專利名稱：抗甾醇疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于使人或動物對甾醇免疫或超免疫的免疫反應(yīng)活性組合物及其方法。更體地說，本發(fā)明是關(guān)于抗膽甾醇和膽甾醇衍生物、麥角甾醇和麥角甾醇衍生物的疫苗。本發(fā)明可用于降低免疫的人或動物的血清膽甾醇水平、并阻止或減小由飲食中膽甾醇的攝入或其它因素所導(dǎo)致的動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化斑的嚴(yán)重性。另外，本發(fā)明涉及用于免疫和超免疫人和動物抗真菌感染的具有免疫反應(yīng)活性的麥角甾醇組合物和該組合物用于人和動物的方法。本發(fā)明還涉及含有抗麥角甾醇抗體的乳制品。高濃度的血清膽甾醇在動脈粥樣硬化和相關(guān)疾病如冠狀動脈粥樣硬化心臟病、動脈粥樣硬化腦血管疾病、腎病等的發(fā)病機(jī)理中有明顯的致病作用。而且認(rèn)為血液膽甾醇濃度的降低與動脈粥樣硬化血管疾病的好轉(zhuǎn)是相關(guān)的(Goodman，D.S.等，ReportoftheNationalCholesterolEducationProgramExpertPanelonDetertion，Evaluation，andTretmentofHighBloodCholesterolinAdults.Arch.Intern.Med.14836-69，1988;Kromhout，D.等，Serumcholesteroland25-yearincidenceofandmortalityfrommyocardialinfractionandcancer.(見TheZutphenStudy.Arch.Intern.Med.1481051-1055，1988))。在1984年，全國健康協(xié)會發(fā)展研討小組(aNationalInstitutesofHealthconsensusdevelopmentconferencepanel)提出了進(jìn)行檢查和治療高膽甾醇血癥的框架?；谶@項研究，全國膽甾醇教育計劃委員會(NationalCholesterolEducationProgram)向成年人做出了著名的建議“了解你的膽甾醇值”(Luepker，P.V.等，RecommendationsRegardingPubilcsceeningformeasuringbloodcholesterol.SummaryofaNationalHeart，Lung，andBloodInstituteWorkshop，October1988.Arch.Intern.Med.1492650-2654，1989)。
用以達(dá)到降低血清膽甾醇濃度的傳統(tǒng)方法是通過減少膽甾醇和其它脂肪的飲食攝入，和用降低血液膽甾醇的藥物治療血膽甾醇過多的病人。血液膽甾醇濃度與和作為膽甾醇載體的血漿脂蛋白濃度有關(guān)的體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制特別相關(guān)。從動脈粥樣硬化的危險率的角度上看，通常說的危險的脂蛋白是指低密度脂蛋白(LDL).LDL的濃度由細(xì)胞膜上的LDL受體的活性所調(diào)節(jié)，特別是在肝臟中(見Brown，M.S.和Goldstein，J.L.Areceptor-mediatedpathwayforcholesterolhomeostasis.Science23234-47，1986).許多使用藥物降低血液膽甾濃度的策略涉及到干擾由LDL產(chǎn)生膽甾醇的過程。通過飲食降低膽甾醇的含量受到許多因素的制約，藥物降低膽甾醇經(jīng)常伴隨著意外的副作用。其它各種變化因素，如基因背景，緊張和年齡，無論那種情況都能影響膽甾醇的濃度。降低膽甾醇的其它方法希望具有對身體健康有利的效果，特別是對那些在動脈粥樣硬化疾病發(fā)生明顯進(jìn)展之前就接受治療的病人。
就我們所知，人還從未對膽甾醇主動免疫。對膽甾醇主動免疫的安全性和對血清膽甾醇濃度或飲食中脂類的攝入造成的動脈粥樣硬化的發(fā)展的可能影響還沒有確定。已經(jīng)證實根據(jù)個體的血清，人血清中通常確實含有不同量的”天然產(chǎn)生”的膽甾醇抗體。(見Alving等，NaturallyoccurringautoantibodiestoCholesteralinhumans.Biochem.Soc.Trans.17637-639(1989))。但是這種“天然產(chǎn)生”的抗體與血清膽甾醇濃度或動脈粥樣硬化還沒有發(fā)現(xiàn)存在任何關(guān)系。
天然產(chǎn)生膽甾醇的抗體可能是老化過程中一個正常部分，可能有助于(而非改善)動脈粥樣硬化(Alving，C.R.Antibodiestoliposomes，phospholipids，andcholesteralImplicationsforautoimmunity，atherosclerosis，andaging.HorizonsinMembranceBio-technology，Nicolau，C.和Chapman，D.，editors，Wiley-Liss，pp.41-411990)。
雖然本發(fā)明者沒有發(fā)現(xiàn)使人對膽甾醇免疫的現(xiàn)有技術(shù)，但在文獻(xiàn)中有一關(guān)于嘗試用免疫的方法改善兔子的高膽甾醇血癥和動脈粥樣硬化的描述。Bailey等用由膽甾醇結(jié)合牛血清白蛋白組成的抗原免疫兔子(見Bailey等，Immunizationwithasyntheticcholesterol-esterantigenandinducedatherosclerosisinrabbits.Nature201407-408(1964)).Bailey等指出“利用界面沉淀技術(shù)測定的抗效體價為17000”，但并沒有嘗試產(chǎn)生或測定膽甾醇的特異性抗體。分析抗原是由原來的結(jié)合構(gòu)成，并非單獨的膽甾醇或膽甾醇作為另一結(jié)合的部分。Bailey等沒有述及他們的誘導(dǎo)了膽甾醇抗體，也沒有述及產(chǎn)生了膽甾醇抗體或這些抗體在降低血清膽甾醇濃度或改善動脈粥樣硬化中起作用。
Bailey等觀察到飼以高膽甾醇飲食的免疫動物可以降低高膽甾醇血癥和減少動脈粥樣硬化斑形成。但是，在缺少更多的資料的情況下，抗體效價可能完全是對牛血清白蛋白部分，通過非特異性機(jī)制，如通過白蛋白對血清中的膽甾醇的非特異性吸收，膽甾醇-白蛋白結(jié)合可以簡單地降低膽甾醇。白蛋白具有相當(dāng)程度的疏水性，可以作為一種反應(yīng)物用以促進(jìn)膽甾醇在含水介質(zhì)如血清中的溶解，這些事實支持了后一種解釋。Bailey等公開的內(nèi)容太不充分，還不能得出實驗結(jié)果中膽甾醇抗體所起作用的免疫學(xué)的結(jié)論。也許正是因為如此，Bailey等沒有敘及這一作用。
本發(fā)明的另一具體實施方案是關(guān)于預(yù)防和治療人和動物的真菌感染。在那些免疫功能降低的個體中，例如患有艾滋病，癌癥及由于事故或外科手術(shù)造成創(chuàng)傷，衰弱性代謝病如糖尿病，及血液暴露于環(huán)境微生物中的人例如植入靜脈導(dǎo)管的病人，甚至在一些老年人中，血液和組織的真菌感染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的、甚至威脅生命的病情。在那些發(fā)展成全身真菌感染的癌癥患者中死亡率是很高的。在另一些情況下，大量的人由于暴露于環(huán)境中，一般通過空氣導(dǎo)入肺部的真菌或類真菌感染是常見的。后一類型的感染的例子包括源自加利福尼亞的SanJoaquin的和Flagstaff，Arizona地區(qū)的球孢子菌病;在Midwest是很平常的組織胞漿菌病。其它能在免疫缺陷(immunocompromised)病人中導(dǎo)致嚴(yán)重傳染病的其它常見類型的真菌或類真菌感染，包括芽生菌病、隱球菌病、念珠菌病和支原體感染如結(jié)核病。
據(jù)觀察，在白血病和淋巴瘤病人中，真菌是最普遍的非菌感染的原因，假絲酵母(candida)菌株和曲霉屬(Aspergillus)在癌癥病人中是最常見的真菌種類。估計這兩種感染總死亡率為20%(LopezBerestein，G.，Metha，R.，Hopfer，R.，Metha，K.，Herrsh，E.M.，和Juliano，R.，CancerDrugDelivery，137-42，1983)。某些其它的具有寄生特性的生物，例如利什曼原蟲(leishmaniasis)與真菌感染的致病特性、行為和病理學(xué)類似。
能夠引起上述疾病的生物的共同特征是麥角甾醇作為主要或唯一的甾醇而存在，而非膽甾醇。膽甾醇是哺乳動物細(xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)的主要甾醇。在這些生物中麥角甾醇具有多種在哺乳動物中膽甾醇所具有的膜相關(guān)的生理學(xué)功能。質(zhì)膜的脂雙層中膽甾醇和麥角甾醇的濃度的改變對膜的流動性和滲透性有很大影響，麥角甾醇的存在對于某些微生物的生存是關(guān)鍵的，就象膽甾醇的存在對于哺乳動物細(xì)胞生存是重要的一樣。在許多植物中發(fā)現(xiàn)的主要的甾醇化合物是麥角甾醇，而不是膽甾醇，這一點證實了麥角甾醇巨大的重要性。除了哺乳動物膜以外，其它任何膜中都很少能發(fā)現(xiàn)膽甾醇，在各種細(xì)菌中很難發(fā)現(xiàn)膽甾醇和麥角甾醇。
而且，已知哺乳動物在乳汁中濃縮抗體，包括初乳(產(chǎn)后首先產(chǎn)生的乳汁)和后來產(chǎn)生的乳汁。在干酪的制造中，抗體可以濃縮在乳清中，早已證明，如具有腸毒素的革蘭氏陰性大腸桿菌或其CFA-1，CFA-2菌毛的抗原對奶牛的免疫作用導(dǎo)致產(chǎn)生大量抗完整菌體和/或其感染性菌毛的抗體。攝入飼養(yǎng)的產(chǎn)奶動物產(chǎn)生的奶制品，包括乳清、濃縮乳清和其它奶制品，表明可獲得受體動物的被動免疫?？贵w可以經(jīng)受胃酸并成功地保存下來，在胃腸系統(tǒng)中作用以調(diào)理攝入的抗原，形成抗體-微生物復(fù)合物，并無害地排泄出來。
所需要的是能用于使人或動物對甾醇如膽甾醇或麥角甾醇免疫的方法和組合物。通過給人或動物接種抗體膽甾醇疫苗，可以廉價安全地降低血液膽甾醇濃度，通過給人或動物接種抗麥角甾醇疫苗，人或動物可以更好地抵抗真菌感染，而且通過給產(chǎn)奶動物接種抗麥角甾醇疫苗，產(chǎn)奶動物產(chǎn)生的乳汁將含有高濃度的抗麥角甾醇抗體。結(jié)果，該乳汁和由此而來的其它乳制品將對真菌有抗性，可用于被動免疫人或動物。
本發(fā)明包括含甾醇的疫苗和可以有效地使人對甾醇如膽甾醇或麥角甾醇免疫的方法。在一個具體表實施方案中，本發(fā)明包括可用于使人對甾醇免疫，通過免疫過程本身或結(jié)合其它用于降低膽甾醇的常規(guī)方法以降低血清膽甾醇濃度的疫苗配方。
一個適用的配方例子為含有磷脂酰膽堿、膽甾醇和脂質(zhì)A的脂質(zhì)體，其摩爾比大約為2∶5∶0.02(這里脂質(zhì)A的摩爾數(shù)是根據(jù)天然脂質(zhì)A中的磷酸酯的摩爾數(shù)計)。但這一比率并不嚴(yán)格，因為其它的比率也能成功達(dá)到同樣的效果。非脂質(zhì)體的其它轉(zhuǎn)運(yùn)載體也同樣適用，包括微膠囊、微球體、脂球體、聚合物和緩釋劑都能代替脂質(zhì)體被使用。一種免子實驗已經(jīng)證明了本發(fā)明的抗膽甾醇疫苗可以改善飲食誘導(dǎo)的血清膽甾醇的提高。
本發(fā)明的另一具體實施方案為降低食用動物的膽甾醇含量。本發(fā)明可用于給食用動物接種抗膽甾醇疫苗，藉以降低食用動物的血清膽甾醇和動物肉中的膽甾醇濃度。
本發(fā)明的第二個方面包括含有麥角甾醇的脂質(zhì)體或其它轉(zhuǎn)運(yùn)組合物及其使用方法。這些組合物可用于免疫人和動物，以預(yù)防和治療真菌感染。本發(fā)明的另一具體實施方案中，脂質(zhì)體組合物還可以含有脂質(zhì)A。
所以本發(fā)明的一個目的是提供使人或動物對甾醇免疫的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供使人或動物對膽甾醇及其衍生物免疫的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供使人或動物對麥角甾醇及其衍生物免疫的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供增加人或動物對真菌的抵抗力的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是減少食用動物肉中膽甾醇含量的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供使產(chǎn)奶動物對麥角甾醇免疫的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的就是提供含有高濃度抗麥角甾醇抗體的乳制品。
在閱讀過下列揭示的具體實施方案和附屬權(quán)利要求的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的這些和其它目的、特點和優(yōu)點將變得很明顯。
附圖的簡要說明

圖1描述了膽甾醇的結(jié)構(gòu)圖2描述了麥角甾醇的結(jié)構(gòu)本發(fā)明是指用于使人或動物對甾醇(更具體地對膽甾醇和/或麥角甾醇及這兩種化合物的衍生物)免疫的方法和組合物。本發(fā)明使用脂質(zhì)體和其它相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體技術(shù)有效地使人或動物對目的甾醇免疫。
在此使用的“大約”一詞是指在所述數(shù)字的5%的范圍內(nèi)。例如“大約1∶2.5”意思是比率為大約一份比大約2.5份，每一組分為所述值的大約±5%。
任何能摻入甾醇，特指膽甾醇或麥角甾醇，或二者之結(jié)合的，在給人和動物給藥時，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗膽甾醇或麥角甾醇抗體的轉(zhuǎn)運(yùn)載體都可以用于本發(fā)明。這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要作為抗原載體，易于將甾醇遞呈到免疫系統(tǒng)，藉以引發(fā)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答。推測任何已建立的用于誘導(dǎo)抗底物或大分子的抗體的方法，在理論上都適用于誘導(dǎo)抗膽甾醇的抗體。
膽甾醇的免疫原性可以通過佐劑(例如脂質(zhì)A或其它佐劑)和免疫所用的甾醇的表位密度來加強(qiáng)。通過使用各種轉(zhuǎn)運(yùn)載體和膽甾醇與蛋白質(zhì)或其它大分子的高密度結(jié)合或締合，可能會達(dá)到高膽甾醇表位密度。本發(fā)明的疫苗中可用的轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括但并不局限于生物相容-生物可降解或生物相容-非生物可降解的脂質(zhì)體、脂球體、聚合物和緩釋劑如微球體和微膠囊及其聯(lián)合。這些和本領(lǐng)域熟知的相似轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以用來給人或動物轉(zhuǎn)運(yùn)甾醇，特別是膽甾醇和/或麥角甾醇。相似的轉(zhuǎn)運(yùn)載體是那些與作為甾醇如膽甾醇或麥角甾醇的載體具有相同功能，可將甾醇遞呈到個體的免疫系統(tǒng)的載體，將此組合物給藥物后可產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
本發(fā)明的組合物可以選擇性地包括任何本領(lǐng)域已知的能激發(fā)和增強(qiáng)對膽甾醇和麥角甾醇的免疫應(yīng)答的佐劑或佐劑混合物。例如佐劑可包括(但并不局限于)摻入到脂質(zhì)體中的親脂性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑及其混合物。優(yōu)選佐劑為脂質(zhì)A。
當(dāng)膽甾醇被用于構(gòu)成本發(fā)明的疫苗時，將降低免疫個體的血清膽甾醇濃度，延緩動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化斑的嚴(yán)重程度。組成抗膽甾醇疫苗的配方含有膽甾醇或膽甾醇和磷脂酰膽堿;或膽甾醇和二肉豆蔻?；字Ｄ憠A及合適的佐劑。膽甾醇和磷脂酰膽堿或二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的摩爾比大約在0.75∶1至9∶1的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的具體實施方案中，膽甾醇和磷脂酰膽堿或二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的比為5∶2。
除摻入到脂質(zhì)體中的未結(jié)合的麥角甾醇優(yōu)選量為膽甾醇的1/13外，含麥角甾醇的免疫疫苗組合物按上述方法制備。因此麥角甾醇和磷脂酰膽堿或二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的摩爾比大約為0.058∶1至大約0.69∶1。優(yōu)選比率為0.19∶1。本發(fā)明中有用的脂質(zhì)包括形成中間相的脂質(zhì)。任何受真菌感染、能產(chǎn)生抗體的人或動物，或者任何準(zhǔn)備免疫抵抗真菌感染并能產(chǎn)生抗體的人或動物能都能使用抗麥角甾醇疫苗。
本發(fā)明涉及的動物是那些家畜例如肉牛、奶牛、豬、山羊、綿羊、雞和馬。更進(jìn)一步說，產(chǎn)奶動物如奶牛和雞可被免疫以產(chǎn)生含有抗麥角甾醇的抗體的乳制品?？果溄晴薮嫉漠a(chǎn)品和它們在乳汁中的濃縮物(雛雞的情況下是在蛋中的濃縮物)將出現(xiàn)在乳制品中(例如嬰兒配方、奶、干酪、黃油、冰淇淋、酸奶酪)，當(dāng)攝食這些乳制品時，會使受體產(chǎn)生抗真菌病的被動免疫。
另外，從免疫乳汁或蛋中精制的乳制品或抗體可被制成治療陰道念珠菌病的沖洗劑。另外，胃腸真菌感染正在增長，據(jù)估計患有胃腸念珠菌病的占美國人口的10%。這一問題由于長期使用抗生素如青霉素、紅霉素、四環(huán)素等而加重。攝入從接種抗麥角甾醇疫苗的產(chǎn)奶動物得到的乳制品可導(dǎo)致使念珠菌屬和其它真菌被無害地排泄。這些產(chǎn)品還可應(yīng)用于局部治療皮膚真菌感染。這些抗麥角甾醇的乳制品的另一個好處就是對真菌降解具有抗性，因此可以增加貯存和上架時間，減少損失。
免疫接種可以在哺乳動物中產(chǎn)生有效的對抗麥角固醇的免疫力。因為麥角甾醇不是哺乳動物組織中正常的脂類組分，而是主要在植物、真菌和寄生蟲中發(fā)現(xiàn)，這一免疫過程可導(dǎo)致產(chǎn)生對含有麥角甾醇的真菌和寄生蟲的保護(hù)性免疫的疫苗。
雖非局限于下面的理論，但相信可假定本發(fā)明的含有麥角甾醇的脂質(zhì)體和可能的脂質(zhì)A可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗麥角甾醇和其它形式的免疫力。雖然就我們所知，抗脂類和T細(xì)胞還未被證實存在，但我們推測這種T細(xì)胞確實存在。免疫后，T輔助淋巴細(xì)胞將在抗麥角甾醇IgG抗體產(chǎn)生過程中起中介細(xì)胞的作用，可使抗麥角甾醇的免疫記憶得以增殖。另外，其它形式的免疫也可被誘導(dǎo)，包括IgM、IgA抗體和特異性抗麥角甾醇的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。
產(chǎn)生這一疫苗的一個主要障礙是高度特異性免疫的產(chǎn)生。眾所周知，抗結(jié)合有載體分子的甾醇化合物所增殖的抗體經(jīng)常和具有相似結(jié)構(gòu)的甾醇發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)，甚至和未用于免疫接種的甾醇結(jié)構(gòu)之間的交叉反應(yīng)比用于免疫接種的結(jié)構(gòu)更強(qiáng)。在其它地方可查閱這一內(nèi)容(Frank，M.，Structuralaspectsofsterol-antibodyspecificity，J.SteroidBiochem.2895-108，1987)。這種抗體的交叉反應(yīng)基礎(chǔ)在于所有抗體對應(yīng)的靶化合物都具有相似的類環(huán)戊烷多氫菲多環(huán)的甾醇結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，觀察圖1和圖2分別所示的膽甾醇和麥角甾醇的結(jié)構(gòu)，非常明顯地，環(huán)結(jié)構(gòu)上許多抗原決定簇是相似的或相同的，而且無法預(yù)測哪些抗原決定簇是真正具有的免疫優(yōu)勢的。
具有更高特異性和低交叉反應(yīng)性的抗麥角甾醇抗體可通過阻遏3-羥基片段而產(chǎn)生。因為在理論上膽甾醇的3-羥基片段是其分子上的唯一的極性基團(tuán)，因此它很可能是脂雙層界面暴露于水中的基團(tuán)，相信這一基團(tuán)位于膽甾醇的免疫優(yōu)勢基團(tuán)內(nèi)。阻遏這一基團(tuán)增強(qiáng)對環(huán)結(jié)構(gòu)上其它基團(tuán)的識別的免疫特異性，從而對麥角甾醇具有更高的免疫特異性。麥角甾醇的3-羥基基團(tuán)可通過多種方法阻遏，包括加入酯化基團(tuán)或其它直接與3-羥基位點反應(yīng)的化學(xué)試劑。而且，也可加入其它基團(tuán)到非?？拷麮-3區(qū)的位點，以產(chǎn)生空間阻礙作用而阻止那個區(qū)域免疫性的產(chǎn)生。類似地，那些直接與麥角甾醇分子反應(yīng)的分子、如皂苷或大環(huán)內(nèi)酯多烯類抗生素(例如菲律賓菌素、兩性霉素或制霉菌素)也會同樣通過阻遏麥角甾醇A環(huán)C-3位的免疫性而產(chǎn)生對麥角甾醇的定向效果，從而提高了環(huán)上其它位點的免疫特異性的識別。
通過下面的例子可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的任何限制。相反，應(yīng)清楚地認(rèn)識到本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所以藉此提出各種其它實施方案、修改和相應(yīng)方法，而不脫離本發(fā)明的精神和附屬權(quán)利要求的范圍。
實施例Ⅰ抗膽甾醇疫苗膽甾醇疫苗包括作為活性成分的A.轉(zhuǎn)運(yùn)載體，和B.(ⅰ)膽甾醇;或(ⅱ)膽甾醇和佐劑;或(ⅲ)膽甾醇，磷脂酰膽堿和佐劑;或(ⅳ)膽甾醇，二肉豆蔻?；字Ｄ憠A和佐劑;或(ⅴ)膽甾醇和磷脂酰膽堿;或(ⅵ)膽甾醇和二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿。
用常規(guī)方法制備脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體載有膽甾醇(含約70%膽甾醇)和可能還含有脂質(zhì)A作為佐劑，用以注射，此脂質(zhì)體用Swartz等(Antibodiestocholesterol.Proc.Nat.Acal.Sci.851902-1906，1988)和Alving等(美國專利No.4，885，256，1989年12月5日公開)的方法制備，以上文獻(xiàn)并入這里作為參考。應(yīng)該認(rèn)識到存在多種載有膽甾醇或麥角甾醇的脂質(zhì)體配方，可用于實施本發(fā)明。
實施例Ⅱ用于對膽甾醇免疫的優(yōu)選脂質(zhì)體，含有二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(DMPC)/膽甾醇(CHOL)/二肉豆蔻?；字；视?DMPG)/脂質(zhì)A(對兔或人，摩爾比約為0.9/2.5/0.1/0.02(71%CHOL)，或?qū)θ藙t約為0.9/0.75/0.1/0.02(43%CHOL)，其中脂質(zhì)A的摩爾數(shù)以脂質(zhì)A磷酸酯計)?？捎玫米許higellaflexneri的氯仿可溶解部分中的脂質(zhì)A。作為71%膽甾醇脂質(zhì)體一部分而注射的脂質(zhì)A的總劑量為50μg脂質(zhì)A。脂質(zhì)體膽甾醇濃度用百分比表示，這是參照(DMPC+DMPG)計算摩爾百分比;如，膽甾醇/(DMPC+DMPG)比為0.75/1時就相當(dāng)于43%，2.5/1則相當(dāng)于71%。
實施例Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)ELISA在微量滴定板的孔底部，用結(jié)晶膽甾醇進(jìn)行。加乙醇溶液，將結(jié)晶膽甾醇涂布在聚苯乙烯板的孔表面上(Immunlon96.“U”形底，Dynatech實驗室，Alexandria，VA)，在通風(fēng)廚中蒸發(fā)溶劑。不在同一天使用時，將此板在高真空下進(jìn)一步干燥，并在-30℃保存。板中加入含有10%熱滅活(56°，30分鐘)胎牛血清(FBS)(M.A.Bioproducts，Walkersville，MD)的磷酸緩沖鹽水(PBS137mMNaCl/2.7mMKCl/9.6mM磷酸，pH7.2)進(jìn)行封閉。每次10分鐘洗滌孔三次來完成。經(jīng)含10%FBS的PBS稀釋的，50μl含單克隆抗體的腹水加入這些孔中，并在室溫孵育1小時。微滴定板用PBS洗滌三次，每次5分鐘。向板中加入50μl羊抗鼠IgM(mμ-鏈)堿性磷酸酯酶結(jié)合體，濃度為每ml含10%FBS的PBS中含1μg，并室溫孵育1小時。再用PBS洗滌板三次，每次5分鐘。向板中加入50μl底物對硝基苯磷酸酯，其在二乙醇胺緩沖液(Kirkegaard和Perry實驗室)中的濃度為2mg/ml，并室溫孵育30分鐘。板用TitertekMultiscan(Flow實驗室)在405nm掃描，以測定光學(xué)活性。報道數(shù)據(jù)是減去既無抗原又無單克降抗體的空白孔的值后的校正值。
實施例Ⅳ進(jìn)行了旨在決定改善由飲食引起的兔高膽甾醇血癥和動脈粥樣硬化的可行性的實驗。幾組兔對膽甾醇免疫，而另外組別沒有免疫，至少一組免疫兔和一組未免疫兔飼以富含膽甾醇的飲食。免疫方法改善了富膽甾醇飲食預(yù)期產(chǎn)生的高膽甾醇血癥和動脈粥樣硬化。下述的免實驗實驗結(jié)果提供了支持我們的預(yù)言的實質(zhì)性證據(jù)，實驗表明1%膽甾醇飲食一周內(nèi)(免疫兔初始免疫后6周)引起血清膽甾醇水平劇增，第二周(免疫動物初始免疫后7周)膽甾醇水平繼續(xù)升高。但在對膽甾醇免疫的動物(Ⅱ組)中飲食引起的膽甾醇增高的水平低30%。
免疫記錄四組兔或用含71mol%膽甾醇的脂質(zhì)體免疫，或不免疫。免疫通過肌內(nèi)或靜脈進(jìn)行，每兩周一次，共6周。此免疫程序一般在兔中產(chǎn)生抗體，用ELISA或補(bǔ)體誘導(dǎo)的對高膽甾醇脂質(zhì)體的免疫損害來測定，上述方法見Swartz等Antibodiestocholesterol.Proc.Nat.Acad.Sci.851902-1906，1988，和Alving等美國專利No4，885，256，1989年12月5日公開，兩者均并入此作為參考。
實驗飲食免疫后6周開始飼以實驗飲食。飲食或為普通兔食或為1%膽甾醇飲食(來自Bioserve)。使用四組和兩分組動物Ⅰ組，4只兔，未免疫，飼以正常飲食;Ⅱa組，4只兔，肌內(nèi)免疫，飼以1%膽甾醇飲食;Ⅱb，2只兔，靜脈免疫，飼以1%膽甾醇飲食;Ⅲ組，4只兔，未免疫，飼以正常飲食;Ⅳa組，4只兔，肌內(nèi)免疫，飼以正常飲食;Ⅳb，2只兔，靜脈免疫，飼以正常飲食。
結(jié)果列于表Ⅰ的實驗結(jié)果表明高膽甾醇飲食總引起血清膽甾醇值升高。但進(jìn)指定飲食后2周(第7周)，免疫組(Ⅱ組)膽甾醇升高比未免疫組(Ⅰ組)膽甾醇升高值少30%。
表Ⅰ對膽甾醇免疫的兔中飲食誘導(dǎo)的高膽甾醇血癥的減輕高膽甾醇組別a飲食b免疫c采血時間血清膽甾醇與第5周相比增長值的降(周)(mg/dl)的增長值低率(%)I--576II-+562III--573IV-+583I+-6775699II++6797734III--664IV-+668I+-712051129II++795279030III--774IV-+762a所示數(shù)據(jù)為實驗結(jié)果平均值(Ⅰ組，4只兔;Ⅱ，6只兔;Ⅲ4只兔;Ⅳ6只兔)b實驗開始后第5周，開始飼以1%膽甾醇飲食c0周開始對膽甾醇的免疫接種。
本發(fā)明還包括使人或動物對其它甾醇如麥角甾醇免疫或超免疫的疫苗。與上述相似的方法可用于制備對其它甾醇的疫苗。下面的實施例表示使人或動物對麥角甾醇免疫的優(yōu)選通用疫苗組合物。
實施例Ⅴ抗麥角甾醇疫苗麥角甾醇疫苗包括作為活性成分的A.轉(zhuǎn)運(yùn)載體和B.(ⅰ)麥角甾醇;或(ⅱ)麥角甾醇和佐劑;或(ⅲ)麥角甾醇、磷脂酰膽堿和佐劑;或(ⅳ)麥角甾醇、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A和佐劑;或(ⅴ)麥角甾醇和磷脂酰膽堿;或(ⅵ)麥角甾醇和二肉豆蔻?；柞ヵＤ憠A。
實施例Ⅵ對麥角甾醇免疫脂質(zhì)體可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備，其中載有麥角甾醇的注射用脂質(zhì)體用Swarty等(Anribodiestocholesterol.Proc.Nat.Acad.Sci.851902-1906，1988和Alving等(美國專利No.4.885，356)的方法制備，上述兩篇文獻(xiàn)并入這里作為參考。此麥角甾醇脂質(zhì)體的麥角甾醇和脂質(zhì)間的摩爾比為上述膽甾醇脂質(zhì)體的1/13。因此，含麥角甾醇脂質(zhì)體中的麥角甾醇∶脂質(zhì)比為約0.058∶1到約0.69∶1。優(yōu)選的麥角甾醇脂質(zhì)體中的麥角甾醇∶酯質(zhì)比為0.19∶1。脂質(zhì)體可能含有脂質(zhì)A作為佐劑?？膳c脂質(zhì)A結(jié)合使用或代替脂質(zhì)A的其它佐劑的例子為(但不限于此)整合在脂質(zhì)體中的親脂性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、和氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑。
實施例Ⅶ酶聯(lián)免疫吸附試(ELISA)ELISA在微量滴定板的孔底部，用麥角甾醇作為抗原進(jìn)行。例如加乙醇溶液，將麥角甾醇涂布在聚苯乙烯板的孔表面上(Immunlon96，"U"形底，Dynatech實驗室，Alexandria，VA)，在通風(fēng)廚中蒸發(fā)溶劑。不在同一天使用時，將此板在高真空下進(jìn)一步干燥，并在-30℃保存。用任何適合的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的封閉方法對此板封閉。例如板中加入含有10%熱滅活胎牛面清(FBS)(M.A.Bioproducts，Walkersville，MD)的磷酸緩沖鹽水(PBS137mMNaCl/2.7mMKCl/9.6mM磷酸，PH7.2)來封閉。每次10分鐘洗滌孔二次來完成。
經(jīng)含10%FBS的PBS稀釋的，50μl含單克隆抗體的腹水加入這些涂布的孔中，并在室溫孵育1小時，來完成抗體聯(lián)結(jié)。微滴定板用PBS洗滌三次，每次5分鐘。向板中加入50μl羊抗鼠IgM(mμ-鏈)堿性磷酸酯酶結(jié)合體(Kirkegaard和Perry實驗室，Gaithersburg，MD)，濃度為每ml含10%FBS的PBS中含1μg，并室溫孵育1小時。再用PBS洗滌此板三次，每次5分鐘。向板中加入50μl底物對硝基苯磷酸酯，其在二乙醇胺緩沖液(Kirkegaard和Perry實驗室)中的濃度為2mg/ml，并室溫孵育30分鐘。板用TitertekMultiscan(Flow實驗室)在405nm掃描，以測定光學(xué)活性。報道數(shù)據(jù)是減去既無抗原又無單克降抗體的空白孔的值后的校正值。
實施例Ⅷ麥角甾醇免疫記錄使用膽甾醇疫苗所用的相似免疫記錄。四組兔或用含約5mol%麥角甾醇的脂質(zhì)體免疫或不免疫。免疫可用肌內(nèi)或靜脈方法進(jìn)行，每兩周一次，共6周。
實施例Ⅸ真菌攻擊第6周時，用真菌感染攻擊動物。任何普通真菌可滿足此目的。然后檢查免疫和非免疫的動物，以決定是否感染或感染程度如何。
給小鼠注射致死真菌(如曲霉菌或假絲酵母菌)并可按Ahmad等，IndianJournalofBiochemistry&Biophysics，Vol.26，pp.351-356，1989的方法觀察到阻止死亡的保護(hù)作用，上述文獻(xiàn)并入這里作為參考。
簡要地說，給雄性BALB/C小鼠(體重20-25g)注射含不同數(shù)量真菌孢子的0.17μl0.15m鹽水。1.8×107曲菌孢子的孢子劑量足以引起可傳播的真菌感染。對其它真菌，需要不同的孢子劑量以產(chǎn)生可傳播的真菌感染。
真菌孢子劑量通過尾部注射給小鼠。孢子攻擊24小時后，將動物隨機(jī)地每15只分成一組。一組接受無膽質(zhì)體處理，另一組受單獨脂質(zhì)體處理，一組受含甾醇脂質(zhì)體處理，最后一組則不受處理。處理的效果在存活率和肺中菌落形成單元(CFU)的基礎(chǔ)上進(jìn)行評價。處死動物，無菌條件下取出左肺以測定CFU。將肺均漿化，將一系列稀釋物鋪在營養(yǎng)平板上。培養(yǎng)24小時后將菌落計數(shù)。
當(dāng)然，應(yīng)該認(rèn)識到，上述只涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，這里可進(jìn)行許多修飾或改變，而不離開本發(fā)明的精神和附屬權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.疫苗，其中含有轉(zhuǎn)運(yùn)載體及與之結(jié)合的甾醇，它可使人體對甾醇免疫或超免疫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體選自生物相容-可生物降解性聚合物、生物相容-非生物可降解性聚合物、脂質(zhì)體、脂質(zhì)球、緩釋物質(zhì)及它們的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體為脂質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中脂質(zhì)體含有選自磷脂酰膽堿和二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿的脂質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗，其中脂質(zhì)體含有磷脂酰膽堿。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗，其中脂質(zhì)體含有二肉豆蔻?；字Ｄ憠A。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中還含有佐劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其中佐劑為脂質(zhì)A。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中還含有佐劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的疫苗，其中佐劑為脂質(zhì)A。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中甾醇為膽甾醇或其衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的疫苗，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體為脂質(zhì)體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗，其中脂質(zhì)體含有選自磷脂酰膽堿和二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的脂質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其中脂質(zhì)體含有磷脂酰膽堿。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其中脂質(zhì)體含有二肉豆蔻?；字Ｄ憠A。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的疫苗，其中還含有佐劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗，其中佐劑為脂質(zhì)A。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中甾醇為麥角甾醇或其衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的疫苗，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體為脂質(zhì)體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其中脂質(zhì)體含有選自磷脂酰膽堿和二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的脂質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其中脂質(zhì)體含有磷脂酰膽堿。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其中脂質(zhì)體含有二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的疫苗，其中還含有佐劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的疫苗，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗，其中佐劑為脂質(zhì)A。
29.使人對膽甾醇免疫以治療或預(yù)防高膽甾醇血癥或動脈粥樣硬化的治療方法，其中包括給人體使用足以使個體對膽甾醇免疫的有效劑量的疫苗，此疫苗含有轉(zhuǎn)運(yùn)載體和膽甾醇或其衍生物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體為脂質(zhì)體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中脂質(zhì)體含有選自磷脂酰膽堿和二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的脂質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中脂質(zhì)體含有磷脂酰膽堿。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中脂質(zhì)體含有二肉豆蔻?；字Ｄ憠A。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中還含有佐劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中佐劑為脂質(zhì)A。
37.使人或動物對麥角甾醇免疫以治療或預(yù)防真菌感染的治療方法，其中包括給真菌感染的人或動物使用足以使人或動物對麥角甾醇免疫的有效劑量的疫苗，此疫苗含有轉(zhuǎn)運(yùn)載體和麥角甾醇或其衍生物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中轉(zhuǎn)運(yùn)載體為脂質(zhì)體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中脂質(zhì)體含有選自磷脂酰膽堿和二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的脂質(zhì)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中脂質(zhì)體含有磷脂酰膽堿。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中脂質(zhì)體含有二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中還含有佐劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中佐劑選自脂溶性胞壁酰二肽衍生物、非離子嵌段聚合物、氫氧化鋁、磷酸鋁和脂質(zhì)A。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中佐劑為脂質(zhì)A。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于免疫反應(yīng)活性組合物和使人或動物對甾醇，如膽甾醇免疫的方法，及它們在降低免疫個體血清膽甾醇水平、延緩或減小由攝取食物中膽甾醇引起的動脈粥樣硬化或硬化斑的嚴(yán)重程度中的用途。本發(fā)明的另一實施方案包括含有麥角甾醇的組合物，它可用于治療或預(yù)防真菌感染，及其使用方法。本發(fā)明的另一方面是由按照本發(fā)明對麥角甾醇免疫的產(chǎn)乳動物產(chǎn)生的、含有抗麥角甾醇抗體的乳制品，及其制備方法。
文檔編號A61K47/24GK1093255SQ9312149
公開日1994年10月12日 申請日期1993年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月29日
發(fā)明者C·R·阿爾溫格, G·M·斯瓦茲, J·肯納 申請人:恩特雷麥德有限公司