利要求1所述的兼具抗菌性及促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的鈦金屬改性方法，其特征在于，所述真空干燥條件為壓強(qiáng)0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥時(shí)間為10-30分鐘。
【文檔編號(hào)】A61K6/04GK104353109SQ201410522585
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】李培源, 蘇煒, 霍麗妮, 陳睿 申請(qǐng)人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)