專利名稱：減數(shù)分裂活化甾醇增大著床率的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改善所獲得的與體外受精和前成胚轉(zhuǎn)移處理有關(guān)的卵母細胞和前成胚的生存力和懷孕潛力的新原理的用途。更明確地，本申請涉及通過提高在其中至少發(fā)生體外受精的培養(yǎng)基中的，并且也優(yōu)選地在其中在體外受精之前培養(yǎng)卵母細胞的培養(yǎng)基中的，減數(shù)分裂活化甾醇的含量改善卵母細胞和前成胚的妊娠潛力。
背景技術(shù)：
尋求不育治療的夫婦，幾乎沒有例外地，將接受體外受精，其中發(fā)生卵母細胞和精子之間的體外會合。婦女通常正在接受用外生的激素治療，從而調(diào)節(jié)和促進卵巢形成多于在自然月經(jīng)周期期間見到的通常一個排卵前卵泡。本治療的一部分包括從卵巢的排卵前卵泡中回收卵母細胞從而使卵母細胞成熟和/或體外受精。在體外受精和前成胚發(fā)育之后，將1到3個前成胚放置到婦女的子宮，她因此有懷孕和生育自己的孩子的可能。這現(xiàn)在是一項公認的治療，它已經(jīng)大規(guī)模進行了超過20年。
雖然實現(xiàn)懷孕的可能性這些年來已經(jīng)增加了，但是回收的卵母細胞經(jīng)歷受精和前成胚發(fā)育的頻率已經(jīng)保持顯著恒定，大約是60-70％。然而，被置換的前成胚僅有大約15-25％著床并發(fā)育成后代。因此，回收的卵母細胞僅有一部份產(chǎn)生孕體。雖然為什么體外發(fā)育的前成胚只有這樣小的一部份擁有著床能力的原因在很大程度上還不知道，但是已經(jīng)提出了數(shù)種解釋(Salha等，1998)卵泡/卵母細胞缺乏足夠的成熟；卵泡/卵母細胞已經(jīng)被暴露于最適度以下濃度的促性腺激素；卵母細胞的培養(yǎng)條件可能沒有反映雌性生殖道內(nèi)腔液的條件；卵母細胞遭受最適度以下的培養(yǎng)條件。
在其天然的環(huán)境下，在第一次位于輸卵管期間在包圍著卵母細胞的卵泡液的海洋中的卵母細胞被從卵泡中排出。卵泡液與來自輸卵管的分泌物混合，確定了在其中發(fā)生受精的環(huán)境。卵泡液含有許多據(jù)信是增加卵母細胞細胞核和卵母細胞細胞質(zhì)成熟的物質(zhì)。最近的報告顯示特別是促卵泡激素(FSH)和表皮生長因子(EGF)參與了這些成熟過程。他們都存在于卵泡液，并且輸卵管特別在排卵周圍合成EGF(Morishige等，1993)。
哺乳動物卵母細胞在以存在核膜，和/或胚泡(GV)為特征的第一次減數(shù)分裂的前期內(nèi)被停滯。當卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂時，利用胚泡崩解(GVBD)，又稱為卵母細胞成熟，使其被顯示。在卵泡中，因為在卵泡液中存在的次黃嘌呤(HX)和其它嘌呤的抑制成熟的作用，卵母細胞停留在GV期。當在存在生理濃度的次黃嘌呤的條件下培養(yǎng)時，培養(yǎng)中卵母細胞也保持在GV期，如果HX被除去，則恢復(fù)減數(shù)分裂。HX對于在培養(yǎng)的小鼠丘包封的卵母細胞(cumulus enclosed oocytes)，以及失去丘的裸露卵母細胞中減數(shù)分裂恢復(fù)的抑制作用，可以通過加入減數(shù)分裂活化甾醇(meiosis activating sterols)克服，例如FF-MAS(4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-膽甾-8，24-二烯-3β-醇)。從人的卵泡液分離和鑒定FF-MAS，并從牛睪丸分離和鑒定T-MAS(Byskov等，1995)。這些甾醇是膽固醇生物合成途徑中的中間體，并且是羊毛甾醇的直接產(chǎn)物(Schroepfer等，1972)(

圖1)。
由CYP51基因編碼的細胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶(P45014DM)催化從羊毛甾醇合成FF-MAS。FF-MAS被甾醇14-還原酶(Δ14R)的活性轉(zhuǎn)變?yōu)門-MAS。藥物AY9944-A-7(AY)，選擇性地抑制Δ14R的活性，它在二十世紀五十年代被用來降低血漿膽固醇。AY的化學結(jié)構(gòu)與甾醇和膽固醇生物合成中的中間體完全無關(guān)(見綜述Mercer，1993)。幾項研究已經(jīng)顯示，當在存在AY的條件下培養(yǎng)時，產(chǎn)生膽固醇的細胞，累積4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇(也就是說，F(xiàn)F-MAS)。已經(jīng)顯示，AY(0.1μM)在培養(yǎng)的大鼠肝細胞中起一種Δ14R競爭性抑制劑的作用。
已經(jīng)顯示，在體外生理濃度的FSH在小鼠中促進卵母細胞成熟，還在人和猴卵母細胞的胚泡期內(nèi)的卵母細胞中促進卵母細胞成熟(Schramm和Bavister 1995)。已經(jīng)顯示，F(xiàn)SH刺激丘細胞合成正促進成熟的物質(zhì)(Byskov等，1997)。然而，最近的一項研究顯示，F(xiàn)SH降低在存在FSH的條件下生長的一組前成胚的三倍性比率，提示FSH在減數(shù)分裂最后階段的一個特異性作用(Merriman等，1998)。進一步地，通過將這些前成胚放置到假孕的小鼠中，已經(jīng)顯示，在卵母細胞成熟培養(yǎng)基中存在FSH的組中，較之于對照培養(yǎng)基，著床(implantation)的數(shù)量提高了，并且?guī)缀跸嗨朴隗w內(nèi)成熟的卵母細胞的著床數(shù)量。
已經(jīng)表明，EGF在許多物種中增加卵母細胞成熟，例如牛、豬、小鼠和大鼠，并且，一項研究發(fā)現(xiàn)FSH似乎上調(diào)了大鼠粒層細胞中EGF受體的表達(Maruo等，1993)。EGF促進小鼠二細胞發(fā)育成胚泡(Morishige等，1993)。在人的卵母細胞中結(jié)果較不清楚。6小時的EGF濃度為1和10ng/ml的暴露沒有反映在從IVF程序獲得的卵母細胞的受精率增加中(Gomez等，1993)，盡管Goud等(1998)發(fā)現(xiàn)EGF(2ng/ml)增加培養(yǎng)30小時后達到中期II(MII)的胚泡卵母細胞的數(shù)量，并得出結(jié)論EGF改善體外人類卵母細胞的細胞核和細胞質(zhì)成熟。
在此即定的處理期間，體外受精在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行(Salha等，1998；Trounson和Gardner 1993)。在這樣的基本培養(yǎng)基中，這些卵母細胞缺乏天然的卵泡液環(huán)境。因此，例如，Merriman等1998洗滌這些卵母細胞，在轉(zhuǎn)移到在其中發(fā)生體外受精的基本培養(yǎng)基中之前在含有FSH和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明詳述本發(fā)明所解決的一個問題是體外創(chuàng)造的前成胚的非常低的著床率(rate of implantation)。這通過將一個或多個卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基中而實現(xiàn)，此培養(yǎng)基包括至少一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)-MAS是位于羊毛甾醇和膽固醇之間的代謝途徑中任何甾醇，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑。
根據(jù)本發(fā)明，在其中發(fā)生實際的體外受精的培養(yǎng)基，基于在實施例中給出的發(fā)現(xiàn)。因此，在實施例2中證明，與被暴露于對照培養(yǎng)的那些比較，人類的著床率在體外受精期間被暴露于含有FSH和EGF的培養(yǎng)基的卵母細胞和前成胚的組中顯著更高。而且，與對照培養(yǎng)基比較，F(xiàn)SH和EGF的存在引起FF-MAS和T-MAS在卵母細胞已經(jīng)在其中生長的培養(yǎng)基中累積。在實施例1中證明，在小鼠中，F(xiàn)SH和EGF在丘包封的卵母細胞的培養(yǎng)中的存在，通過減弱T-MAS向膽固醇的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致內(nèi)生性合成的FF-MAS和T-MAS的累積。
實施例1和2不僅表明，當在含有體內(nèi)觀察的那些濃度左右的EGF和FSH的培養(yǎng)基中進行體外受精時，著床率顯著提高，而且證實根本的機制是MAS的內(nèi)源性生產(chǎn)，而且其它實施例強調(diào)了這些發(fā)現(xiàn)。實施例3證明，在體外FSH和EGF提高了小鼠卵母細胞的卵母細胞成熟，并且，F(xiàn)SH和EGF的組合似乎增強了這個作用。實施例5證明，一種甾醇14-還原酶抑制劑(AY9944-17)按照劑量依賴性的方式刺激丘包封的小鼠卵母細胞的卵母細胞成熟，并且，AY化合物在丘包封的小鼠卵母細胞的培養(yǎng)中的存在，通過衰減T-MAS向膽固醇的轉(zhuǎn)變，引起內(nèi)生性產(chǎn)生的FF-MAS和T-MAS的累積。這些發(fā)現(xiàn)第一次證明，小鼠的丘卵母細胞復(fù)合體能夠在存在AY的條件下產(chǎn)生并累積FF-MAS。在實施例6中，用一種膽固醇生物合成抑制劑，兩性霉素B，獲得了相似的結(jié)果。
因此，增強MAS的內(nèi)源性生產(chǎn)代表了一種增大體外受精的前成胚的懷孕潛力(pregnancy potential)的新機制。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及包括將一個或多個MII卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基中之步驟的體外受精的方法，此培養(yǎng)基包括至少一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)-MAS是代謝途徑中羊毛甾醇和膽固醇之間的任何甾醇，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性刺激至少一種MAS累積的添加劑和多種添加劑。優(yōu)選體外受精是人類的卵母細胞的體外受精。
體外受精程序優(yōu)選地如下進行將完好的丘卵母細胞復(fù)合體定位在卵泡抽出物，并轉(zhuǎn)移到包括至少MAS，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑的培養(yǎng)基中。數(shù)小時之后，將純化的精子加入丘包封的卵母細胞，發(fā)生體外受精，這可在次日(培養(yǎng)16-24小時)通過在卵母細胞中存在兩個原核而被顯示。具有兩個原核的卵母細胞稱為受精卵。繼續(xù)培養(yǎng)另外的24-48小時通常引起受精卵最初幾次不多的有絲分裂，在此情形中現(xiàn)在使用術(shù)語前成胚。因此，前成胚由至少兩個細胞組成(那兩個細胞被稱為卵裂球(blastomers))。卵母細胞被回收之后通常48-72小時，在體外受精后觀察到前成胚的存在，并且隨后將前成胚放回到婦女的子宮以進一步發(fā)育。
在本發(fā)明的一個實施方案中，持續(xù)卵母細胞的暴露和培養(yǎng)，直到形成受精卵和/或前成胚。受精卵和/或前成胚的形成通常在16-24小時之內(nèi)出現(xiàn)。在一個有關(guān)的實施方案中，一個或多個被暴露和培養(yǎng)的卵母細胞是中期(Metafase)II(MII)的卵母細胞。
到MII為止，理解了經(jīng)歷胚泡分解，存在有第一極體并具有或多或少的擴展的丘復(fù)合體的卵母細胞。這些卵母細胞很容易被操作卵母細胞的領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員識別。MII的卵母細胞是所制備的并且準備給精子受精的卵母細胞的類型。
本發(fā)明的一個實施方案涉及一種體外受精方法，包括如下步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個或多個GV卵母細胞，此培養(yǎng)基包括至少一種減數(shù)分裂活化甾醇MAS，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑；由此形成一個或多個MII卵母細胞；(b)將步驟(a)的一個或多個MII卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基包括至少一種MAS，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑；持續(xù)此暴露和培養(yǎng)，直至形成受精卵和/或前成胚。
在本發(fā)明的一個方面，用步驟(a)和步驟(b)中同樣的培養(yǎng)基實施本方法。由此貫穿本過程維持了天然的環(huán)境，并省略了一個洗滌步驟。在本發(fā)明的另一個方面，在步驟(a)和步驟(b)之間引進了一個洗滌步驟。
能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑(例如，F(xiàn)SH和EGF)可正影響成熟，并且通過兩種不同的機制為丘-卵母細胞復(fù)合體提供減數(shù)分裂促進作用。一種可以是通過對于直接影響卵母細胞的丘細胞的正刺激。丘細胞也可向培養(yǎng)基釋放物質(zhì)，這些物質(zhì)可以誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)，并且維持培養(yǎng)基中其它卵母細胞的進一步成熟。因此，通過在含有添加劑或多種添加劑的相同的培養(yǎng)基中將數(shù)種丘-卵母細胞復(fù)合體一起共培養(yǎng)，從而改善著床率，受精率，和/或卵母細胞的生存力是本發(fā)明的又一個方面。這些在卵巢刺激過程期間已經(jīng)經(jīng)歷了最適度之下的成熟或者不能夠按照生理上正確方式恢復(fù)減數(shù)分裂的卵母細胞-丘復(fù)合體，在體外可以在通過將數(shù)個卵母細胞-丘復(fù)合體一起在存在添加劑或多種添加劑的條件下共培養(yǎng)進行刺激之后，通過從更成熟的卵母細胞-丘復(fù)合體釋放物質(zhì)，從而接受一個正刺激。共培養(yǎng)的生存力增加和將添加劑或多種添加劑加入此培養(yǎng)基中，將會導(dǎo)致這些卵母細胞的一個更適度的成熟，這在卵巢刺激期間缺乏一個適宜的刺激以恢復(fù)減數(shù)分裂。因為由最適度成熟的丘包封的卵母細胞內(nèi)生性地產(chǎn)生的MAS被釋放到培養(yǎng)基中，所以較不適度成熟的卵母細胞將從此刺激受益，并被誘導(dǎo)恢復(fù)減數(shù)分裂?；厥盏穆涯讣毎氖芫芰黾?，并且可能增加受精率。當通過在含有添加劑或多種添加劑的培養(yǎng)基中的體外受精創(chuàng)造生存力更高的前成胚時，與不育治療有關(guān)的懷孕的可能性將會增加。
在所說的具有1)諸如一種具有促卵泡活性(也就是說卵泡刺激激素(FSH))的糖蛋白的天然存在的激素，等電點大于5.0的特定的FSH同工型體的混合物，和具有類似表皮生長因子(EGF)的活性的生長因子的，或具有2)按照這樣一種方式干擾將羊毛甾醇轉(zhuǎn)變成膽固醇的生物合成途徑以致中間體累積，導(dǎo)致MAS濃度增加的物質(zhì)的培養(yǎng)基中，MAS含量的增加。本發(fā)明的一個方面涉及以上提到的物質(zhì)的作用，這增加了卵巢的卵泡的丘細胞的MAS生產(chǎn)，并且因此增加卵母細胞經(jīng)歷正常的前成胚發(fā)育的能力，導(dǎo)致在所使用的與輔助生殖和不育治療有關(guān)的培養(yǎng)期間獲得的衍生的前成胚的著床和受孕潛力增加。
目前考慮，MAS的內(nèi)生性生產(chǎn)在與卵母細胞連接的或在卵母細胞周圍的丘細胞中發(fā)生。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，將沒有或幾乎沒有丘細胞的卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于包括MAS或一種MAS類似物的培養(yǎng)基中，從體外受精產(chǎn)生的前成胚的著床率被提高了。在另一個實施方案中，將丘包封的卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于包括MAS或一種MAS類似物的培養(yǎng)基中，從體外受精產(chǎn)生的前成胚的著床率被提高了。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基包括能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑。在本發(fā)明的一個相關(guān)方面，將2-30個卵母細胞一起培養(yǎng)和暴露，例如2-25，2-20，或僅2-15個卵母細胞，其中這些之中的若干(例如少于50％，比如小于40％，小于30％，或者小于20％的卵母細胞)是丘包封的。
本發(fā)明的另一個主要方面涉及包括至少一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)——MAS是代謝途徑中位于羊毛甾醇和膽固醇之間的任何甾醇，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑的培養(yǎng)基用于體外受精的用途，由此體外受精產(chǎn)生的前成胚在體內(nèi)具有改善的著床率。
又一個實施方案涉及至少一種減數(shù)活化甾醇(MAS)——MAS是代謝途徑中位于羊毛甾醇和膽固醇之間的任何甾醇，一種MAS類似物，和/或能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS在丘包封的卵母細胞中累積的添加劑或多種添加劑制備體外受精的培養(yǎng)基的用途，在體內(nèi)從此體外受精產(chǎn)生的前成胚具有改善的著床率。
術(shù)語減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)是指在膽固醇生物合成中在羊毛甾醇和膽固醇之間的一種中間體的物質(zhì)(見圖1)。MAS的兩個實例是FF-MAS(4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-膽甾-8，24-二烯-3β-醇)。一種MAS將優(yōu)選是甾醇。MAS化合物的實例在WO96/00235，WO96/27658，WO97/00884，WO98/28323，WO98/54965和WO98/55498在被提到。MAS優(yōu)選地選自FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和酵母甾醇。
在另一個實施方案中，一種MAS類似物被加到培養(yǎng)基中。一種MAS類似物被定義為一種引起可與已公開之MAS效應(yīng)比較的效應(yīng)的物質(zhì)。這可能是已經(jīng)公開的對于卵母細胞成熟(Hegele-Hartung等，1999)或GVBD(Byskov等，1995)或，優(yōu)選地對于如同實施例2中所描述的著床率的效應(yīng)。更明確地，MAS和MAS類似物是在下文的實施例7中所述的測試中具有顯著高于對照的胚泡崩解(breakdown)(在下文中稱為GVBD)百分數(shù)的化合物。優(yōu)選的MAS和MAS類似物是具有至少50％的，優(yōu)選地至少80％的GVBD百分數(shù)的那些。
本發(fā)明的一個方面涉及增加卵巢卵泡丘細胞MAS生產(chǎn)，并因此增強卵母細胞經(jīng)歷正常的前成胚發(fā)育，導(dǎo)致在所使用的與輔助生殖和不育治療有關(guān)的培養(yǎng)期期間獲得的衍生前成胚的著床和受孕潛力增大的添加劑或多種添加劑的作用。添加劑或多種添加劑被定義為導(dǎo)致在存在此添加劑或多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞中MAS的相對含量之間的至少為2的比值的添加劑或多種添加劑，在培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞中MAS的相對含量通過如下方式測定在從小鼠去除卵巢之前48小時用外源的促性腺激素刺激雌性小鼠，并通過穿刺單個卵泡從卵巢回收丘包封的卵母細胞，并將回收的卵母細胞在補充了3mg/l牛血清白蛋白，5mg/l人血清白蛋白，2mM/l L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，4mM次黃嘌呤和3H-mevalonat的α-MEM培養(yǎng)基中在37℃，100％濕度和含5％CO2的空氣中培養(yǎng)24小時，此后用50μl 0.3MNa2PO4pH＝1酸化，用五倍過量的正-庚烷∶異丙醇(3∶1v/v)有機萃取三次，利用HPLC從有機相純化MAS，測定在存在添加劑或多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞和在不存在添加劑和多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞之間每個丘包封的卵母細胞的放射性的比值。
優(yōu)選此添加劑選自諸如FSH和類似物的促性腺激素，諸如EGF和類似物的生長激素，膽固醇生物合成抑制劑，諸如抑制甾醇Δ14-還原酶的化合物的，例如AY9944-A-7，或抑制將T-MAS轉(zhuǎn)變成酵母甾醇的4-脫甲基酶的化合物，活化細胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶的化合物，以及具有兩性霉素樣作用的化合物。
術(shù)語FSH是指具有卵泡-刺激活性的包括FSH的異二聚體的氨基酸序列和垂體衍生蛋白的鏈的蛋白。然而，術(shù)語FSH也定義來指活化卵巢的丘細胞的FSH受體的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)能夠活化位于丘細胞上的FSH受體，由此啟始減數(shù)分裂的恢復(fù)。這樣的物質(zhì)的實例可以是從FSH分子的完整序列衍生的寡肽或其衍生物。
術(shù)語EGF是指所有活化EGF受體(例如EGF和轉(zhuǎn)化生長因子-α)并引起MAS在丘-卵母細胞復(fù)合體中累積的所有蛋白。其它可能擁有相似活性的物質(zhì)包括象活化素，胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II的物質(zhì)。
術(shù)語膽固醇合成抑制劑是指以導(dǎo)致減數(shù)分裂活化甾醇累積的方式干擾膽固醇生物合成的物質(zhì)。AY 9944和兩性霉素是這樣的化合物的實例。
優(yōu)選此添加劑是一種促性腺激素和一種生長激素的聯(lián)合，例如EGF和FSH的聯(lián)合。然而，數(shù)據(jù)提示EGF和FSH單獨能夠內(nèi)生性促進至少一種MAS累積。優(yōu)選EGF的濃度在1和10ng EGF/ml，例如9ng/ml，8ng/ml，7ng/ml，6ng/ml，5ng/ml，4ng/ml，或3ng/ml，優(yōu)選地2ng EGF/ml。
EGF和FSH的聯(lián)合對著床率和對卵母細胞成熟具有協(xié)同作用，是本發(fā)明的又一個的方面。
正如在實施例4中說明的一樣，在體外，低酸性和中酸性的具有大于5.0的pI的FSH同工型(isoform)在誘導(dǎo)小鼠的丘包封的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂中比酸性FSH同工型顯著更有效。因此優(yōu)選一種添加劑是FSH，其中FSH是具有大于5.0的等電點的FSH同工型。術(shù)語FSH同工型是指具有FSH的氨基酸序列，但是在其寡糖結(jié)構(gòu)，包括末端唾液酸化和/或硫酸化程度不同的，產(chǎn)生不同的等電點pI(也就是說，在蛋白質(zhì)的凈電荷是零處的pH值)的蛋白。FSH同工型利用酶或化學修飾或優(yōu)選地利用天然存在的沒有分級的FSH的層析聚焦獲得。碳水化合物鏈用這些不影響氨基酸序列的處理去除。這樣的處理的實例是引起部分脫唾液酸化的氟化氫和神經(jīng)氨酸酶處理。
FSH衍生自天然存在的FSH，例如從尿提取的FSH，或來自重組FSH。FSH的優(yōu)選濃度在2和200IU FSH/l之間，例如5和50IU FSH/l之間，比如50IU/l，40IU/l，30IU/l，20IU/l，或10IU/l，優(yōu)選地是25IUFSH/l。
本發(fā)明的又一個方面涉及諸如FSH和EGF的多種添加劑與一種MAS或一種MAS類似物的聯(lián)合。當體外受精在用油覆蓋培養(yǎng)基中進行時，這個實施方案是特別優(yōu)選的。典型地，此培養(yǎng)基是水溶性的，并且，此油是水不溶性的，例如礦物油。
優(yōu)選用主要由各種鹽組成的簡單培養(yǎng)基(simple medium)作為起點。簡單培養(yǎng)基的實例是M16，EBSS，Ham-F10，Whitten，Brinster，BWW，T6，Eagle’s，HTF，CZB，MTF，P1和Menezo’s B3培養(yǎng)基。對于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員，如何制備培養(yǎng)基的詳細描述參考資料見Trounson和Gardner，第98-101頁，是充份公知的。
優(yōu)選此培養(yǎng)基包括抗生素(例如青霉素和/或鏈霉素)和人血清白蛋白(HSA)。還優(yōu)選此培養(yǎng)基進一步包括一種pH調(diào)節(jié)成分以維持pH在7.3和7.5之間。一種pH調(diào)節(jié)成分的一個優(yōu)選實例是碳酸氫鈉(bicarbonate)。甚至進一步優(yōu)選培養(yǎng)基具有280-300mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度。正如將會容易地被本領(lǐng)域中的熟練人員承認的一樣，優(yōu)選此培養(yǎng)基還含有丙酮酸鹽。
術(shù)語生殖培養(yǎng)基是指可在其中進行體外受精和前成胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基。因此，此培養(yǎng)基能夠維持培養(yǎng)中的卵母細胞和精子的生存力，促進卵母細胞與精子受精，并且支持前成胚發(fā)育。
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實施例實施例1培養(yǎng)期間，減數(shù)分裂活化甾醇在用FSH和EGF刺激的小鼠的丘包封的卵母細胞中之內(nèi)源性產(chǎn)生用外生的促性腺激素(每只小鼠7.5IU；Gonadoplex，Leo，Ballerup，Denmark)刺激總共20只不成熟的小鼠。用促性腺激素注射之后四十八小時，處死小鼠并去除卵巢。通過穿刺單個卵泡回收卵母細胞，并且收集在補充了3mg/l牛血清包蛋白，5mg/l人血清白蛋白，2mg/lL-谷氨酰胺，100IU/l青霉素，100μg/ml鏈霉素和4mM次黃嘌呤的培養(yǎng)基(α-MEM，Gibco，BRL)中。分離了總共大概650個丘包封的卵母細胞。將丘包封的卵母細胞(CEO)隨機地分成兩個各由350個CEO組成的相等集合。其中一個集合用做對照，并培養(yǎng)于沒有加FSH和EGF的對照培養(yǎng)基中。另一集合用做測試，并將卵母細胞在存在25IU/L人FSH(GonalF，Serono Nordic，Sweden)和2ng/ml EGF(Sigma，USA)的條件下培養(yǎng)。此外，測試和對照培養(yǎng)都接受放射性標記的甲羥戊酸(3H-甲羥戊酸)(90μCi/3H-甲羥戊酸；30μCi/mmolNEN Life Science Products.Boston，MA，USA)，它是甾醇和類固醇合成的天然前體。各孔體積都是400μl。
在24小時的培養(yǎng)期之后(37℃，100％濕度，在含有5％CO2的空氣中)，在用50μl 0.3M Na2PO4，pH1.0酸化之后利用有機萃取從培養(yǎng)基和CEO去除類固醇和甾醇。加入五倍過量的正庚烷-異丙醇(3∶1v/v)混合物并劇烈搖晃3小時。分離有機相，并且用兩個連續(xù)的HPLC步驟純化羊毛甾醇，F(xiàn)F-MAS，T-MAS，膽固醇和孕酮(詳細請見Baltzen和Byskov 1999)，包括一個主要的正相柱(ChromSpher-TM Si，5μm，250×4.6mm；移動相99.5％正庚烷，0.5％異丙醇(v/v)；流動相1.0ml/min；溫度28℃)和第二個反相柱(LiChrospher-TM RP-8，5μm，250×4.6mm；移動相92.5％乙氰，7.5％水(v/v)；流速1.0ml/min；溫度40℃)。選擇在第二個柱子上純化的部份被干燥并重新溶解于100μl乙氰。含有羊毛甾醇，F(xiàn)F-MAS，和T-MAS的部份在加載到第二個HPLC柱子上之前，用相應(yīng)物質(zhì)的冷標準示蹤，以避免放射性甾醇由非特異性結(jié)合引起的損失。
監(jiān)測各純化部份中的放射性。羊毛甾醇，F(xiàn)F-MAS，T-MAS和膽固醇的生物合成通過測量被摻入的放射性而被定量。FSH/EGF的作用通過計算測試和對照培養(yǎng)中每個CEO的放射性的比值來評價。
表1在培養(yǎng)的具有和沒有FSH和EGF刺激的CEO之間摻入甾醇和類固醇中的放射性的比值羊毛甾醇 FF-MAS T-MAS 膽固醇 孕酮0.9 4.0 2.20.2 2.1在表1中給出的結(jié)果證明，F(xiàn)SH和EGF在CEO的培養(yǎng)中的存在通過衰減T-MAS向膽固醇的轉(zhuǎn)變引起內(nèi)生性產(chǎn)生的FF-MAS和T-MAS的累積。正如羊毛甾醇的比率幾乎沒有受到影響而膽固醇被減少了大約5倍這個事實所說明的一樣，F(xiàn)SH和EGF對于FF-MAS和T-MAS的累積產(chǎn)生了了一個特異性的作用。然而，F(xiàn)SH和EGF也刺激孕酮的產(chǎn)生。
實施例2在存在FSH和EGF的條件下培養(yǎng)的前成胚的顯著的著床率為了評價用FSH和EGF加富的卵母細胞培養(yǎng)基的作用，五十七個經(jīng)歷體外受精治療(IVF)的婦女參加了本研究。對本研究使用了下面的包括標準i)婦女的年齡在40歲以下，ii)間隔在26到32天的規(guī)律的月經(jīng)，iii)正常的治療前促性腺激素水平(小于10IU/L的FSH和LH)，iiii)在卵母細胞回收時超過12個排卵前卵泡。排除標準i)其中使用細胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)的案例，ii)內(nèi)分泌異常引起的不育，例如多囊卵巢。對于垂體下調(diào)，所有的婦女都接受了促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa；每日0.5mg buserelin)，在周期第21天開始并持續(xù)10-14天。在完成卵巢靜止后，使用每日150-225IU重組FSH(Gonal F，Serono Nordic，Sweden)的劑量與buserelin一起(每日0.2mg)，開始用外生的促性腺激素刺激。當多于兩個卵泡測量的直徑超過17mm時，則誘導(dǎo)排卵(10000IUhCG)。使用超聲引導(dǎo)的經(jīng)陰道吸引術(shù)(ultrasoud guided transvaginalaspiration)回收了卵母細胞。將一半回收的卵母細胞(每隔一個)培養(yǎng)在沒有加FSH和EGF的標準培養(yǎng)基中，并將另一半在補充了2ng重組EGF/ml和25IU/L重組FSH(Gonal F)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)最初24小時。標準的培養(yǎng)基由Eagles平衡鹽溶液組成，補充碳酸氫鈉(NaHCO32.1m/L)，丙酮酸(11mg/L)，人血清白蛋白(10mg/ml)，和青霉素(100IU/L)。使用之前，將培養(yǎng)基調(diào)整到280mOsmol/kg，和pH7.3-7.4并過濾除菌。在發(fā)生體外受精的24小時時間之后，去除此培養(yǎng)基，用在兩組中都相似的標準培養(yǎng)基置換。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(達到總共72小時)，此后進行前成胚的放置)。由此每一個婦女作為她自己的對照?？傮w上形態(tài)看上去最好的前成胚決定從其中選擇移植的前成胚的組。選擇形態(tài)上看上去最好的前成胚的標準按照Yding Andersen等(1991)做。因此，這兩組前成胚沒有被混合，使得以后可能明確地確定從其中產(chǎn)生懷孕的組。
這57個婦女中有三個具有在體外不分裂的卵母細胞，且有三個——因為可能發(fā)展的過度刺激癥狀——將所有已發(fā)育的前成胚冷藏。
表2患者特征和經(jīng)歷IVF治療的婦女的卵巢刺激的結(jié)果對照培養(yǎng)基 FSH/EGF培養(yǎng)基婦女的數(shù)量 24 27年齡 31.4(24-39) 30.7(26-37)治療前FSH的水平(IU/l) 5.5±0.3 6.5±0.4治療前LH的水平(IU/l) 5.7±0.6 4.9±0.3生育診斷輸卵管因子 15(63％) 18(68％)子宮內(nèi)膜異位 6(25％) 4(15％)自發(fā)的 3(12％) 5(18％)刺激天數(shù) 9.9±0.2 9.4±0.2外源性FSH(IU) 1800±90 1725±90雌二醇周期第2天(pmol/l)115±15 112±12雌二醇周期第9天(pmol/l)2980±4503860±500表3 IVF治療和衍生前成胚的著床率結(jié)果對照培養(yǎng)基 FSH/EGF培養(yǎng)基婦女的數(shù)量 24 27卵母細胞的數(shù)量 448 456受精的卵母細胞的數(shù)量 327(73％)356(78％)NS前成胚的數(shù)量 315(70％)338(74％)NS具有≥3個原核的23(5.1％)24(5.3％)卵母細胞的數(shù)量前成胚復(fù)位的數(shù)量 24 27所放回的前成胚的數(shù)量 45 52懷孕測試陽性的數(shù)量 6(25％) 15(56％)p＜0.03臨床懷孕的數(shù)量 6(25％) 13(48％)NS著床率 6(13％) 18(38％)p＜0.025
以上在表2和3中給出的所監(jiān)測的參數(shù)中，沒有一個在兩組之間顯著不同，除了著床率和陽性懷孕測試的數(shù)量之外，與對照的參數(shù)比較，其在被暴露于含有FSH和EGF的培養(yǎng)基中的卵母細胞/前成胚組中顯著較高。
從這兩組中每一組的40個卵母細胞收集培養(yǎng)基，并合并成來自對照培養(yǎng)基的一個集合和來自用FSH和EGF加富的培養(yǎng)基的一個集合。使用巴斯德吸管手動吸取直接從四孔板收集培養(yǎng)基。在這兩個集合中的類固醇和甾醇如同在實施例中所描述的一樣提取。
表3a卵母細胞已經(jīng)在其中生長的具有或沒有富集FSH和EGF的培養(yǎng)基中的MAS定量羊毛甾 FF- T- FF+T- 膽固醇 孕酮醇(ng) MAS(ng) MAS(ng) MAS(ng) (μg) (μg)對照培養(yǎng)基 ＜7 ＜4 ＜7 ＜11 ＜151.7FSH/EGF 培 90 117 94 210 13 5.4養(yǎng)基在表3a中給出的結(jié)果顯示，F(xiàn)SH和EGF的存在引起FF-MAS和T-MAS，以及它們的前體羊毛甾醇的累積，與在其中不能檢測到這些物質(zhì)的對照培養(yǎng)基形成對比。膽固醇濃度維持不變，而孕酮含量在用FSH和EGF富集的培養(yǎng)基中也似乎增加了。
實施例3FSH和EGF對體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞的恢復(fù)減數(shù)分裂的作用不成熟的雌性小鼠(B6D2-F1品系C57B1/2J)在受控制的光照和溫度條件下飼養(yǎng)，自由地接觸食物和水。當小鼠重10-16克時進行卵巢的刺激，包括腹膜內(nèi)注射含有(7，5U/小鼠)的Gonadoplex(Leo，Copenhagen，Demark)。44-48小時以后利用子宮頸離位處死小鼠。用于卵母細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基由α-Minimum Essential Medium(α-MEM)組成，含有Eagles平衡鹽溶液(EBSS)，4mM次黃嘌呤(HX)，3mg/ml牛血清白蛋白，0.23mM丙酮酸，2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素?；厥章殉?，并將其放置于HX-培養(yǎng)基中在其中進行最初的清洗并去除結(jié)締組織。通過使用25號針頭穿刺單個卵泡從卵巢分離卵母細胞。卵母細胞的分離在HX-培養(yǎng)基中進行，以防止恢復(fù)減數(shù)分裂，直至準備好進行測試。然后在每個實驗開始之前在對照培養(yǎng)基中將卵母細胞洗滌三次。丘包封的卵母細胞在4-孔板(Nunclon，Roskilde，Denmark)上單獨培養(yǎng)于37℃，100％加濕的5％CO2和95％空氣環(huán)境中，各孔的0.4ml培養(yǎng)基含有對照培養(yǎng)基或補充了FSH和/或EGF添加的培養(yǎng)基。培養(yǎng)期是22-24小時。到培養(yǎng)期結(jié)束為止，通過在倒置顯微鏡上檢查卵母細胞來計數(shù)胚泡崩解(GVBD)。計算了具有GVBD的卵母細胞/卵母細胞總數(shù)的百分數(shù)。
表4 FSH和EGF對于在體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞中恢復(fù)減數(shù)分裂的作用卵母細胞的數(shù)量GVBD的數(shù)量 ％GVBD對照培養(yǎng)基 154 29 19a，b，cFSH(10IU/l) 162 73 45bEGF(0.5ng/ml) 6821 31c，dFSH(10IU/l)+EGF(0.5ng/ml) 6333 52a，d具有相似的字母的值顯著差異P＜0.05在表4中給出的結(jié)果證明，在體外FSH和EGF增強小鼠卵母細胞的卵母細胞成熟，并且證明FSH和EGF的聯(lián)合似乎給出一個增強的效應(yīng)。
實施例4不同的FSH同工型對于體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的作用進行了相似于在實施例3中所描述的那些的實驗。
使用糖蛋白提取并且在此后進行層析聚焦，從人的垂體提取物分離了FSH同工型。在被應(yīng)用來在小鼠卵母細胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)之前，將FSH同工型對于對照培養(yǎng)基徹底地透析。
以連續(xù)稀釋測試了各FSH同工型部份，并測定了50％的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的稀釋度(50％GVBD的等效劑量(ED50％GVBD)，并對于各FSH部份重復(fù)測定3-5次。在各四孔板上，一個孔永遠用做對照并含有在沒有FSH的對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵母細胞。每一孔含有的CEO在30和40之間。
使用兩種方法監(jiān)測所測試的同工型部份的FSH濃度1)使用特異性兔抗FSH抗體和125I-標記的人FSH作為示蹤劑的放射-免疫分析。結(jié)合的和游離的放射性利用包被到右旋糖苷顆粒上的抗-兔免疫球蛋白分離。含有25IU/l的樣品的分析內(nèi)和分析間變異分別是7％和5％，2)一個穩(wěn)定表達重組人FSH受體并且一旦FSH刺激就釋放cAMP的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-cell)系。由FSH同工型部份所生成的cAMP的量與標準品相關(guān)。分析內(nèi)和分析間變異分別是15％和18％。
表5 FSH同工型級份對于在小鼠卵母細胞中恢復(fù)減數(shù)分裂的作用FSH同工型級份 卵母細胞 每孔卵母細胞 ED50％GVBD ED50％GVBD總數(shù) 平均數(shù)RIA(IU/l) CHO-cell分析(ng/l)低酸性 517 346.4±0.32a142±7c(pI6.43-5.69)中酸性 1088 376.1±0.67a146±16c(pI5.62-4.96)酸性 608 3412.2±0.74b215±13d(pI4.69-3.75)數(shù)值是平均值±SD。ED50％GVBD數(shù)值是在24小時培養(yǎng)時期之后50％的卵母細胞進入減數(shù)分裂的FSH濃度。在每一欄中具有相似字母的數(shù)值沒有顯著的差異而具有不同字母的數(shù)值表現(xiàn)以下水平的顯著性a，bp＜0.0005；c，d＜0.001。
在表5所顯示的結(jié)果說明，在體外，具有一個大于5.0的pI的低酸性和中酸性FSH同工型在誘導(dǎo)小鼠CEO恢復(fù)減數(shù)分裂中比酸性FSH同工型顯著更有效。與低酸性和中酸性FSH同工型的濃度比較，需要幾乎雙倍濃度的酸性FSH同工型以誘導(dǎo)50％的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂。
在本研究中獲得的誘導(dǎo)50％的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂所需要的FSH同工型的實際水平有利地與使用沒有分級的FSH的研究比較，其中ED50％GVBD是大約8IU/l。
盡管循環(huán)中FSH的mid-cycle達到大約10-15IU/l的幅度，最可能代表CEO體內(nèi)所暴露的濃度的卵泡內(nèi)FSH水平，已在恰好在排卵之前在來自婦女的排卵前卵泡液中測量，是4-6IU/l。這些數(shù)據(jù)有利地與特別是在小鼠系統(tǒng)中的低酸性和中酸性同工型的有效劑量比較，其中卵母細胞被暴露于FSH 20到24小時。
正如在實施例2中所描述的一樣，使用了濃度為25IU/l的未分級FSH，從而確保人卵母細胞以及那些在體內(nèi)接受了不是最適度的成熟的卵母細胞或那些在回收時不成熟的卵母細胞的最適度刺激，這些可以預(yù)期對于FSH刺激反應(yīng)性較低。
實施例5在培養(yǎng)期間被暴露于一種甾醇Δ14還原酶抑制劑(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母細胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)和減數(shù)分裂活化甾醇的內(nèi)生性生產(chǎn)用外生的促性腺激素(每只小鼠7.5IU；Gonadoplex，Leo，Ballerup，Denmark)刺激不成熟的雌性C57BI/2J B6D2小鼠(11-15)。注射促性腺激素之后四十八小時，處死小鼠，并去除卵巢。通過穿刺單個卵泡回收丘包封的卵母細胞(CEO)，并收集在補充了3mg/ml牛血清白蛋白，5mg/ml人血清白蛋白，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和4mM次黃嘌呤(對照培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基(α-MEM，Gibco，BRL)。
在培養(yǎng)期間被暴露于一種甾醇Δ14-還原酶抑制劑(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母細胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)。
合并來自10-15只小鼠的卵母細胞并隨機地分成不同的測試組。使用四孔培養(yǎng)皿(Nunclon，Roskilde，Denmark)進行測試，各孔在400μl培養(yǎng)基中含有20-25個卵母細胞。每個培養(yǎng)皿中有一個孔作為對照，其它的孔作為測試。
使用HX-培養(yǎng)基制備所有測試培養(yǎng)基。AY9944-A-7(AY)由Wyeth-Ayerst，Princeton，NJ，USA慷慨地提供。AY與MAS沒有結(jié)構(gòu)相似性。AY9944-A-7在水中的貯存液保存在-20℃，并在卵母細胞培養(yǎng)之前直接加到HX-培養(yǎng)基中。AY用從0.2到25μM的濃度使用。
在圖2中給出的結(jié)果表明，AY以劑量依賴性方式刺激CEO的卵母細胞成熟。與對照比較，5，10和25μM的濃度顯著地增加GVBD(分別地，p＜0.05，p＜0.001，p＜0.001)在培養(yǎng)期間被暴露于一種甾醇Δ14-還原酶抑制劑(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母細胞中減數(shù)分裂活化甾醇的內(nèi)生性生產(chǎn)分離了丘包封的卵母細胞(CEO)，并隨機地分成兩個各含有250個CEO的相等的集合。這兩個集合中的一個作為對照，并在沒有加AY的對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)。另一個作為測試，并在存在10μM的AY的條件下培養(yǎng)卵母細胞。另外，測試和對照培養(yǎng)都接受放射標記的甲羥戊酸(3H-甲羥戊酸)(90μCi3H-甲羥戊酸；30μCi/mmolNEN Life Science Products，Boston，MA，USA)，它是甾醇和類固醇合成的天然前體。各孔體積是400μl。
24小時的培養(yǎng)期之后，如同在實施例1中所描述的一樣提取類固醇和甾醇。
通過測量被摻入的放射性，定量羊毛甾醇，F(xiàn)F-MAS，T-MAS和膽固醇的生物合成。通過計算測試組和對照組中每個CEO放射性比值評價AY的作用。
表6在培養(yǎng)期間從培養(yǎng)的有或沒有暴露于AY的CEO所獲得的類固醇和甾醇中被摻入的放射性的比值羊毛甾醇 FF-MAS T-MAS 膽固醇 孕酮2.3∶111∶11∶5.21∶442.8∶1這些結(jié)果證明，AY在CEO培養(yǎng)中的存在通過衰減T-MAS向膽固醇的轉(zhuǎn)變引起內(nèi)源性產(chǎn)生的-FF-MAS和T-MAS的累積。正如盡管T-MAS和膽固醇的產(chǎn)生分別被減少了大約5倍和44倍，然而羊毛甾醇僅僅在小程度上累積這個事實所說明的一樣，AY對于FF-MAS的累積產(chǎn)生了一個特異性的作用。
實施例6在培養(yǎng)期間在被暴露于一種膽固醇生物合成抑制劑，兩性霉素B的小鼠的丘包封的卵母細胞中恢復(fù)減數(shù)分裂兩性霉素是一種用于通過抑制膽固醇生物合成來抗真感染菌的醫(yī)藥產(chǎn)品。它與MAS沒有結(jié)構(gòu)相似性。在體外，在小鼠的丘包封的卵母細胞上測試了它對于恢復(fù)減數(shù)分裂的作用。在不成熟的雌性小鼠上進行了卵巢刺激，并且如實施例3所述分離了丘包封的卵母細胞(CEO)。
丘包封的卵母細胞在四孔板上單獨培養(yǎng)(Nunclon，Roskidle，Denmark)，各孔的0.4ml培養(yǎng)基在5％CO2和95％空氣的100％加濕的環(huán)境中在37℃含有對照培養(yǎng)基或補充了兩性霉素B(Bristol-Myers Squibb)的培養(yǎng)基。
在22小時之后評價了在培養(yǎng)中的0.6和1.2μg/ml的兩性霉素的作用。
在另一個連續(xù)稀釋實驗中，也就是說，CEO的刺激，具有兩性霉素的培養(yǎng)期，刺激期，在含有1.2μg/ml兩性霉素的測試培養(yǎng)基中從5分鐘變到240分鐘。刺激期之后，將CEO轉(zhuǎn)移到對照培養(yǎng)基中并繼續(xù)培養(yǎng)達到總共22小時。
到培養(yǎng)期結(jié)束為止，通過在倒置顯微鏡下檢查卵母細胞來計數(shù)胚泡崩解(GVBD)。計算每總數(shù)的卵母細胞的具有GVBD的卵母細胞的百分數(shù)(％GVBD)。
表7在體外，兩性霉素對于在小鼠的丘包封的卵母細胞卵母細胞中減數(shù)分裂恢復(fù)的作用兩性霉素(μg/ml) 卵母細胞的數(shù)量 GVBD的數(shù)量 ％GVBD對照 176 28 160.6 94 26 281.2 121 92 76表8在體外，兩性霉素(1.2μg/ml)引發(fā)(也就是說CEO在其中暴露的時期)對于在小鼠的丘包封的卵母細胞中減數(shù)分裂恢復(fù)的作用時間(分鐘) 卵母細胞的數(shù)量 GVBD的數(shù)量 ％GVBD對照175 26 155 98 21 2110 88 26 2930 116 42 36120 50 25 50240 49 34 69在表7和表8中給出的結(jié)果證明，兩性霉素引起卵母細胞減數(shù)分裂的劑量依賴性的恢復(fù)實施例7用于選擇MAS和MAS類似物的方法從在受控制的溫度(20-22℃)，光照(lights on 06.00-18.00)和相對濕度(50-70％)下飼養(yǎng)的體重13-16克的不成熟的雌性小鼠(C57BL/67×DBA/2J F1，Bomholtgaard，Denmark)中獲得卵母細胞。小鼠接受腹膜內(nèi)注射含有20IU FSH的0.2ml促性腺激素(Gooal-F，Serono)，在48小時以后通過子宮頸離位處死。切除卵巢，并且在顯微鏡下通過使用一對27號針頭人工破裂卵泡而在HX-培養(yǎng)基中分離卵母細胞(見下文)。顯示完好的胚泡(在下文稱為GV)的球形卵母細胞在丘包封的卵母細胞(在下文稱為CEO)和裸露的卵母細胞(在下文稱為NO)中分裂，并被置于補充了3mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat No.A-7030)，5mg/ml人血清白蛋白(HAS，Stantens，Seruminstitut，Denmark)，0.23mM丙酮酸(Sigma，Cat No.S-8636)，2mM谷氨酰胺(Flow Cat No.16-801)，100IU/l青霉素和100mg/ml鏈霉素(Flow Cat No.16-700)的α-極限必需培養(yǎng)基(α-MEM，沒有核糖核苷，Gibco BRL，Cat No.22561)中。此培養(yǎng)基補充了3mM次黃嘌呤(Sigma Cat No.H-9377)，并稱為Hx-培養(yǎng)基。將卵母細胞在Hx-培養(yǎng)基中漂洗三次，將一樣大小的卵母細胞分成CEO和NO組。CEO和NO在四孔平皿(Nunclon，Denmark)中培養(yǎng)，其中各孔含有0.4ml Hx-培養(yǎng)基和濃度為10mM的要被測試的化合物。一個對照孔(也就是說，在沒有加測試化合物的同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的35-45個卵母細胞)總是與三個測試孔同時培養(yǎng)(35-45卵母細胞，補充了測試化合物)。這些卵母細胞在含有5％CO2的空氣的加濕的環(huán)境中在37℃培養(yǎng)24小時。到培養(yǎng)期結(jié)束為止，使用立體顯微鏡(Widlt，Leica MZ 12)分別計數(shù)了有GV，GVB和極體(在下文中稱為PB)的卵母細胞的數(shù)量。GVB的百分數(shù)，定義為該孔中卵母細胞總數(shù)中經(jīng)歷GVB的卵母細胞的百分數(shù)，如下計算％GVB＝((GVB的數(shù)量+PB的數(shù)量)/卵母細胞的總數(shù))×100。
權(quán)利要求
1.一種包括-至少一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)，MAS是在羊毛甾醇和膽固醇之間代謝途徑中任何甾醇，-一種MAS類似物，或者-能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑的培養(yǎng)基用于體外受精的用途，其中從體外受精產(chǎn)生的前成胚具有改善的體內(nèi)著床率。
2.至少一種MAS，一種MAS類似物，或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS在丘包封的卵母細胞中累積的添加劑或多種添加劑制備為體外受精培養(yǎng)基的用途，其中從體外受精產(chǎn)生的前成胚具有改善的體內(nèi)著床率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中MAS選自FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和酵母甾醇。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項的用途，其中MAS是FF-MAS。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項的用途，其中MAS是T-MAS。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中培養(yǎng)基包括一種MAS類似物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中該添加劑或多種添加劑導(dǎo)致在存在該添加劑或多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞中MAS的相對含量之間至少為2的比值，該培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞中MAS的相對含量通過如下方式測定在從小鼠去除卵巢之前48小時用外源的促性腺激素刺激雌性小鼠，通過穿刺單個卵泡從卵巢回收丘包封的卵母細胞，并在補充了3mg/l牛血清白蛋白，5mg/ml人血清白蛋白，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，4mM次黃嘌呤和3H-mevalonat的α-MEM培養(yǎng)基中在37℃，100％濕度和含有5％CO2的空氣中培養(yǎng)24小時，此后用50μl 3M Na2PO4pH＝1酸化，用5倍過量的正庚烷∶異丙醇(3∶1v/v)有機萃取三次，利用HPLC從有機相純化MAS，并測定在存在此添加劑或多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞和不存在此添加劑或多種添加劑的條件下培養(yǎng)的丘包封的卵母細胞之間每個丘包封的卵母細胞的放射性的比值。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中此添加劑選自諸如FSH和類似物的促性腺激素，諸如EGF和類似物的生長激素，諸如A9944-A7的抑制甾醇Δ14-還原酶的化合物，抑制將T-MAS轉(zhuǎn)變成酵母甾醇的4-脫甲基酶的化合物，活化細胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶的化合物和有兩性霉素樣作用的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中此添加劑是一種促性腺激素和一種生長激素的聯(lián)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中此添加劑是EGF和FSH的聯(lián)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中此添加劑是EGF。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中此添加劑是FSH。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或12的用途，其中FSH是一種具有大于5.0的等電點的FSH同工型。
14.根據(jù)權(quán)利要求10，12或13的用途，其中此FSH衍生于天然存在的FSH，例如從尿提取的FSH，或來自FSH的。
15.根據(jù)權(quán)利要求10或12-14的用途，其中FSH的濃度是在2和200IUFSH/l之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求10或11的用途，其中EGF的濃度是在1和10ngEGF/ml之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求7或8的用途，其中此添加劑是兩性霉素。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項的用途，其中體外受精是人卵母細胞的體外受精。
19.一種體外受精的方法，包括步驟將一個或多個MII卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基包括至少一種MAS，一種MAS類似物或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑；持續(xù)此暴露和培養(yǎng)直至形成了受精卵和/或前成胚。
20.一種體外受精的方法，包括步驟(a)在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個或多個GV卵母細胞，此培養(yǎng)基包括至少一種MAS，一種MAS類似物，或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑；由此形成一個或多個MII卵母細胞。(b)將步驟(a)的一個或多個MII卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)在一種培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基包括至少一種MAS，一種MAS類似物，或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑；持續(xù)此暴露和培養(yǎng)直至形成受精卵和/或前成胚。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的一種方法，其中MII卵母細胞是丘包封的卵母細胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21的一種方法，其中此培養(yǎng)基包括能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-21的一種方法，其中此培養(yǎng)基包括FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和/或酵母甾醇。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-21的一種方法，其中MAS是FF-MAS。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-21的一種方法，其中MAS是T-MAS。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-21的一種方法，其中此培養(yǎng)基包括一種MAS類似物。
27.根據(jù)權(quán)利要求19-26的一種方法，其中卵母細胞是裸的。
28.根據(jù)權(quán)利要求19-27的一種方法，其中此培養(yǎng)基包括至少一種MAS或至少一種MAS類似物。
29.根據(jù)權(quán)利要求19-18的一種方法，其中1-15個卵母細胞被一起培養(yǎng)和暴露。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改善所獲得的與體外受精和前成胚移植處理有關(guān)的卵母細胞和前成胚的生存力和懷孕潛力的新原理的用途。更明確地,通過提高在其中發(fā)生體外受精的培養(yǎng)基中減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)的含量來改善。這通過將一個或多個卵母細胞與精子一起暴露和培養(yǎng)于一種包括至少一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS),一種MAS類似物,和/或能夠內(nèi)源性刺激至少一種MAS累積的添加劑或多種添加劑的培養(yǎng)基中而實現(xiàn)。優(yōu)選的添加劑是FSH和EGF。
文檔編號C07J9/00GK1341147SQ00804261
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日
發(fā)明者C·Y·安德森, A·G·拜斯克夫 申請人:諾沃挪第克公司, 舍林股份公司