用cgamp或cgasmp治療癌癥的方法。

背景技術(shù)：

已發(fā)現(xiàn)cgas-cgamp-sting途徑是對哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中dna的存在的細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的一部分。已鑒定了許多細(xì)胞質(zhì)dna或rna的先天傳感器(innatesensors)。參見barbergn，sting-dependentcytosolicdnasensingpathways，trendsinimmunology35：88-93(2014)。長期以來，認(rèn)為細(xì)胞溶質(zhì)中的微生物dna通過刺激i型干擾素的表達(dá)來誘導(dǎo)有力的先天免疫應(yīng)答。參見stetsondb,etal.,recognitionofcytosolicdnaactivatinganirf3-dependentinnateimmuneresponse，immunity24：93-103(2006)。搜索細(xì)胞溶質(zhì)dna傳感器首先導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)sting(也稱為mita、eris、mpys和tmem173)，其是位于er膜上的銜接蛋白并介導(dǎo)發(fā)送至細(xì)胞溶質(zhì)dna和細(xì)菌環(huán)狀二核苷酸(諸如c-di-gmp和c-di-amp)的信號。圖1；另見ishikawah.etal.,stingisanendoplasmicreticulumadaptorthatfacilitatesinnateimmunesignalling，nature455：674-8(2008)。盡管sting用作環(huán)狀二核苷酸的直接傳感器，但它不是細(xì)胞溶質(zhì)dna的直接傳感器，并且對dsdna的親和性非常低。參見wuj.etal.,innateimmunesensingandsignalingofcytosolicnucleicacids，annualreviewofimmunology32：461-88(2014)。在搜索細(xì)胞溶質(zhì)dna傳感器時，sun等人鑒定了作為sting上游的細(xì)胞溶質(zhì)dsdna傳感器的酶環(huán)狀gmp-amp合酶(cgas)。sunl,etal.,cyclicgmp-ampsynthaseisacytosolicdnasensorthatactivatesthetypeiinterferonpathway，science339：786-91(2013)。cgas被dsdna活化并催化來自atp和gtp的非經(jīng)典環(huán)狀二核苷酸2',5'cgamp(以下稱為cgamp)的合成。參見zhangx,etal.,cyclicgmp-ampcontainingmixedphosphodiesterlinkagesisanendogenoushigh-affinityligandforsting，molecularcell51：226-35(2013)；并見圖1。

cgamp用作內(nèi)源性第二信使，其經(jīng)由sting刺激i型干擾素的誘導(dǎo)。通過sting的cgamp結(jié)合導(dǎo)致蛋白激酶tbk1和轉(zhuǎn)錄因子irf3到信號復(fù)合物的募集。參見圖1；并見tanakay,etal.,stingspecifiesirf3phosphorylationbytbk1inthecytosolicdnasignalingpathway,sciencesignaling5：ra20(2012)。

信號傳導(dǎo)復(fù)合物上通過tbk1的irf3磷酸化促進(jìn)了irf3的低聚及其向細(xì)胞核的移位，在那里其與轉(zhuǎn)錄因子nf-κb共同激活ifn-β基因的轉(zhuǎn)錄。參見tanaka；并見圖1。

cgamp合成的現(xiàn)有技術(shù)方法使用化學(xué)合成方法，其包括多個步驟并使用各種修飾核苷酸。gaop,etal.,structure-functionanalysisofstingactivationbyc[g(2',5')pa(3',5')p]andtargetingbyantiviraldmxaa,cell154:748-62(2013).

然而，cgamp治療癌癥的潛力尚未被探索。本公開證實(shí)了cgamp針對某些腫瘤細(xì)胞系的直接且有效的腫瘤抑制活性。本公開還提供了使用重組人或鼠cgas催化結(jié)構(gòu)域從atp和gtp合成cgamp的高效方案和純化cgamp的有效技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本說明書，治療患者癌癥的方法包括向患有癌癥的患者施用cgamp或cgasmp并允許cgamp或cgasmp治療癌癥。在一些實(shí)施方式中，抑制癌細(xì)胞生長的方法包括：提供癌細(xì)胞群；將癌細(xì)胞暴露于cgamp或cgasmp，并允許cgamp或cgasmp抑制癌細(xì)胞的生長。

在一些實(shí)施方式中，癌癥中的sting表達(dá)水平比正常細(xì)胞中的平均水平高至少約1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25或4.5倍。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)評估患者組(poolofpatient)中的cgas水平時，cgas表達(dá)水平在較低的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的患者中。

另外，在一些方面，酶促合成cgamp的方法包括提供重組cgas并將cgas與atp、gtp和dsdna結(jié)合以合成cgamp。

在一些情況下，在合成方法中不使用修飾核苷酸，合成可在單罐中進(jìn)行，和/或合成可在單個步驟中進(jìn)行。

在一些方面，純化cgamp的方法包括：提供cgamp與選自dsdna和cgas的至少一種其它化合物的混合物；通過超濾將cgamp與dsdna和cgas分離；使用離子交換色譜法純化cgamp；并通過凍干法從cgamp中除去鹽。

在一些方面，酶促合成和純化cgamp的方法包括：提供重組cgas；將cgas與atp、gtp和dsdna結(jié)合以合成cgamp；通過超濾將cgamp與dsdna和cgas分離；使用離子交換色譜法純化cgamp；并通過冷干法從cgamp中除去鹽。

上述方法也可用于使用重組cgas從atp硫代磷酸酯和gtp合成被稱為cgasmp的cgamp的新衍生物。cgasmp不是天然產(chǎn)物。

其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分闡述，并且部分將從描述中顯而易見，或者可通過實(shí)踐來學(xué)習(xí)。這些目的和優(yōu)點(diǎn)將通過所附權(quán)利要求中特別指出的要素和組合來實(shí)現(xiàn)和獲得。

應(yīng)當(dāng)理解，前面的一般描述和以下的詳細(xì)描述僅僅是示例性和解釋性的，而不是權(quán)利要求的限制。

并入并構(gòu)成本說明書的一部分的附圖示出了一個(多個)實(shí)施方式，并與描述一起用于解釋本文所述的原理。

附圖說明

圖1提供了針對細(xì)胞溶質(zhì)dsdna的先天免疫中的cgamp/sting途徑。

圖2a-b顯示了使用重組cgas的cgamp的合成。圖2a顯示在純化之前通過離子交換色譜法分析酶促合成的cgamp。圖2b說明通過離子交換色譜法分析純化的cgamp。

圖3a-c顯示cgamp在細(xì)胞中和在小鼠中誘導(dǎo)ifn-β的表達(dá)。圖3a是顯示cdns差異化調(diào)節(jié)thp1細(xì)胞中的ifn-β誘導(dǎo)的ifn-β報(bào)告檢測。圖3b是用cgamp(黑色)和3',5'cgamp(灰色)治療的thp1細(xì)胞的ifn-βelisa。圖3c是來自注射以cgamp的小鼠的血清的ifn-βelisa。

圖4顯示多重細(xì)胞因子檢測，顯示cgamp在thp1細(xì)胞中誘導(dǎo)廣譜細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。

圖5提供了通過cgamp刺激的thp1細(xì)胞中基因表達(dá)的微陣列分析。表達(dá)水平通過相對表達(dá)水平的log2表示，從-7到7，顏色從綠色到紅色。

圖6顯示cgamp對數(shù)種人類腫瘤細(xì)胞系具有抗腫瘤活性。圖6a是顯示cgamp抑制神經(jīng)元癌細(xì)胞系sf539生長的mtt檢測。圖6b是顯示cgamp抑制腎癌細(xì)胞系a498生長的mtt檢測。對照物(白色)是來自相同類型組織的癌細(xì)胞系。

圖7a-b顯示cgamp在兩個cgamp響應(yīng)性癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)ifn-β的表達(dá)。圖7a顯示cgamp在腎癌細(xì)胞系a498中誘導(dǎo)ifn-β。圖7b顯示cgamp在cns癌細(xì)胞系sf539中誘導(dǎo)ifn-β。

圖8顯示白血病細(xì)胞系sr對cgamp治療有響應(yīng)，但對ifn-β治療無響應(yīng)。(a).用cgamp治療的白血病細(xì)胞系sr和ccrf-cem的mtt檢測。(b).用ifn-β治療的兩種白血病細(xì)胞系的mtt檢測。

圖9a-m提供了正常患者與癌癥樣品相比的sting表達(dá)水平的比較。圖中顯示，sting在癌癥患者中表達(dá)水平較高。每個圖用不同的數(shù)據(jù)集繪制。

圖10a-b顯示五種乳腺癌亞型中的cgas(也稱為mb21d)表達(dá)量(expressionmagnitude)。圖10c-f繪制了具有較低和較高量的cgas表達(dá)的患者的無復(fù)發(fā)生存(以年計(jì))的存活可能性。

圖11a-b提供了證明在某些癌癥患者中cgamp的產(chǎn)生過低的數(shù)據(jù)。圖11a顯示了具有抗cgas抗體的乳腺癌和正常乳腺組織的染色。圖11b還與正常乳腺組織相比量化了乳腺癌中cgas表達(dá)的降低。

圖12a-b提供了結(jié)構(gòu)圖，圖12a提供2'5'-cgamp的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且圖12b提供2'5'-cgasmp的化學(xué)結(jié)構(gòu)，后者是cgamp的非天然存在的衍生物。

圖13a-b顯示，cgamp和cgasmp都可以誘導(dǎo)ifn-β產(chǎn)生，但cgamp的衍生物cgasmp具有增強(qiáng)的效力。圖13a顯示用cgamp和cgasmp治療的thp1細(xì)胞的ifn-βelisa結(jié)果。圖13b顯示用cgamp和cgasmp治療的thp1細(xì)胞的ifn-β報(bào)告基因(reporter)檢測結(jié)果。cgasmp是一種非天然存在的新化合物。

圖14a顯示用cgamp和cgasmp治療的神經(jīng)元癌細(xì)胞系sf539的治療的mtt結(jié)果。圖14b顯示了用cgamp和cgasmp治療的白血病細(xì)胞系sr的mtt檢測中的結(jié)果。

圖15a-d顯示了數(shù)種體內(nèi)小鼠癌模型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其評估了cgamp與僅用載體相比在接種結(jié)腸癌、接種乳腺癌和自發(fā)性乳腺癌小鼠模型中降低腫瘤生長的能力。

具體實(shí)施方式

i.cgamp和cgasmp的酶促合成和純化

cgamp和cgasmp可使用cgas(由mb21d1基因編碼)來酶促合成。cgas可與atp(用于合成cgamp)或atp硫代磷酸酯(用于合成cgasmp)和gtp底物混合，任選地在降低非特異性相互作用的成分(諸如，鮭魚精子dna)以及緩沖劑、鹽和抗氧化劑(諸如，mgcl2、hepes緩沖劑、nacl和β-巰基乙醇)的存在下。

這種合成方法從現(xiàn)有技術(shù)提供了改進(jìn)，因?yàn)樵谀承┣闆r下，其不需要修飾核苷酸(modifiednucleotides)。其也可在單個步驟和單罐中進(jìn)行(無論是僅合成還是合成與純化方法的組合的合成部分)。

可通過離心除去樣品中的沉淀物?？赏ㄟ^超濾將cgamp與酶和dsdna分離(諸如，用具有10kd截止值的amicon離心過濾器)。cgamp可使用離子交換色譜法使用qsepharose柱進(jìn)一步純化，并用乙酸銨溶液從柱上洗脫。或者，cgamp或cgasmp可通過凝膠過濾色譜法使用superdex肽柱純化，用純水或乙酸銨溶液從柱上洗脫。如果正在制備cgasmp，則可通過一個額外的純化步驟，即使用superdex肽柱并以乙酸銨溶液(諸如0.05m)洗脫的凝膠過濾色譜法步驟，實(shí)現(xiàn)cgasmp的活性立體異構(gòu)體的純化。cgasmp可作為外消旋混合物使用，或者活性立體異構(gòu)體可單獨(dú)使用。

在一些情況下，酶促合成方法提供了高產(chǎn)率和高純度產(chǎn)物，因此產(chǎn)物可容易地通過超濾然后通過離子交換色譜法來純化。

在一些實(shí)施方式中，這種純化方案可從dsdna、cgas、atp、gtp和/或其他副產(chǎn)物純化cgamp。另外，在一些實(shí)施方式中，可通過該途徑合成和純化高達(dá)1克量的cgamp。在一些實(shí)施方式中，可制備千克級的數(shù)量，例如10千克。因?yàn)楹铣煽稍趩蝹€步驟和單罐中進(jìn)行，并且通過諸如超濾和柱色譜法的可放大技術(shù)純化，柱等的尺寸可調(diào)整到適合生產(chǎn)所需的cgamp量。這些改進(jìn)可改進(jìn)產(chǎn)率、方便性，并降低cgamp的生產(chǎn)和/或純化成本。

ii.癌癥治療方法

a.癌癥類型

在一個實(shí)施方式中，所述方法包括通過向患有癌癥的患者施用cgamp或cgasmp并允許cgamp或cgasmp治療癌癥來治療癌癥的方法。在一個實(shí)施方式中，所述癌癥具有升高的sting表達(dá)水平。在另一個實(shí)施方式中，所述癌癥具有降低的cgas表達(dá)水平。在另一個實(shí)施方式中，所述癌癥同時具有升高的sting表達(dá)水平和降低的cgas表達(dá)水平。

升高的sting表達(dá)水平可比正常細(xì)胞中平均水平至少高約1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25或4.5倍。可使用免疫組織化學(xué)染色通過使用對sting具有特異性的抗體將癌癥樣品中的sting表達(dá)水平與正常患者組中的正常水平相比較，所述對sting具有特異性的抗體可軛合到能使其視覺可見的部分(諸如酶，包括堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，或者熒光基團(tuán)，諸如熒光素或若丹明)上。正常的患者組數(shù)據(jù)可存儲在數(shù)據(jù)庫中，并可以用于在不同時間點(diǎn)比較癌癥標(biāo)本。

cgas/mb21d1催化atp和gfp以產(chǎn)生cgamp，后者用作sting的配體。由于sting在癌癥中過表達(dá)，并且盡管不受理論約束，cgas在某些癌癥中可能無法正常表達(dá)，或者可能無法正常發(fā)揮功能。在某些癌癥中，與正?；颊呦啾然蚺c其他癌癥樣本相比，cgas水平降低。較低的cgas水平與較差的效果相關(guān)，較高的cgas水平與更積極的效果相關(guān)。因此，恢復(fù)腫瘤中cgas途徑的水平可能有助于通過與sting相關(guān)的途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長。

當(dāng)評價患有癌癥的患者組或者同時包括癌癥患者和正常患者的受試者組中的cgas水平時，降低的cgas表達(dá)水平可以在較低的約75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的患者中。75％患者具有較低表達(dá)的cgas水平將被設(shè)定為一個標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@種低cgas表達(dá)人群具有降低的存活率。

至少在以下癌癥類型中證實(shí)了升高的sting表達(dá)：白血病(包括，但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和前b型急性淋巴細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(包括，但不限于活化b細(xì)胞樣彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性t細(xì)胞淋巴瘤、alk陽性、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤、t-細(xì)胞/組織細(xì)胞豐富的大b細(xì)胞淋巴瘤、生發(fā)中心b細(xì)胞樣彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤)，胃癌(彌漫性胃腺癌、胃腸型腺癌和胃混合腺癌)，食管癌(巴雷特食管、食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌)，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，胚胎癌，混合型生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，畸胎瘤，卵黃囊瘤，睪丸畸胎瘤，甲狀腺癌，腎癌，黑素瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，舌癌，乳腺癌，口腔癌，口咽癌，扁桃體癌。

b.施用劑量和途徑

cgamp或cgasmp可通過多種施用途徑施用給有此需要的患者。在一個實(shí)施方式中，cgamp或cgasmp可通過腸胃外施用途徑施用，包括但不限于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、大腦內(nèi)、腦室內(nèi)(intracerebroventicular)、鞘內(nèi)和皮下。在另一個實(shí)施方式中，cgamp或cgasmp可通過吸入、局部或口服提供。

cgamp或cgasmp可制備成藥物制劑。在一個實(shí)施方式中，可使用無菌鹽水制備藥學(xué)上可接受的制劑。cgamp或cgasmp也可以制備成凍干形式，并在施用給患者之前溶解于無菌鹽水中用于注射。

約0.1至約1mg/kg體重的劑量可用于治療患者。在一些實(shí)施方式中，劑量可為約0.1mg/kg、0.5mg/kg或1.0mg/kg。

實(shí)施例

實(shí)施例1.cgamp的酶促合成和純化

a.重組cgas的表達(dá)和純化

人和鼠cgas(分別稱為hcgas和mcgas)的cdna克隆購自openbiosystemsinc.。將hcgas和mcgas的全長和催化結(jié)構(gòu)域亞克隆到帶有n端6xhis然后是sumo標(biāo)簽的修飾pet-28(a)(novagen)載體中。將重組his6-sumo-hcgas(157-522)和his6-sumo-mcgas(142-507)在用1mm異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)中于15℃表達(dá)整夜。

離心收獲細(xì)胞，并將其再懸浮于ph8.0的含有50mmtris、300mmnacl的裂解緩沖劑中。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物以4000rpm離心10分鐘并收集上清液。將樣品以16,000rpm再離心30分鐘。然后將上清液裝載在ni-nta柱上，并用ph7.5的含有500mmnacl、20mmtris、25mm咪唑的緩沖劑洗滌。蛋白質(zhì)用ph7.6的含有約250mm咪唑、150mmnacl、20mmtris-hcl的緩沖劑洗脫。匯集含有cgas的部分，并向樣品中加入5mmdtt。sumo標(biāo)簽用sumo蛋白酶切割過夜。通過sds-page分析樣品以證實(shí)切割完成。將切割后的cgas樣品使用superdex200(16×60)柱(gehealthcare)再次濃縮并純化，對于人cgas可用ph7.5的含有20mmtris-hcl、500mmnacl的緩沖劑洗脫柱，對于小鼠cgas可用ph7.5的含有20mmtris-hcl、150mmnacl的緩沖劑洗脫。來自凝膠過濾柱的部分通過sds-page分析，匯集含有cgas的部分，并向樣品中加入5mmβ-巰基乙醇。將經(jīng)純化的cgas濃縮至約15mg/ml，等分，在液氮中冷凍，并儲存在-80℃。重組酶的產(chǎn)率為每升細(xì)菌培養(yǎng)物約4mg。這些酶用于cgamp的生物合成。

b.cgamp的酶促合成和純化

用于生物合成cgamp的反應(yīng)混合物含有10μm重組cgas、0.2mg/ml鮭魚精子dna、5mmatp、5mmgtp、5mmmgcl2、ph7.5的20mmhepes緩沖劑、150mmnacl和10mmβ-巰基乙醇。將混合物在37℃下培養(yǎng)12小時，直到atp和gtp的底物被耗盡。使用monoq柱(gehealthcare)通過離子交換色譜法分析樣品以證實(shí)cgamp的形成。然后通過以4000xg離心15分鐘將樣品澄清，以除去反應(yīng)期間形成的不溶性沉淀物。使用具有10kd孔徑的離心過濾器(millipore)通過超濾從反應(yīng)產(chǎn)物中分離出酶和dsdna。使用qsepharose柱通過離子交換色譜法進(jìn)一步純化cgamp(圖2)。在用0.1m乙酸銨溶液洗滌后，用含有0.3m乙酸銨的溶液從柱洗脫cgamp。將洗脫的cgamp凍干并儲存在-80℃。在最佳反應(yīng)條件下，超過80％的atp和gtp轉(zhuǎn)化為cgamp。對于每毫克所用重組cgas，cgamp的產(chǎn)率為約5mg。該方案已經(jīng)被常規(guī)地用于在實(shí)驗(yàn)室中以50-100mg規(guī)模合成cgamp，并且可以根據(jù)不同需要擴(kuò)展到更大規(guī)模。

實(shí)施例2.cgamp刺激ifn-β和其它細(xì)胞因子的表達(dá)

a.cgamp誘導(dǎo)細(xì)胞和小鼠中的ifn-β表達(dá)

為證實(shí)cgamp可誘導(dǎo)ifn-β的表達(dá)，我們用加入到培養(yǎng)基中的cgamp和其他三種環(huán)狀二核苷酸刺激人單核細(xì)胞thp1藍(lán)細(xì)胞。我們觀察到cgamp在誘導(dǎo)ifn-β報(bào)告的表達(dá)方面非常有效(圖3a)。相比之下，3',5'cgamp具有較低的活性(圖3a)。環(huán)狀di-amp和c-di-gmp表現(xiàn)出甚至更低的活性(圖3a)。為了證實(shí)這些結(jié)果，我們通過elisa分析培養(yǎng)上清液中的ifn-β水平。我們觀察到thp1細(xì)胞對cgamp的快速響應(yīng)。ifn-β的誘導(dǎo)在刺激后8-10小時達(dá)到峰值(圖3b)。相比之下，對3',5'cgamp的響應(yīng)要弱得多(圖3b)。此外，我們分析了小鼠中cgamp對ifn-β的誘導(dǎo)。我們觀察到在以100μg/小鼠的劑量靜脈內(nèi)(i.v.)注射cgamp(圖3c)后，小鼠中的快速響應(yīng)。

b.cgamp上調(diào)廣譜的細(xì)胞因子和趨化因子

作為先天免疫的新型第二信使，只知道cgamp刺激i型干擾素的表達(dá)。我們的nf-κb報(bào)道檢測顯示cgamp或cgas的過度表達(dá)也刺激nf-κb的活化?？赡艿?，通過cgamp刺激sting也可調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子或趨化因子的誘導(dǎo)。實(shí)際上，我們通過多重細(xì)胞因子檢測觀察到thp1細(xì)胞中cgamp對il-8、tnf-α、groa、ip-10、mcp-1、mcp-2和rantes的上調(diào)(圖4)。然而，cgamp不會上調(diào)il-iβ的表達(dá)，il-iβ是主要的炎性細(xì)胞因子。

為了研究cgamp對全基因組基因表達(dá)的影響，我們在用20μg/mlcgamp治療4小時和8小時后進(jìn)行thp1細(xì)胞的微陣列分析。這些微陣列數(shù)據(jù)顯示，cgamp上調(diào)超過200個基因，其中許多是干擾素誘導(dǎo)基因和各種細(xì)胞因子基因(圖5)。

實(shí)施例3.cgamp的抗腫瘤活性

a.cgamp的抗腫瘤活性

首先，我們通過等溫滴定量熱法(itc)證實(shí)了cgamp和人sting之間的結(jié)合相互作用。配體結(jié)合研究表明，cgamp以約60nm的親和力結(jié)合人sting，這是其對細(xì)菌環(huán)狀二核苷酸c-di-gmp的結(jié)合親和力的50倍。接下來，我們使用酶促合成的cgamp進(jìn)行nci60抗腫瘤篩選。在測試的六十個人類癌細(xì)胞系(nci60)中，單劑量的10μmcgamp有效抑制cns癌細(xì)胞系sf539、腎癌細(xì)胞系a498和白血病細(xì)胞系sr的生長；然而，僅測試了一個濃度，并且初始測試選擇的濃度可能太低。預(yù)期更高的劑量將在更多數(shù)量的測試細(xì)胞系中提供有益的結(jié)果。

所測試的細(xì)胞系是：nsclc_ncih23、nsclc_ncih522、nsclc_a549atcc、nsclc_ekvx、nsclc_ncih226、nsclc_ncih332m、nsclc_h460、nsclc_hop62、nsclc_hop92、colon_ht29、colon_hcc-2998、colon_hct116、colon_sw620、colon_colo205、colon_hct15、colon_km12、breast_mcf7、breast_mcf7adrr、breast_mdamb231、breast_hs578t、breast_mdamb435、breast_mdn、breast_bt549、breast_t47d、ovar_ovcar3、ovar_ovcar4、ovar_ovcar5、ovar_ovcar8、ovar_igrovl、ovar_skov3、leuk_ccrfcem、leuk_k562、leuk_molt4、leuk_hl60、leuk_rpmi8266、leuk_sr、renal_uo31、renal_sn12c、renal_a498、renal_caki1、renal_rxf393、renal_7860、renal_achn、renal_tk10、melan_loximvi、melan_malme3m、melan_skmel2、melan_skmel5、melan_skmel28、melan_m14、melan_uacc62、melan_uacc257、prostate_pc3、prostate_du145、cns_snb19、cns_snb75、cns_u251、cns_sf268、cns_sf295和cns_sf539。

我們重現(xiàn)了nci60篩選結(jié)果，并證實(shí)了cgamp在三種癌細(xì)胞系中的抗腫瘤活性。在這些研究中，使用來自相同類型組織的三個不響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系作為對照。在驗(yàn)證了nci60篩選的數(shù)據(jù)后，我們對這三種腫瘤細(xì)胞系和三種對照細(xì)胞系進(jìn)行了mtt檢測，并觀察到相似的結(jié)果(圖6和8a)。這些結(jié)果清楚地表明，cgamp對某些類型的人類腫瘤細(xì)胞具有直接的腫瘤抑制活性。

b.cgamp誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中ifn-β的表達(dá)

為了檢查sting介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在cgamp的抗腫瘤活性中是否發(fā)揮作用，我們分析了可用于nci60細(xì)胞系的微陣列數(shù)據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)響應(yīng)cgamp的三種細(xì)胞系表達(dá)較高水平的sting，而對照細(xì)胞系表達(dá)較低水平的sting。來自nci的60個細(xì)胞系的微陣列數(shù)據(jù)顯示與我們使用的無響應(yīng)對照細(xì)胞系相比，cgamp響應(yīng)性腫瘤細(xì)胞系中sting的水平較高。這表明sting介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可能在cgamp的抗腫瘤活性中起關(guān)鍵作用。與這些觀察結(jié)果一致，我們觀察到在兩種響應(yīng)性細(xì)胞系中cgamp誘導(dǎo)的ifn-β(圖7)。相比之下，在測試的兩個對照細(xì)胞系中ifn-β的誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)?圖7)。這些數(shù)據(jù)表明cgamp/sting途徑可能參與cgamp的抗腫瘤活性。

為了檢測cgamp誘導(dǎo)的ifn-β是否介導(dǎo)抑制腫瘤生長，我們用單獨(dú)的cgamp或ifn-β治療了三種腫瘤細(xì)胞系。我們觀察到ifn-β抑制了兩種腫瘤細(xì)胞系的生長，并且在所測試的濃度下幾乎與cgamp一樣有效。然而，白血病細(xì)胞系sr對cgamp治療有強(qiáng)烈響應(yīng)(圖8a)，但對ifn-β治療沒有很好的響應(yīng)(圖8b)。對照白血病細(xì)胞系ccrf-cem也沒有對cgamp或ifn-β的治療作出響應(yīng)(圖8b)。這些數(shù)據(jù)表明，雖然ifn-β在cgamp的腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用，但cgamp誘導(dǎo)的其他因子也在某些類型的癌細(xì)胞的腫瘤抑制中起重要作用。

實(shí)施例4.識別表現(xiàn)出升高的sting表達(dá)的癌癥類型

不受理論的約束，我們認(rèn)為cgamp通過sting依賴性途徑來執(zhí)行其抗腫瘤功能。為了支持這個看法，我們分析了某些全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫。使用許多公開存檔的全基因組基因表達(dá)陣列進(jìn)行分析，以檢查sting基因的表達(dá)。比較人類癌癥標(biāo)本與正常組織。使用可從lifetechnologies、thermofisherscientific獲得的research生物信息學(xué)平臺進(jìn)行分析。

該分析的結(jié)果示于圖9a-m中。在以下癌癥類型中發(fā)現(xiàn)sting表達(dá)增加：白血病(包括，但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和前b型急性淋巴細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(包括，但不限于活化b細(xì)胞型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性t細(xì)胞淋巴瘤、alk陽性、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤、t-細(xì)胞/組織細(xì)胞豐富的大b細(xì)胞淋巴瘤、生發(fā)中心b細(xì)胞樣彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤)，胃癌(彌漫性胃腺癌、胃腸型腺癌和胃混合腺癌)，食管癌(巴雷特食管、食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌)，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，胚胎癌，混合性生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，畸胎瘤，卵黃囊瘤，睪丸畸胎瘤，甲狀腺癌，腎癌，黑素瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，舌癌，乳腺癌，口腔癌，口咽癌，扁桃體癌和肝硬化肝。

實(shí)施例5.癌癥中降低的cgas表達(dá)的說明

以乳腺癌為例，我們已經(jīng)表明，腫瘤中cgas基因的平均表達(dá)與正常組織(a)相似。與其他亞型(b)相比，her2亞型顯示出顯著降低的cgas表達(dá)?；谀[瘤中的cgas表達(dá)，我們將患者分為兩組或三組。當(dāng)評估一組患有癌癥的患者或一組包括癌癥患者和正常患者的受試者的cgas水平時，降低的cgas表達(dá)水平可能在較低的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的患者中。具有高cgas表達(dá)的較高的75％的患者具有改善的無復(fù)發(fā)生存率，較低的25％具有最差的結(jié)果(c)。luminala和b亞型均為雌激素受體陽性(er+)和低級別，luminala腫瘤生長非常緩慢，luminalb腫瘤生長更具侵襲性。侵襲性luminalb亞型是異質(zhì)和復(fù)雜的疾病，并且經(jīng)常發(fā)展對現(xiàn)有療法的抵抗。亞型b中較高的25％的患者的高cgas表達(dá)顯示增加的無復(fù)發(fā)存活(d)的明顯益處。該結(jié)果表明腫瘤具有異質(zhì)表達(dá)模式。

恢復(fù)腫瘤中cgas的水平可能有助于通過sting依賴性途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長。因此，降低的cgas表達(dá)和/或升高的sting表達(dá)可以幫助患者選擇。

實(shí)施例6.人類乳房標(biāo)本染色

來自正?；颊叩娜橄俳M織和乳腺癌組織用抗cgas抗體染色以顯示cgas的水平。本研究中使用的福爾馬林固定的和石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本來自lipogenllc的組織庫。手術(shù)前所有腫瘤均為原發(fā)性和未治療的，具有完整的臨床病理信息。腫瘤大小定義為在手術(shù)時在腫瘤標(biāo)本上測量的最大腫瘤直徑。檢查標(biāo)本的h&e染色部分，并由專家婦科病理學(xué)家確診。所有標(biāo)本都是匿名的，組織按照機(jī)構(gòu)審查委員會規(guī)定收集。一些癌組織包括相鄰的正常組織。

在石蠟包埋的組織塊上進(jìn)行srebp1的ihc染色。檢查蘇木精和伊紅(h&e)染色以確保癌組織和正常上皮細(xì)胞。在5μm厚的切片上進(jìn)行cgas的ihc染色。簡言之，將組織載玻片用二甲苯脫蠟并通過分級醇系列再水化。通過在3％過氧化氫溶液中培養(yǎng)15分鐘來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。通過將載玻片浸入10mm檸檬酸鈉緩沖劑(ph6.0)中來進(jìn)行抗原修復(fù)，并將在亞沸點(diǎn)溫度保持5分鐘。將載玻片在磷酸鹽緩沖劑中沖洗，并與10％正常血清一起培養(yǎng)以阻斷非特異性染色。然后，載玻片于4℃在加濕室中與初級抗體(來自sigma的抗cgas，目錄號hpa031700)培養(yǎng)整夜。

所有染色均由對樣品來源不知情的病理學(xué)家使用半定量方法進(jìn)行評估。每個標(biāo)本根據(jù)核酸和細(xì)胞質(zhì)染色的強(qiáng)度分配得分?；陉栃约?xì)胞的總百分比和染色強(qiáng)度(1+、2+或3+)對組織進(jìn)行評分(h評分)，其中h＝(％x1)+(％“2+”×2)+(％“3+”×3)。在計(jì)算h評分時評估至少100個細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)分析。通過單因素方差分析(多重比較)比較乳腺癌和相鄰正常組織間cgas染色強(qiáng)度的連續(xù)變量的方法。用mann-whitneyu測試評估乳腺癌臨床病理特征與cgas染色強(qiáng)度的比較。所有統(tǒng)計(jì)測試均為雙側(cè)的，且p值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析使用spss13.0軟件(spssinc.)進(jìn)行。

由于cgas涉及生產(chǎn)cgamp，較低水平的cgas導(dǎo)致cgamp的水平較低。乳腺癌組織樣本顯示抗cgas抗體染色減少。參見圖11a。

ccas表達(dá)量被定量，結(jié)果提供在圖11b中，表明與正常的乳腺組織相比，乳腺癌中的cgas表達(dá)降低。

實(shí)施例7.cgasmp的合成和純化

制備2'5'-cgamp的衍生物2'5'-cgasmp，并且在圖12a-b中提供了兩種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。cgasmp可使用與實(shí)施例1中針對cgamp所述的類似方案從atp硫代磷酸酯和gtp合成。底物(atp硫代磷酸酯和gtp)的濃度用于cgasmp合成為1mm，從用于合成cgamp的方案改進(jìn)以提高cgasmp的產(chǎn)率；然而，與現(xiàn)有方案相比，cgas濃度沒有變化。cgasmp的活性立體異構(gòu)體的純化通過一個額外的純化步驟實(shí)現(xiàn)，即使用乙酸銨溶液(0.05m)洗脫的superdex肽柱的凝膠過濾色譜法步驟。凝膠過濾色譜法顯示純化的cgasmp立體異構(gòu)體結(jié)合sting，而cgasmp的另一種立體異構(gòu)體不結(jié)合sting。因此，cgasmp可作為外消旋混合物使用，或者活性立體異構(gòu)體可單獨(dú)使用。

實(shí)施例8.cgasmp在誘導(dǎo)ifn-β表達(dá)方面比cgamp更有效

圖13a-b顯示，cgamp和cgasmp均可誘導(dǎo)thp1細(xì)胞中的ifn-ββ產(chǎn)生，但是cgasmp(cgamp的硫代磷酸酯衍生物)具有增強(qiáng)的效力。用5和25μg/ml的cgamp和cgasmp治療的thp1細(xì)胞的ifn-βelisa顯示cgasmp可誘導(dǎo)5-10倍高的ifn-β水平(圖13a)。與這些結(jié)果一致，我們還觀察到在用0.2至25μg/ml的cgamp和cgasmp處理的thp1細(xì)胞中誘導(dǎo)ifn-β報(bào)告基因的表達(dá)時，cgasmp比cgamp更有效(圖13b)。

實(shí)施例9.cgamp和cgasmp的抗腫瘤活性

使用mtt檢測以顯示cgamp和cgasmp都具有抗癌活性。

a.mtt檢測中使用的試劑

mtt溶液：pbs中的5mg/ml噻唑藍(lán)溴化四唑(mtt)。加入mtt后將溶液過濾滅菌，儲存于-20℃；mtt溶劑：4mmhcl、0.1％nondetp-40(np40)的異丙醇。cgamp或cgasmp溶液：pbs中含10-30mg/ml，使用0.2μm過濾器過濾滅菌。

b.對于附著癌細(xì)胞系sf539、u251、a498和achn的mtt檢測

在第一天，將一個t-25燒瓶進(jìn)行胰蛋白酶化，并向細(xì)胞中加入5ml完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞和培養(yǎng)基在無菌15ml離心管中以300xgrcf在浮桶式轉(zhuǎn)頭中離心5分鐘。去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞再懸浮于1.0ml完全rpmi1640培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞并記錄。用完全的rpmi培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋(cv＝cv)至每毫升75,000個細(xì)胞。將100μl細(xì)胞(7500個總細(xì)胞)加入到96孔板的每個孔中并培養(yǎng)整夜。24小時后，向每個孔中加入100μl培養(yǎng)基或cgamp或cgasmp溶液。在第五天，向每個孔中加入5mg/ml的mtt20μl。一組含有mtt但沒有細(xì)胞的孔作為對照。所有步驟都是無菌完成。將孔在co2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)3.5小時。移出培養(yǎng)基，注意不要打擾細(xì)胞。不進(jìn)行pbs沖洗。加入150μlmtt溶劑。用箔覆蓋板，并在軌道振蕩器上攪拌細(xì)胞15分鐘。使用平板讀數(shù)器在590nm處測量吸光度。每次檢測重復(fù)5次。

c.非附著癌細(xì)胞系sr或ccrf-cem的mtt檢測

將細(xì)胞在無菌15ml離心管中以300xgrcf在浮桶式轉(zhuǎn)頭中離心5分鐘。取出培養(yǎng)基，將細(xì)胞再懸浮于1.0ml完全rpmi1640培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞并記錄。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋(cv＝cv)至每毫升100,000個細(xì)胞。將100μl細(xì)胞(10000個總細(xì)胞)加入到96孔板的每個孔中并培養(yǎng)整夜。24小時后，向每個孔中加入100μl培養(yǎng)基或cgamp或cgasmp溶液。在第五天，向每個孔中加入20μl5mg/ml的mtt。一組含有mtt但沒有細(xì)胞的孔作為對照。將孔在co2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)3.5小時。從每個孔中取出150μl培養(yǎng)基，注意不要打擾細(xì)胞。不進(jìn)行pbs沖洗。加入150μlmtt溶劑。僅在需要時，才需要上下移液以完全溶解mtt甲瓚晶體。用箔覆蓋板，并在軌道振蕩器上攪拌細(xì)胞15分鐘。使用平板讀數(shù)器在590nm處測量吸光度。每次檢測重復(fù)5次。

圖14a顯示用cgamp和cgasmp治療的神經(jīng)元癌細(xì)胞系sf539的mtt治療結(jié)果。圖14b顯示了用cgamp和cgasmp治療的白血病細(xì)胞系sr的mtt檢測中的結(jié)果。這些圖表明，cgamp和cgasmp都在評估的神經(jīng)元和白血病細(xì)胞系中具有抗腫瘤活性，并且cgasmp在較低濃度下對細(xì)胞活性的影響一般較大。

實(shí)施例10.cgamp抑制體內(nèi)腫瘤生長

a.結(jié)腸癌模型的體內(nèi)評估

通過皮下注射分別在5-6周齡的balb/c和c57b/j小鼠的兩側(cè)植入結(jié)腸癌ct26和mc38細(xì)胞。植入結(jié)腸癌細(xì)胞后14天開始治療，并對具有100-200mm³大小的腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。通過每天一次腫瘤內(nèi)注射4mg/kg的濃度施用cgamp，持續(xù)連續(xù)三天。治療期后，測量腫瘤生長7天，且每隔一天測量腫瘤大小的倍數(shù)變化。圖15a(結(jié)腸癌ct26細(xì)胞植入balb/c小鼠)和圖15b(結(jié)腸癌mc38細(xì)胞植入c57b/j小鼠)中顯示了后處理第7天的結(jié)果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cgamp施用有效減少腫瘤生長。

b.乳腺癌模型的體內(nèi)評估

通過皮下注射在5-6周齡的balb/cnu/nu小鼠的兩側(cè)植入乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞。監(jiān)測腫瘤生長14天，并使用連續(xù)卡尺測量檢查生長速率。使用方程(axb²)/2計(jì)算腫瘤體積，其中“a”和“b”分別是腫瘤的長度和寬度。植入乳腺癌細(xì)胞后第14天開始治療。當(dāng)腫瘤生長至100-200mm³時，連續(xù)七天以10mg/kg的濃度施用cgamp。治療期后，測量腫瘤生長7天，并且每隔一天測定腫瘤大小的倍數(shù)變化。圖15c顯示了后處理第7天的結(jié)果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cgamp施用有效減少腫瘤生長，p值為0.0058。

c.乳腺癌模型的體內(nèi)評估

mmtv-balb-neut小鼠構(gòu)成了大鼠her-2/neu乳腺癌的侵襲性模型，為自發(fā)性乳腺癌提供了有效的模型。這些小鼠在小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子/增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)未活化的neu。在約8個月腫瘤達(dá)到200mm³時，根據(jù)腫瘤大小對小鼠進(jìn)行分組。通過每天一次腫瘤內(nèi)注射連續(xù)三天，以每只小鼠0.1mg的濃度施用cgamp。在載體(veh.)和cgamp治療之間進(jìn)行比較。監(jiān)測腫瘤生長4天，并使用連續(xù)卡尺測量檢查生長速率。使用方程(axb²)/2計(jì)算腫瘤體積，其中“a”和“b”分別是腫瘤的長度和寬度。實(shí)驗(yàn)完成后，切除腫瘤，分析腫瘤體積差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖15d顯示后處理第4天的結(jié)果。這些體內(nèi)結(jié)果表明，cgamp施用對于減少腫瘤生長和減少腫瘤尺寸都有效，p值為0.0009。

實(shí)施例11.其它實(shí)施方式

其它實(shí)施方式可在以下編號的項(xiàng)目中找到。

項(xiàng)目1.治療患者癌癥的方法，包括向患有癌癥的患者施用cgamp或cgasmp并允許cgamp或cgasmp治療癌癥。

項(xiàng)目2.抑制癌癥細(xì)胞生長的方法，包括：

a.提供癌細(xì)胞群；

b.將癌細(xì)胞暴露于cgamp或cgasmp；和

c.允許cgamp或cgasmp抑制癌細(xì)胞的生長。

項(xiàng)目3.根據(jù)項(xiàng)目1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中癌癥中的sting表達(dá)水平比正常細(xì)胞中的平均水平高約1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25或4.5倍。

項(xiàng)目4.根據(jù)項(xiàng)目1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)評估患者組的cgas水平時，cgas表達(dá)水平在較低的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的患者中。

項(xiàng)目5.根據(jù)項(xiàng)目1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中患者組僅是癌癥患者。

項(xiàng)目6.根據(jù)項(xiàng)目1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中患者組是癌癥患者和正?；颊邇烧摺?/p>

項(xiàng)目7.根據(jù)項(xiàng)目1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中癌癥為cns癌、腎癌或淋巴瘤。

項(xiàng)目8.根據(jù)項(xiàng)目7所述的方法，其中cns癌為成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

項(xiàng)目9.根據(jù)項(xiàng)目7所述的方法，其中腎癌為腎臟腫瘤。

項(xiàng)目10.根據(jù)項(xiàng)目1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中癌癥為白血病(包括，但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和前b型急性淋巴細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(包括，但不限于活化b細(xì)胞樣彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性t細(xì)胞淋巴瘤、alk陽性、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤、t-細(xì)胞/組織細(xì)胞豐富的大b細(xì)胞淋巴瘤、生發(fā)中心b細(xì)胞樣彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤)，胃癌(彌漫性胃腺癌、胃腸型腺癌和胃混合腺癌)，食管癌(巴雷特食管、食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌)，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，胚胎癌，混合性生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，畸胎瘤，卵黃囊瘤，睪丸畸胎瘤，甲狀腺癌，腎癌，黑素瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，舌癌，乳腺癌，口腔癌，口咽癌和扁桃體癌。

項(xiàng)目11.根據(jù)項(xiàng)目1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中癌癥細(xì)胞離體篩選以確定cgamp或cgasmp是否會抑制癌癥細(xì)胞的生長。

項(xiàng)目12.根據(jù)項(xiàng)目1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中在cgamp或cgasmp施用于患者之前，離體篩選癌癥細(xì)胞以確定cgamp或cgasmp是否將誘導(dǎo)ifn-β的表達(dá)。

項(xiàng)目13.根據(jù)項(xiàng)目1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括向患者施用0.1至1mg/kg的cgamp或cgasmp。

項(xiàng)目14.酶促合成cgamp或cgasmp的方法，包括：

a.提供重組cgas；和

b.將cgas與atp或atp硫代磷酸酯、gtp和dsdna結(jié)合

以合成cgamp或cgasmp。

項(xiàng)目15.根據(jù)項(xiàng)目14所述的方法，其中在合成方法中使用修飾性核苷酸。

項(xiàng)目16.根據(jù)項(xiàng)目14-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中合成可以在單罐中進(jìn)行。

項(xiàng)目17.根據(jù)項(xiàng)目14-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中合成可以在單一步驟中進(jìn)行。

項(xiàng)目18.純化cgamp或cgasmp的方法，包括：

a.提供cgamp或cgasmp與選自dsdna和cgas的至少一種其它化合物的混合物；

b.通過超濾將cgamp或cgasmp與dsdna和cgas分離；

c.使用離子交換色譜法純化cgamp或cgasmp；和

d.通過凍干法從cgamp或cgasmp中除去鹽。

項(xiàng)目19.酶促合成和純化cgamp或cgasmp的方法，包括：

a.提供重組cgas；

b.將cgas與atp或atp硫代磷酸酯、gtp和dsdna結(jié)合以合成cgamp；

c.通過超濾將cgamp或cgasmp與dsdna和cgas分離；

d.使用離子交換色譜法和任選的凝膠過濾色譜法純化cgamp或cgasmp；和

e.通過凍干法從cgamp或cgasmp中除去鹽。

項(xiàng)目20.根據(jù)項(xiàng)目14-17或19中任一項(xiàng)所述的方法，其中cgas與atp或atp硫代磷酸酯和gtp在減少非特異性相互作用的成分的存在下結(jié)合。

項(xiàng)目21.根據(jù)項(xiàng)目20所述的方法，其中減少非特異性相互作用的成分是鮭魚精子dna。

項(xiàng)目22.根據(jù)項(xiàng)目14-17或19-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中cgas與atp和gtp在至少一種緩沖劑、鹽和/或抗氧化劑的存在下結(jié)合。

項(xiàng)目23.根據(jù)項(xiàng)目22所述的方法，其中至少一種緩沖劑是hepes緩沖劑。

項(xiàng)目24.根據(jù)項(xiàng)目22-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種鹽是mgcl2和/或nacl。

項(xiàng)目25.根據(jù)項(xiàng)目22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種抗氧化劑是β-巰基乙醇。

項(xiàng)目26.根據(jù)項(xiàng)目18-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中沉淀物通過以4000xg離心15分鐘除去。

項(xiàng)目27.根據(jù)項(xiàng)目18-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中超濾通過具有10kd孔徑的超濾過濾器發(fā)生。

項(xiàng)目28.根據(jù)項(xiàng)目18-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中離子交換色譜法采用qsepharose柱。

項(xiàng)目29.根據(jù)項(xiàng)目18-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中qsepharose柱用含有乙酸銨的揮發(fā)性鹽緩沖劑洗脫。

等同物

認(rèn)為上述書面說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤?shí)施方式。上述描述和實(shí)施例詳細(xì)說明了某些實(shí)施方式并描述了本發(fā)明人預(yù)期的最佳模式。然而，應(yīng)當(dāng)理解，無論前述內(nèi)容在文中如何詳細(xì)地描述，實(shí)施方式可以以許多方式實(shí)施，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)所附權(quán)利要求及其任何等同物來解釋。

如本文所使用的，術(shù)語“約”是指數(shù)值，包括例如整數(shù)、分?jǐn)?shù)和百分比，無論是否明確指出。術(shù)語“一般地”是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)為等同于所列舉的值的數(shù)值范圍(例如，所述范圍的+/-5-10％)(例如，具有相同的功能或結(jié)果)。在某些情況下，術(shù)語“約”可以包括四舍五入到最接近的有效數(shù)字的數(shù)值。