一種自組裝短肽及其在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自組裝短肽及其在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用，該自組裝短肽命名為GFS-2，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽能夠自組裝形成納米纖維支架，支撐多種細(xì)胞生長，可以在納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的基質(zhì)材料。
【專利說明】一種自組裝短肽及其在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是一種自組裝短肽。

【背景技術(shù)】
[0002]分子自組裝指的是分子在不受外力介入的情況下，能夠進(jìn)行自我組織，自我聚集形成一種規(guī)則的結(jié)構(gòu)，即能夠從一個(gè)雜亂無序的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成一個(gè)有序的狀態(tài)。在最近的十幾年里，分子自組裝系統(tǒng)(如氨基酸)已經(jīng)成為分子生物學(xué)、化學(xué)以及材料學(xué)等學(xué)科的交匯點(diǎn)，尤其是手性自組裝短肽，已經(jīng)發(fā)展成為了一類新興的納米生物材料。由它們構(gòu)成的納米纖維，作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的基質(zhì)材料，能模擬生物體內(nèi)的三維基質(zhì)微環(huán)境，具有高純度、可降解及無免疫反應(yīng)的突出優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于細(xì)胞工程、組織工程及生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的自組裝短肽，增加自組裝短肽的種類，使之可在細(xì)胞三維培養(yǎng)中使用。
[0004]在手性自組裝短肽的設(shè)計(jì)原則下，本發(fā)明采用全新理念設(shè)計(jì)新型自組裝短肽，記為GFS-2，研究了濃度和離子對GFS-2自組裝過程的影響、低濃度自組裝短肽GFS-2對細(xì)胞膜的裂解作用、高濃度自組裝短肽GFS-2形成的納米纖維對細(xì)胞的活性的影響及細(xì)胞在該水凝膠中的生長、增殖情況等。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種自組裝短肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1，命名為GFS-2。其分子量為1783.06。其自組裝原理是通過分子之間非共價(jià)鍵相互作用，形成結(jié)構(gòu)明確且穩(wěn)定，并具有某些理化性質(zhì)的超分子結(jié)構(gòu)或分子聚集體。
[0006]進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了自組裝短肽在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0007]更具體地，所述自組裝短肽在制備細(xì)胞三維培養(yǎng)納米支架材料中的應(yīng)用。
[0008]實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述短肽在金屬鹽離子、細(xì)胞培養(yǎng)基等環(huán)境下，能進(jìn)行自組裝形成納米纖維。
[0009]實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽形成的納米纖維，細(xì)胞能在其上進(jìn)行三維黏附、生長，所以，此自組裝短肽可應(yīng)用到動(dòng)、植物細(xì)胞三維培養(yǎng)中。
[0010]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、提供了一種新型自組裝短肽，增加自組裝短肽類型。
[0011]2、提供了一種新型的自組裝納米生物醫(yī)學(xué)材料，這種新型生物醫(yī)學(xué)材料能夠廣泛的應(yīng)用到納米生物醫(yī)學(xué)工程、細(xì)胞工程及生物工程及等領(lǐng)域，并具有明顯的經(jīng)濟(jì)及其社會(huì)效益。
[0012]3、提供了一種細(xì)胞三維培養(yǎng)納米支架材料，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明所述L型氨基酸構(gòu)成的自組裝短肽GFS-2的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]圖2是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2高效液相(HPLC)色譜圖。
[0015]圖3是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2質(zhì)譜(MS)圖。
[0016]圖4是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2的圓二色譜圖，新型短肽GFS-2常溫下的二級結(jié)構(gòu)特征是在216nm處有一強(qiáng)負(fù)峰，在194nm處有一強(qiáng)正峰，峰形完好。
[0017]圖5是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2的原子力顯微圖(AFM)，圖中:A表示4h時(shí)短肽GFS-2自組裝形成細(xì)而短的納米纖維絲；B表示8h后納米纖維的長度增加，數(shù)量增多，并開始聚集；C表示48h后的AFM照片表明，納米纖維能完成自組裝過程，形成三維的納米纖維網(wǎng)絡(luò)支架。
[0018]圖6是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2形成水凝膠光學(xué)圖片，剛果紅染色，5mg/mL的短肽GFS-2鹽離子溶液自組裝24h(圖6中A)后形成肉眼可見的透明膠狀物質(zhì)，形成松散的片層狀薄膜；36h(圖6中B)薄膜的厚度及大小都有所增加，但還是處于松散的狀態(tài)；48h (圖6中C)薄膜片層連接在一起，形成整個(gè)一層較為致密的膜片；72h(圖6中D)該膜片沒有明顯的變化。
[0019]圖7是本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2的紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
[0020]圖8是用本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2三維培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞ECA109 (圖8中A為20倍鏡；圖8中B為40倍鏡)和MDA-231 (圖8中C為20倍鏡；圖8中D為40倍鏡)都可以該三維體系中可以生長，細(xì)胞圓球形，邊界清楚，調(diào)節(jié)顯微鏡能看到模糊的細(xì)胞核界限，連續(xù)培養(yǎng)7d,細(xì)胞仍可以在本發(fā)明所述自組裝短肽GFS-2形成的三維支架材料中生長。

【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 實(shí)施例1:由L-氨基酸構(gòu)成的自組裝短肽GFS-2的制備
1、材料
Fmoc-L-Ala-OH (9-荷甲氧羰?；?L-丙氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH (9-荷甲氧羰?；?L-亮氨酸)、Fmoc-L-Val-OH (9-荷甲氧羰?；?L-纟顏氨酸)>Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH (荷甲氧羰酰基L-天冬氨酸-ε -叔丁氧羰?；?、Fmoc-L-Glu (OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸- ε-叔丁氧羰?；?、Fmoc-L-Lys (Boc) -OH (9_荷甲氧羰?；?L-賴氨酸-ε -叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Arg (pbf) -OH (9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-Y -叔丁氧羰?；?、HBTU (O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1_羥基苯并三氮唑);哌啶，乙酸酐，溶劑:DMF (N、N-二甲基甲酰胺)、TFA (三氟乙酸)、DCM (二氯甲烷)、NMM (N-甲基嗎啉)。
[0022]2、合成方法
稱取0.5mmol/g樹脂20g于肽合成器中，用DCM浸泡樹脂5_10分鐘后，再用400mlDMF清洗樹脂5次，每次清洗時(shí)間為3min，抽濾干洗滌液。經(jīng)過10-20分鐘用20%的六氫吡啶脫保護(hù)后，400mlDMF清洗樹脂5次，每次清洗3min，抽濾干洗滌液。然后向反應(yīng)器中加入原料(氨基酸，縮合劑等)縮合反應(yīng)30分鐘，用DMF清洗5次，每次清洗3min，抽濾出洗滌液。按上述方式再進(jìn)行保護(hù)一清洗一縮合一清洗一保護(hù)一清洗一抽干，TFA切割，乙醚沉淀切割液，清洗2-3次后，抽干，得到粗肽。HPLC純化后，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述的自組裝短肽GFS-2，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0023]3、純化步驟
(O首先將上述得到的粗肽進(jìn)行樣品的10-100%分析，在確定出主峰的保留時(shí)間后，線性梯度分析樣品；
(2)去離子水和乙腈(4:1)能夠較充分的溶解試樣品多肽；
(3)200mg多肽置于1ml的溶解瓶中，加入去離子水,經(jīng)過超聲溶解后,用0.45 μ m的有機(jī)相濾頭過濾，取上清液；
(4)收峰由線性梯度制備，并確定MS是否正確；
(5)為了符合純度要求的液體量，要對所收的液體進(jìn)行純度的跟蹤反饋；
(6)在40°C下，把所收集合格的溶液濃縮至40-50ml；
(7)濃縮好的溶液置于10ml燒杯中，放置于冰柜中冷凍；
(8)干燥;
(9)稱量；
(10)反打；
(11)包裝。
[0024]實(shí)施例2:短肽GFS-2的高效液相色譜和質(zhì)譜檢測與三維分子模型繪制
對實(shí)施例1制備的短肽GFS-2采用普通畫圖軟件(Hyperchem 7.5, www.hyper, com)繪制得到分子結(jié)構(gòu)示意圖，見圖1，由圖可看出氨基酸的空間分布。
[0025]將實(shí)施例1制備的短肽GFS-2利用高效液相色譜(HPLC)檢測，參見圖2，由圖2中的譜峰面積可計(jì)算其純度已達(dá)到95%。將實(shí)施例1制備的短肽GFS-2采用質(zhì)譜(MS)檢測，參見圖3，說明其分子量為1783.06是正確的。
[0026]實(shí)施例3:自組裝短肽GFS-2的圓二色性檢測和原子力顯微鏡(AFM)檢測
用去離子水配制100 μ M短肽GFS-2溶液，圓二色譜儀(AVIV 400⑶spectrometer)對短肽GFS-2進(jìn)行⑶檢測，參數(shù)設(shè)置:掃描波長為190-260nm，光徑為2mm。本發(fā)明短肽GFS-2常溫下的二級結(jié)構(gòu)特征是在216nm處有一強(qiáng)負(fù)峰，在194nm處有一強(qiáng)正峰，峰形完好(見圖4)。這一結(jié)果表明，新型短肽GFS-2具有穩(wěn)定的β-sheet 二級結(jié)構(gòu)，在特定的條件下發(fā)生自組裝，形成納米纖維。
[0027]用生理鹽水配制500 μ M的短肽GFS-2溶液，在室溫下讓短肽自組裝48小時(shí)，分別在4、8和48h時(shí)制作樣本。在新撕開的云母片上滴加10 μ I短肽溶液，靜置60s，再用Iml去離子水沖洗3次，吸干云母片上的水分，將含有檢測樣品的云母片置于超凈的工作臺(tái)上，自然晾干后，用原子力顯微鏡觀察，掃描模式為敲打模式。4h時(shí)短肽GFS-2自組裝形成細(xì)而短的納米纖維絲；8h后納米纖維的長度增加，數(shù)量增多，并開始聚集；48h后的AFM照片表明，納米纖維能完成自組裝過程，形成三維的納米纖維網(wǎng)絡(luò)支架(見圖5)。
[0028]實(shí)施例4:用短肽GFS-2的剛果紅染色實(shí)驗(yàn)及自組裝形態(tài)和效果
用生理鹽水配制5mg/ml短肽GFS-2溶液，在25°C下孵育24到72小時(shí)。取10 μ I水凝膠涂抹在載玻片上，用剛果紅液染色30s，在光鏡下觀察(結(jié)果見圖6)。5mg/mL的短肽GFS-2鹽離子溶液自組裝24小時(shí)后形成肉眼可見的透明膠狀物質(zhì)，形成松散的片層狀薄膜；36h薄膜的厚度及大小都有所增加，但還是處于松散的狀態(tài)；48h薄膜片層連接在一起，形成整個(gè)一層較為致密的膜片；72h該膜片沒有明顯的變化。72h后自組裝短肽GFS-2形成的水凝膠含水量可高達(dá)99%，成透明狀的膠體，離心管倒置后，該凝膠不會(huì)下滑。
[0029]實(shí)施例5:用自組裝短肽GFS-2對細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)
(O分別用生理鹽水和去離子水配制不同濃度(1、10、100μ g/ml)的短肽溶液。
[0030](2)取Sprague Dawleg (SD)大鼠(200_250g，雌雄隨機(jī)，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，手術(shù)過程遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn))新鮮凍存血液(EDTA抗凝)，1500r離心20min，將白細(xì)胞層及其血漿層全部移除，用生理鹽水洗2-3次，取紅細(xì)胞4滴，加入10ml生理鹽水中，配制成4%紅細(xì)胞溶液(RBC)。
[0031](3)取100 μ I短肽溶液和400 μ 1RBC，400 μ I生理鹽水，加入離心管中，在37°C條件下孵化I小時(shí)后，5000r離心15min，取上清液。
[0032](4)用分光光度計(jì)在570nm波長下檢測吸光度。
[0033](5)陽性對照組加入紅細(xì)胞裂解液，陰性對照組加入生理鹽水。
[0034]數(shù)據(jù)表明，3種不同濃度的短肽溶液對紅細(xì)胞的裂解度相近，與陽性對照組比較相差0.340左右，與陰性對照組相差0.015左右，且裂解度都不超過0.060 (〈0.100)(見圖7)。這一結(jié)果說明3種不同濃度的短肽GFS-2溶液對細(xì)胞膜都不具有裂解作用，且自組裝24h以后的短肽溶液與未組裝前對細(xì)胞膜的作用相似。
[0035]實(shí)施例6:用短肽GFS-2對細(xì)胞三維培養(yǎng)
分別配制所需濃度的自組裝短肽溶液與ECA109和MDA-231細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)分子與腫瘤醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送)懸液，取等體積的短肽溶液、細(xì)胞懸液混合均勻，按照每孔50μ I的方式滴加到96孔板中，靜置lOmin，再加入培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)I周。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用CCK-8檢測，采用酶標(biāo)儀測試。
[0036]細(xì)胞三維培養(yǎng)的操作如下:
(1)將實(shí)施I制備的自組裝短肽GFS-2配制成各濃度溶液(2.5,3.5,4.5,5.5,6.5、7.5mg/ml)，取適量(100-300 μ I)移入離心管中備用；
(2)培養(yǎng)好的ECA109和MDA-231細(xì)胞分別用0.25%胰酶消化，再移入離心管中，1000rmp/min離心沉淀細(xì)胞lOmin，棄上清液，加入蔗糖溶液(質(zhì)量濃度為20%)記數(shù)到細(xì)胞5X 15個(gè)/ml，分別取300 μ I備用；
(3)在離心管中快速混合(I)和(2)中的溶液，得短肽和細(xì)胞的混合液；
(4)取(3)中的混合液50μ I滴加到96孔板中；
(5)滴加RPM1-1640完全培養(yǎng)基20μ 1，自組裝5 — 1min ；
(6)滴加RPM1-1640完全培養(yǎng)基150μ I，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 — 60min ；
(7)取出一半的細(xì)胞培養(yǎng)孔板液體，加入等體積的新鮮的RPM1-1640的完全培養(yǎng)基，換液完畢后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2-5天。
[0037]經(jīng)典二維細(xì)胞培養(yǎng)作為陰性對照，倒置顯微鏡顯示ECA109和MDA-231細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，邊界清晰，外觀近似梭形。運(yùn)用GFS-2自組裝形成的納米纖維作為三維支架材料培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞ECA109和MDA-231都可以在該三維體系中生長，細(xì)胞圓球形，邊界清楚，調(diào)節(jié)顯微鏡能看到模糊的細(xì)胞核界限(見圖8)。當(dāng)短肽GFS-2濃度為5.5mg/mL時(shí)，ECA109和MDA-231細(xì)胞24-72h時(shí)生長較緩慢，72h后細(xì)胞增長加快；在GFS-2三維支架中，兩種細(xì)胞初期的生長速度不及正常二維細(xì)胞培養(yǎng)組(陰性對照)。連續(xù)培養(yǎng)7d，仍可見細(xì)胞在GFS-2形成的三維支架材料中生長，且形態(tài)良好(見圖8)。該結(jié)果表明ECA109和MDA-231細(xì)胞可在GFS-2形成的三維支架中生長，且生長形態(tài)良好。
【權(quán)利要求】
1.一種自組裝短肽，其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種自組裝短肽，其特征在于:所述自組裝短肽的分子量為1783.06。
3.權(quán)利要求1或2所述自組裝短肽在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述自組裝短肽在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用，其特征在于:所述自組裝短肽在制備細(xì)胞三維培養(yǎng)納米支架材料中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述自組裝短肽在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
【文檔編號】A61L27/38GK104497107SQ201410739523
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】羅忠禮, 岳媛媛, 陳振銀, 李萌萌, 徐曉帆, 孫悅霖, 趙天鑫 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)