一種用于免疫治療ebv相關疾病的抗原組合物、生物制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物、包括所述抗原組合物的生物制劑及其制備方法，該生物制劑可以是預防和治療這類疾病的疫苗、藥物或活細胞制劑。本發(fā)明提供的一種新的治療鼻咽癌在內的EBV相關疾病的免疫培育EBV-CTLs的方法，該方法采用生物信息學方法，基于中國人群在HLA-A、B和DR位點等位基因表達特點，分析不同EBV病毒株，尤其包括中國廣東來源的病毒株，三種蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中可能表位的存在序列，并制備包括這些序列在內的肽段組合作為抗原，結合特定細胞因子組合，使得培養(yǎng)得到的EBV-CTLs中含有數(shù)量和種類更多的抗原特異性T細胞，尤其適用于中國人群，該方法培養(yǎng)周期短、針對性強、對腫瘤細胞殺傷作用強。
【專利說明】一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物、生物制劑 及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物、生物制劑及其制備方 法，尤其涉及一種適合于中國人群鼻咽癌治療的抗原組合物。還涉及包括所述抗原組合物 的用于免疫治療EBV相關疾病的生物制劑，該生物制劑可以是預防和治療這類疾病的疫苗 或藥物。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌是中國兩廣地區(qū)的特有疾病，與遺傳、環(huán)境和生活習慣等有相關性，尤其與 EBV (Epstein-Barr virus，EBV)關系密切。EBV為皰瘆病毒科嗜淋巴病毒屬的成員，為95% 以上的成人所攜帶，與鼻咽癌的發(fā)生有密切關系，約在90 %鼻咽癌樣本中都能檢測到EBV 基因組存在，是Epstein和Barr于1964年首次成功地將Burkitt非洲兒童淋巴瘤細胞通 過體外懸浮培養(yǎng)而建株，在建株細胞涂片中用電鏡觀察到皰瘆病毒顆粒，故而得名。
[0003] 中國南方（廣東、廣西）及東南亞是全球鼻咽癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率是低發(fā)地區(qū)的100 倍。造成這種巨大差異的原因被認為可能與以下兩個方面相關：人種遺傳差異性和EB病毒 株地區(qū)分布差異性。人類白細胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA)，即人類主要組織相 容性復合體（major histocompatiability complex，MHC)，是一組決定移植組織是否相容、 與免疫應答密切相關、緊密連鎖的基因群，是人體多態(tài)性最豐富的基因系統(tǒng)。不同HLA等位 基因的表達頻率在高加索人群和中國廣東人群中存在著較大的差異。如在高加索人群中， HLA-A位點最常表達的等位基因為A2，而在廣東人群中A11分子的表達頻率約為50 %，占絕 對優(yōu)勢。這種差異使得高加索人群和中國廣東人群在識別EBV抗原的最小單位一表位上， 存在著相當大的差異。目前已經(jīng)報道的EBV相關表位中，多數(shù)為A2、A24限制性。使得這些 結果無法直接廣泛應用于中國人群。另一方面，在廣東及東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)得許多EBV病毒 株中，與歐美地區(qū)的優(yōu)勢病毒株B95-8相比較，在一些中國人優(yōu)勢HLA分子限制性表位序列 中存在突變，使得免疫系統(tǒng)無法處理、提呈病毒抗原來引發(fā)針對EBV的免疫反應，從而使得 這些病毒引起的感染和腫瘤無法被清除。
[0004] EBV在感染宿主細胞后，可以大規(guī)模復制新的病毒顆粒，也可以長期靜息于記憶性 B細胞中，也可以轉化宿主細胞，因此形成了所謂不同的隱匿階段，表達不同的抗原。在EBV 陽性的鼻咽癌和何杰金淋巴瘤中，EBV處于所謂II型隱匿階段，僅表達三種病毒抗原，分別 為EBNA-1、LMP1和LMP2。如果能在體外篩選并擴增那些可以識別這三種抗原的特異性T淋 巴細胞，即EBV-CTLs，將這些細胞輸注給患者，恢復或提高患者原有針對EBV的細胞免疫反 應，就可以在體內殺傷腫瘤細胞，達到治療鼻咽癌的目的。
[0005] EBV-CTLs已經(jīng)被試驗性用于移植后淋巴細胞增殖性疾病，淋巴瘤和鼻咽癌的治 療。但目前所采用的培養(yǎng)方法，或者需要用EBV轉化的自體淋巴細胞系作為刺激細胞，培養(yǎng) 的時間長達數(shù)月，無法實現(xiàn)對患者的及時治療；或者采用已經(jīng)報道的表位進行選擇性分離、 刺激培養(yǎng)，由于目前已知的表位限定于少數(shù)高加索人群高頻表達HLA分子限制性，使得多 數(shù)中國人無法應用。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中的上述問題提出的。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種包括所述抗原組合物的用于免疫治療EBV相關疾病的細胞 類生物制劑及其制備方法。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0010] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物，所述 抗原組合物為不同EBV病毒株來源的三種蛋白EBNA-1、LMPl和LMP2中特定序列組成的肽 段組合。
[0011] 其中，所述肽段組合包括至少三條肽段，優(yōu)選為3-90條肽段、更優(yōu)選為89條肽 段，所述單個肽段長度優(yōu)選為15-25個氨基酸、更優(yōu)選為20-25個氨基酸，相鄰兩肽段具有 10-15個、更優(yōu)選為10-12個連續(xù)氨基酸殘基之間的重疊。
[0012] 本發(fā)明的第二個方面是提供一種用于免疫治療EBV相關疾病的生物制劑，所述生 物制劑包括上述的抗原組合物。該生物制劑可以是預防和治療這類疾病的疫苗、藥物或活 細胞制劑。
[0013] 其中，所述EBV相關疾病包括鼻咽癌、慢性活動性EBV感染、嗜血細胞綜合癥、造血 干細胞移植或器官移植后EBV感染、淋巴增殖性疾病、以及與EBV高度相關的淋巴瘤和胃癌 等。
[0014] 本發(fā)明的第三個方面是提供一種用于免疫治療EBV相關疾病的生物制劑的制備 方法，步驟包括：
[0015] 步驟1，將免疫細胞與所述抗原在液態(tài)細胞培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，從而獲得具有相應 抗原特異性免疫細胞培養(yǎng)物；
[0016] 步驟2,從步驟1中獲得的培養(yǎng)物中分離并擴增培養(yǎng)具有抗原反應性細胞；
[0017] 其中，所述的液態(tài)細胞培養(yǎng)基中，除免疫細胞和抗原外，還包括克隆抗體、細胞因 子和免疫佐劑。
[0018] 優(yōu)選地，所述免疫細胞選自：異體細胞或自體細胞的任意一種，或不經(jīng)基因改性的 免疫細胞或基因改性的免疫細胞的任意一種，或抗原提呈細胞或淋巴細胞的任意一種。
[0019] 優(yōu)選地，所述免疫細胞選自：外圍血單個核細胞、骨髓細胞、造血前趨細胞或干細 胞的任意一種或多種、或它們的衍生細胞，更優(yōu)選為外圍血單個核細胞。
[0020] 優(yōu)選地，所述具有抗原反應性細胞選自：腫瘤浸潤淋巴細胞、細胞毒T淋巴細胞和 /或樹突狀細胞，更優(yōu)選為⑶3+T淋巴細胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴細胞。
[0021] ⑶8+T和⑶4+T淋巴細胞識別的抗原有很大不同，⑶8+T細胞識別MHC I類分子提 呈的8-10個氨基酸長度的表位，而⑶4+T淋巴細胞則可以識別MHC II類分子提呈的15個 氨基酸長度或更長的表位。CD8+T細胞被認為是抗腫瘤的主要效應細胞，通過釋放穿孔素/ 顆粒酶直接殺傷腫瘤細胞，或通過死亡信號途徑，誘導腫瘤細胞的凋亡。CD4+抗原特異性T 細胞，被認為是⑶8+T細胞抗腫瘤的重要組成成分，它主要通過旁分泌、自分泌的形式，輔助 CD8+T細胞及其它的免疫細胞，如抗原提呈細胞，提高對腫瘤的免疫排斥作用達到治療腫瘤 的目的。采用供者來源EBV-CTL用于移植后淋巴增殖性疾病的臨床試驗中，提示CD4+T細 胞比例高者，可以獲得更好的臨床反應。
[0022] 本發(fā)明采用了不同細胞因子的組合，所述細胞因子選自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、 IL-12、IL-15中的任意一種或多種，其中更優(yōu)選了 GM-CSF、IL-2、IL-7的組合，使得培養(yǎng)得 到的EBV-CTLs中含有更多數(shù)量和種類的抗原反應性細胞。
[0023] 本發(fā)明采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，具有如下技術效果：
[0024] 本發(fā)明提供的一種新的治療鼻咽癌在內的EBV相關疾病的免疫培育EBV-CTLs的 方法，該方法采用生物信息學方法，基于中國人群在HLA-A、B和DR位點等位基因表達特點， 分析不同EBV病毒株，尤其包括中國廣東來源的病毒株，三種蛋白EBNA-1、LMPl和LMP2中 可能表位的存在序列，并制備包括這些序列在內的肽段組合作為抗原，結合特定細胞因子 組合，使得培養(yǎng)得到的EBV-CTLs中含有數(shù)量和種類更多的抗原特異性T細胞，尤其適用于 中國人群，該方法培養(yǎng)周期短、針對性強、對腫瘤細胞殺傷作用強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1為合成肽段位于LMP1、LMP2和EBNAl序列中的位置，其中灰色為原有蛋白序 列，黑色為B98-8序列來源肽段，空白段為⑶1和⑶2序列來源肽段。
[0026] 圖2為不同細胞因子組合條件下，EBV-CTLs對抗原的反應性，其中黑色塊代表未 去貼壁細胞組，灰色塊代表去貼壁細胞組。
[0027] 圖3為不同供者來源的EBV-CTLs對抗原肽段的反應性。
[0028] 圖4為AOlO來源EBV-CTLs對自體LCL的殺傷作用。
[0029] 圖5為本發(fā)明所述方法制備的EBV-CTLs同時包含抗原反應性⑶4和⑶8陽性細 胞的分布圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0031] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種用于免疫治療鼻咽癌在內的EBV相關疾病藥物 的制備方法，步驟包括：
[0032] 步驟1，將免疫細胞與抗原在液態(tài)細胞培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，從而獲得具有相應抗原 特異性免疫細胞培養(yǎng)物；其中，所述抗原為不同EBV病毒株來源處于III型隱匿階段所表達 的三種蛋白EBNA-I、LMPl和LMP2中特定序列組成的肽段組合；
[0033] 步驟2,從步驟1中獲得的培養(yǎng)物中分離并擴增培養(yǎng)具有抗原反應性細胞；
[0034] 其中，所述的液態(tài)細胞培養(yǎng)基中，除免疫細胞和抗原外，還包括細胞因子和免疫佐 劑。
[0035] 優(yōu)選地，所述免疫細胞選自：異體細胞或自體細胞的任意一種，或不經(jīng)基因改性的 免疫細胞或基因改性的免疫細胞的任意一種，或抗原提呈細胞或淋巴細胞的任意一種。
[0036] 優(yōu)選地，所述免疫細胞選自外圍血單個核細胞。
[0037] 其中，所述肽段組合包括至少三條肽段，優(yōu)選為3-90條肽段，所述單個肽段長度 優(yōu)選為15-25個氨基酸、更優(yōu)選為20-25個氨基酸，相鄰兩肽段具有10-15個、更優(yōu)選為 10-12個連續(xù)氨基酸殘基之間的重疊。
[0038] 所述具有抗原反應性細胞優(yōu)選為⑶3+T淋巴細胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴細胞。
[0039] 所述細胞因子選自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一種或多種， 其中更優(yōu)選了 GM-CSF、IL-2、IL-7的組合。
[0040] 1、抗原的設計與合成：
[0041] 本發(fā)明以中國人與高加索人HLA分子表達差異為出發(fā)點，分別找出中國人在 HLA-A、B和DR三個基因座中優(yōu)勢表達的5-7個等位基因，這些等位基因的表達頻率之和，超 過了該位點所有等位基因表達頻率總和的80%以上（請見下表1)。這些等位基因代表了 絕大多數(shù)人的表達情況。隨后以此為基礎，采用生物信息學方法，預測這些等位基因限制條 件下，來源于B95-8、⑶1和⑶2三種病毒株中EBNA-1、LMP1和LMP2三種抗原中可能存在的 表位。其中，GDl和GD2都是近年來自于廣東地區(qū)分離測序得到的病毒株，最能反映當?shù)亓?行的病毒株基因特征。最后，合成一系列重疊肽段，這些肽段長度在20個氨基酸左右，相鄰 兩個肽段的重疊部分為10-12個氨基酸，覆蓋所有預測表位分布區(qū)域，共需合成肽段LMPl 27段、LMP2 41段、以及EBNAl 21段（請見圖1)。
[0042] 表1中國人HLA-A、B、DR位點優(yōu)勢等位基因
[0043]
【權利要求】
1. 一種用于免疫治療EBV相關疾病的抗原組合物，其特征在于，所述抗原組合物為不 同EBV病毒株來源的三種蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中特定序列組成的肽段組合。
2. 根據(jù)權利要求1所述的抗原組合物，其特征在于，所述抗原組合物中單個肽段長度 為15-25個氨基酸。
3. 根據(jù)權利要求1所述的抗原組合物，其特征在于，所述肽段組合為89條肽段，相鄰兩 肽段具有10至15個連續(xù)氨基酸殘基之間的重疊。
4. 一種用于免疫治療EBV相關疾病的生物制劑，其特征在于，所述生物制劑包括權利 要求1所述的抗原組合物。
5. 根據(jù)權利要求4所述的生物制劑，其特征在于，所述生物制劑為疫苗、藥物或活細胞 制劑。
6. 根據(jù)權利要求4所述的生物制劑，其特征在于，所述EBV相關疾病包括鼻咽癌、慢性 活動性EBV感染、嗜血細胞綜合癥、造血干細胞移植或器官移植后EBV感染、淋巴增殖性疾 病、以及與EBV高度相關的淋巴瘤和胃癌等。
7. -種用于免疫治療EBV相關疾病的生物制劑的制備方法，其特征在于，步驟包括： 步驟1，將免疫細胞與權利要求1所述抗原在液態(tài)細胞培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，從而獲得具 有相應抗原特異性免疫細胞培養(yǎng)物； 步驟2,從步驟1中獲得的培養(yǎng)物中分離并擴增培養(yǎng)具有抗原反應性細胞； 其中，所述的液態(tài)細胞培養(yǎng)基中，除免疫細胞和抗原外，還包括克隆抗體、細胞因子和 免疫佐劑。
8. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述免疫細胞選自：異體細胞或自體 細胞的任意一種，或不經(jīng)基因改性的免疫細胞或基因改性的免疫細胞的任意一種，或抗原 提呈細胞或淋巴細胞的任意一種。
9. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述免疫細胞選自：外圍血單個核細 胞、骨髓細胞、造血前體細胞或干細胞的任意一種或多種、或它們的衍生細胞。
10. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述具有抗原反應性細胞為CD3 +T 淋巴細胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴細胞。
11. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述細胞因子選自GM-CSF、IL-2、 IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一種或多種。
【文檔編號】A61P31/22GK104491857SQ201410817936
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月24日 優(yōu)先權日:2014年12月24日
【發(fā)明者】王亞棟, 郎婧, 李曉祥 申請人:深圳市中美康士生物科技有限公司