專利名稱：光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物相容的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，它是一種具有特殊物理性能的水凝膠，以及其制備方法和作為生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸存在于動(dòng)物組織內(nèi)，具有生物相容性和生物降解能力。關(guān)于物理性能，它具有諸如吸水性能高等優(yōu)良性能，還有其水溶液具有高粘性。
水凝膠由下述方法得到化學(xué)改性透明質(zhì)酸；采用某些方法使改性的透明質(zhì)酸交聯(lián)，形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)；以及把含水介質(zhì)如水加到網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。水凝膠呈現(xiàn)粘彈性和粘性。
交聯(lián)透明質(zhì)酸表觀上形成了大分子，而與成鍵方式無關(guān)。交聯(lián)透明質(zhì)酸的生物降解能力可以通過調(diào)節(jié)交聯(lián)度控制。
有各種交聯(lián)方式。例如已知使用疏水鍵合或離子結(jié)合的交聯(lián)方式，通過引入親核試劑使透明質(zhì)酸交聯(lián)[JP-W-3-502704，(相當(dāng)美國專利4937270)，本文用語“JP-W”意指未審查的已公開的國際專利申請(qǐng)]，通過使透明質(zhì)酸酯化借助于疏水鍵合交聯(lián)(美國專利4851521)，通過多價(jià)離子借助于離子鍵合交聯(lián)(歐洲專利0507604A2)。因?yàn)榕c共價(jià)鍵比較，它們是通過弱鍵合力交聯(lián)的，所以對(duì)外界變化的影響敏感，例如pH，離子強(qiáng)度和溫度等。另外，當(dāng)將它們用作生物醫(yī)學(xué)材料時(shí)，在生物體內(nèi)的保持能力低，還有也難以控制其在體內(nèi)的保持能力于適當(dāng)水平以“保持透明質(zhì)酸對(duì)生物體的生理作用。
此外，還已知通過共價(jià)鍵合將透明質(zhì)酸分子鍵合的交聯(lián)方式，借助于二乙烯基砜(divinglsulfone)交聯(lián)[JP-B-4-30691(相當(dāng)于美國專利4582865)，本文用語“JP-B”意指已審查的日本專利出版物]，以及借助環(huán)氧化物的交聯(lián)[JP-W-61-502729(相當(dāng)美國專利4,886,787)，JP-A-5-140201，本文用語“JP-A”意指未審查的已公開的日本專利申請(qǐng)]。然而，在這類交聯(lián)中所使用的交聯(lián)劑或交聯(lián)化合物是有毒的。還有，當(dāng)將二乙烯基砜、環(huán)氧化物等引入透明質(zhì)酸的同時(shí)通過交聯(lián)構(gòu)成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所形成的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠不溶于諸如水等溶劑。這樣進(jìn)入網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的未反應(yīng)的低分子化合物就難于分離和脫除。
另一方面，還已知采用紫外線輻射進(jìn)行光固化交聯(lián)反應(yīng)使透明質(zhì)酸交聯(lián)[JP-A-6-73102(相當(dāng)美國專利5462976)，美國人工內(nèi)臟學(xué)會(huì)志(ASAIO Journal)，38，M154～M157(1992)]。這種交聯(lián)方式的優(yōu)點(diǎn)是，引入了光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物在光固化交聯(lián)之前是水溶性的，同時(shí)未形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所以容易除去未反應(yīng)的低分子化合物該光反應(yīng)本身是一種在生成的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物中不含未反應(yīng)的低分子化合物的純凈反應(yīng)(cleanreaction)；所產(chǎn)生的交聯(lián)結(jié)構(gòu)由共價(jià)鍵形成，因此通過控制交聯(lián)度能夠容易地控制光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物的保持能力。
另外，當(dāng)上述光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物是用來作諸如抗粘連材料的生物醫(yī)學(xué)材料時(shí)，已經(jīng)研究類似薄膜狀的材料[美國人工內(nèi)臟學(xué)會(huì)志，38，M154～M157(1992)]，但是難以預(yù)防在組織或器官的細(xì)小部位中的粘連。因此，需要一種能夠注入這種細(xì)小部位的可注入的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
然而，本發(fā)明公開的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸的水凝膠及其制備方法尚屬未知。
傳統(tǒng)交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠難以除去諸如未反應(yīng)的低分子化合物等雜質(zhì)，并且也難以控制水凝膠的物理性能。此外，制備具有目的物理性能水凝膠的條件也難以形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是，提供一種含有水介質(zhì)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該凝膠由下述方法制得對(duì)引入光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射；使光反應(yīng)相互交聯(lián)基二聚；形成環(huán)丁烷環(huán)，并借此形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；以及提供易于制備上述凝膠的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可注入的生物醫(yī)學(xué)材料，該材料包含一種安全性、生物相容性和生物降解能力均優(yōu)良的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
作為本發(fā)明者充分研究的結(jié)果，采用下述各項(xiàng)成功地達(dá)到了上述目的1)一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)交聯(lián)基相互交聯(lián)；2)一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其交聯(lián)度為每摩爾透明質(zhì)酸二糖成分單元的0.01～0.5％；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射；3)按照上述1)或2)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述的光反應(yīng)交聯(lián)基，是一種含有間隔基的肉桂酸衍生物，并且是化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上，從而提供所述的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物；使所述光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的所述光反應(yīng)相互交聯(lián)基通過紫外線輻射二聚，形成環(huán)丁烷環(huán)，借此形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；以及所述的凝膠是一種在所述網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中含有水介質(zhì)的水凝膠；4)按照上述3)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述的間隔基是從氨基醇、氨基酸或肽衍生物的基團(tuán)；5)按照上述3)或4)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述光反應(yīng)交聯(lián)基用如下通式(1)或(2)表示-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph (1)式中R1和R2彼此獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基；Ph代表苯基；而n代表整數(shù)2～18；-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)式中，R3代表低級(jí)烷基或芳烷基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或-NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼比獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基；Ph代表對(duì)亞苯基；m代表整數(shù)1～6以及h代表整數(shù)1～18；6)按照上述1)～5)中任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中引入的所述光反應(yīng)交聯(lián)基的比例為每摩爾二糖單元成分的0.05～10％；7)一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)，以及然后對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行熱處理；8)一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行熱處理；然后對(duì)加熱過的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)；9)一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行熱處理；然后對(duì)加熱過的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)，以及然后再對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行熱處理；10)按照上述1)～9)中的任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中凝膠的內(nèi)毒素含量為0.25EU/g(內(nèi)毒素單位/克)或者更低；11)一種制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，包括對(duì)含有0.5～10％重量的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水介質(zhì)溶液進(jìn)行紫外線輻射，光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物中，透明質(zhì)酸的官能基上化學(xué)鍵合了光反應(yīng)交聯(lián)基；和通過相互交聯(lián)基二聚，形成分子間和/或分子內(nèi)交聯(lián)，得到網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；12)按照上述11)制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，其中，在用紫外線輻射所述光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水介質(zhì)溶液之前和/或之后，對(duì)其進(jìn)行熱處理；13)按照上述12)制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，其中，所述熱處理采用高壓蒸汽在100～125℃下進(jìn)行5～30分鐘；14)一種生物醫(yī)學(xué)材料，它包含按照上述1)～10)中任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠；15)按照上述14)的生物醫(yī)學(xué)材料，它具有抗粘連作用；16)一種生物醫(yī)學(xué)材料器材，它包含交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器；17)按照上述16)的生物醫(yī)學(xué)材料器材，其中，所述容器是能夠?qū)⑺瞿z排出以便注入的容器；18)一種生物醫(yī)學(xué)材料器材，它包含1)～10)中任何一項(xiàng)敘述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器；以及19)按照上述18)的生物醫(yī)學(xué)材料器材，其中所述容器是能夠?qū)⑺瞿z排出以便注入的容器。
附圖簡述

圖1表示在光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液中進(jìn)行光固化交聯(lián)的基本原理。
圖2是光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的DS(取代度)和吸水率關(guān)系圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案現(xiàn)將本發(fā)明詳細(xì)解釋如下。
本發(fā)明使用的術(shù)語“光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物”，作為一個(gè)概念，是用來包括一種用下述方法制備的衍生物，該方法包括對(duì)其中含有化學(xué)鍵合的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，以及使光反應(yīng)相互交聯(lián)基二聚，使透明質(zhì)酸衍生物交聯(lián)并借此形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所使用的術(shù)語“光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠”，作為一個(gè)概念，是用來包括一種水凝膠，在光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸(下文有時(shí)簡稱為“本發(fā)明的凝膠”)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu))中，包含水介質(zhì)，例如水、緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水、含有作為分散介質(zhì)的可溶于水的有機(jī)溶劑的水溶液。本發(fā)明所使用的術(shù)語“透明質(zhì)酸官能基”是用來包括存在透明質(zhì)酸中的、能夠與光反應(yīng)交聯(lián)基化學(xué)鍵合的官能基。官能基的典型實(shí)例是羧基和羥基。本發(fā)明所使用的術(shù)語“低級(jí)烷基”或“低級(jí)烷氧基”是用來包括含有1～8個(gè)碳原子的烷基或烷氧基，優(yōu)選1～4個(gè)碳原子。
在本發(fā)明凝膠中，首先以粘彈性表示其物理性能，其次以交聯(lián)度表示交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
對(duì)本發(fā)明的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物中的光反應(yīng)交聯(lián)基沒有特別限制，只要所述基團(tuán)含有能夠通過紫外線輻射二聚形成環(huán)丁烷環(huán)的1，2-亞乙烯基，并且所述的基團(tuán)衍生自肉桂酸或其取代衍生物[例如下述肉桂酸衍生物等，其中在肉桂酸苯環(huán)上的任何位置的一個(gè)或兩個(gè)氫被以下基團(tuán)取代低級(jí)烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和叔丁基等)、低級(jí)烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基等)、氨基和羥基等]，羧基-低級(jí)烷基胸腺嘧啶[例如1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶等]，羧基-低級(jí)烷基取代的香豆素(例如7-香豆酰氧乙酸等)等等。其中，特別優(yōu)選引入了從肉桂酸或其衍生物衍生的基團(tuán)的光反應(yīng)交聯(lián)基。另外，作為光反應(yīng)交聯(lián)基，還優(yōu)選從鍵合了間隔基的光反應(yīng)化合物如肉桂酸等衍生的基團(tuán)。所優(yōu)選的間隔基包括有兩個(gè)或兩個(gè)以上官能基的間隔基，這些官能基能夠鍵合到諸如肉桂酸等光反應(yīng)化合物的官能基以及透明質(zhì)酸的官能基上。具體地說，所優(yōu)選的是氨基酸或其衍生物、肽和氨基醇等，更具體地說，最優(yōu)選的是氨基醇?？梢詫⒐夥磻?yīng)交聯(lián)基引入透明質(zhì)酸的糖化物成分的任何官能基上，例如N-乙?；?D-葡糖胺和D-葡糖醛酸，但是特別優(yōu)選的是把所述的交聯(lián)基引入D-葡糖醛酸的羧基上。
就應(yīng)用肉桂酸作光反應(yīng)交聯(lián)基、氨基醇作間隔基而論，例如，優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物，其肉桂酸的羧基通過酯鍵化學(xué)鍵合到氨基醇的羥基上，而氨基醇的氨基通過酰胺鍵化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸的羧基上。就應(yīng)用氨基肉桂酸作光反應(yīng)交聯(lián)基、氨基酸或肽作間隔基而論，優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的光反應(yīng)透明質(zhì)酸，其間隔基的羧基通過酰胺鍵化學(xué)鍵合到氨基肉桂酸的氨基上，而所述的氨基酸或肽的氨基通過酰胺鍵化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸的羧基上。
具體地說，對(duì)于鍵合了間隔基的光反應(yīng)交聯(lián)基，特別優(yōu)選的是下述通式(1)或通式(2)表示的那些基團(tuán)。
-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph(1)在式(1)中，R1和R2彼此獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基(優(yōu)選含有1～4個(gè)碳原子)；Ph代表苯基，它不僅可以是用C6H5表示的基團(tuán)，而且也可以是包含下述取代苯環(huán)的基團(tuán)，即在苯環(huán)任何位置的一個(gè)或兩個(gè)氫原子被一個(gè)或兩個(gè)取代基取代，取代基選自含有1～4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或烷氧基、氨基和羥基等；n代表整數(shù)2～18，優(yōu)選2～12。
通式(1)所表示的光反應(yīng)交聯(lián)基是化學(xué)鍵合到，例如通過酰胺鍵化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸的羧基上，形成光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物。
-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)在式(2)中，R3代表低級(jí)烷基，優(yōu)選含1～4個(gè)碳原子的烷基(例如甲基、乙基等)或含有7～20個(gè)碳原子的芳烷基，優(yōu)選芐基或苯乙基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼此獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基(優(yōu)選含有1～4個(gè)碳原子)；Ph代表對(duì)亞苯基，它不僅可以是由-C6H4-表示的基團(tuán)，也可以是包含下述取代苯環(huán)的基團(tuán)，即苯環(huán)上鄰位或間位的氫原子被含1～4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或烷氧基、氨基、羥基等取代；m代表整數(shù)1～6，優(yōu)選為1～3；h代表整數(shù)1～18，優(yōu)選為1～12。
對(duì)用于本發(fā)明的透明質(zhì)酸沒有特殊限制；然而，通常使用重均分子量為10,000～5,000,000的透明質(zhì)酸作原料。可以按照用途選擇不同分子量。優(yōu)選重均分子量為500,000～3,000,000，更優(yōu)選800,000～2,500,000。在如下合成方法中，優(yōu)選使用透明質(zhì)酸的水溶性鹽，例如堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)，堿土金屬鹽(如鈣鹽等)等，但是也能使用其他鹽或游離酸，只要它們?nèi)苡谒褂玫姆磻?yīng)溶劑，且不干憂反應(yīng)。下文使用的術(shù)語“透明質(zhì)酸”往往包括它的鹽。
用于本發(fā)明的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的制備方法，包括將透明質(zhì)酸溶解于，例如，水或水溶液中，后者含有可與水溶混的有機(jī)溶劑[例如二噁烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酰胺、醇(例如甲醇、乙醇)、吡啶等]；然后在水溶性碳化二亞胺[例如1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺氫氯化物(下文縮寫為“EDC·HCl”、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺甲碘化物、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺氫氯化物]和縮合輔助劑(例如，N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基苯并三唑等)存在下，通過，例碳二亞胺法，引入光反應(yīng)交聯(lián)基。
反應(yīng)后能夠以普通方法提純所得產(chǎn)物，例如乙醇沉淀或透析(dialysis)。在提純和干燥之后，可以采用分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物在約269納米下的吸光度，從而得到所得光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的取代度(下文縮寫為“DS”，DS是每個(gè)透明質(zhì)酸的二糖成分單元所引入的光反應(yīng)交聯(lián)基的比率)。
無菌的和基本無內(nèi)毒素(例如內(nèi)毒素含量為0.25EU/g或更低)的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物和光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠可以通過使用無菌或基本無內(nèi)毒素的試劑、水和容器等、并注意制備工作環(huán)境的無菌處理得到。
將光反應(yīng)交聯(lián)基引入透明質(zhì)酸所使用的具體化合物包括下列通式(1-1)或(2-1)所表示的化合物H2N(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph(1-1)式中R1、R2、Ph和n與上述限定相同。
H-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2-1)式中A，-Ph-，和R3與上述限定相同。
化合物(1-1)和(2-1)優(yōu)選以鹽的形式應(yīng)用，例如，酸加成鹽如氫氯化物、氫溴化物、氫氟化物等，特別優(yōu)選氫氯化物。
具體地說，化合物(1-1)的氫氯化物(1-2)能按照如下反應(yīng)路線合成第一反應(yīng)第二反應(yīng)(1-2)式中R6代表能夠用酸裂開的氨基保護(hù)基，例如叔-丁氧基羰基等；X代表鹵原子，例如氯原子等。
這里，具體地說，本發(fā)明按下述方法合成化合物(1-2)。
將有機(jī)溶劑(如氯仿等)加到化合物(3)中，然后，在冰冷卻下向其中加入有機(jī)堿(如三乙基胺等)。順次向其中加入化合物(4)和堿性催化劑(如4-二甲基-氨基吡啶等)。在室溫下攪拌該混合物后，向反應(yīng)混合物中加入有機(jī)溶劑(如醋酸乙酯等)，然后依次用下述洗滌該混合物，包括幾份弱酸水溶液、水、幾份弱堿水溶液、水和飽和氯化鈉水溶液等。所分離出的有機(jī)溶液層置于無水硫酸鈉等上方干燥。過濾除去干燥劑等。在減壓下干燥濾液得到化合物(5)。
在冰冷卻下，將1～5M的氯化氫有機(jī)溶劑(如二噁烷等)的溶液加入化合物(5)，隨后攪拌。加有機(jī)溶劑(如二乙醚等)于其中，過濾收集所沉淀的結(jié)晶。用有機(jī)溶劑洗滌該結(jié)晶，然后在減壓下干燥，得到化合物(1-2)。
具體地說，能夠按下述反應(yīng)路線合成化合物(2-1)的氫氯化物(2-2)第一反應(yīng)第二反應(yīng)式中R3和R6如上述所限定。
另外，具體地說，按下述方法合成化合物(2-2)。
將有機(jī)溶劑(如氯仿等)加到化合物(6)中，再在有機(jī)堿(如三乙胺等)存在下加入活化劑(如二甲基-硫膦基氯化物等)，同時(shí)用冰冷卻，借此使化合物(6)的羧基活化?；衔?6)活化后，在有機(jī)堿(如三乙基胺等)存在下將化合物(7)加入其中，同時(shí)冰冷卻，隨后在室溫下攪拌。向反應(yīng)混合物加入有機(jī)溶劑(如醋酸乙酯等)，依次用下述洗滌所得混合物，包括幾份弱酸水溶液、水、幾份弱堿水溶液、水、飽和氯化鈉水溶液等。所分離出的有機(jī)溶劑層置于無水硫酸鈉等上方，干燥。過濾除去干燥劑等，在減壓下干燥濾液，得到化合物(8)。
在冰冷卻下，將A1～5M氯化氫有機(jī)溶劑(如二噁烷等)的溶液加到化合物(8)中，隨后攪拌。向其中加入有機(jī)溶劑(如二乙醚等)，過濾收集沉淀的結(jié)晶，用有機(jī)溶劑洗滌，在減壓下干燥，得到化合物(2～2)。
加到光反應(yīng)交聯(lián)基中的間隔基的存在對(duì)改善光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的光反應(yīng)性起很大作用，這種改善取決于間隔基的自由度和疏水鍵合性能。間隔基引起的光反應(yīng)性敏感性的改善，使得在低引入比例的光反應(yīng)交聯(lián)基存在下就能夠?qū)崿F(xiàn)光固化交聯(lián)，迄今光固化交聯(lián)還難以在這種條件下進(jìn)行。
按照傳統(tǒng)工藝，當(dāng)對(duì)上述光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行光輻射交聯(lián)時(shí)，首先將光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水溶液置于一個(gè)容器等上，干燥成薄膜或類似形狀，然后用紫外線輻射，得到光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸薄膜。薄膜不僅易傳輸紫外線，而且，在薄膜成形期間，因?yàn)楣夥磻?yīng)交聯(lián)基的疏水性，當(dāng)薄膜脫水或蒸發(fā)水時(shí)，使其彼此取向靠近。已經(jīng)證實(shí)，所形成的這種狀況有利于光反應(yīng)。例如在光反應(yīng)交聯(lián)基是肉桂酸殘基的情況下，當(dāng)肉桂酸殘基彼此之間的距離為4時(shí)，通過特定波長的紫外線輻射，分子能二聚，即交聯(lián)，但是在其他分子間距離下不能。所以，認(rèn)為能使光反應(yīng)交聯(lián)基彼此靠近的薄膜形成是實(shí)現(xiàn)光反應(yīng)的重要步驟。另外，反式肉桂酸在上述條件下通過紫外線輻射能二聚，而其他幾何異構(gòu)體(即順式肉桂酸)對(duì)于二聚而言是不活潑的。當(dāng)對(duì)傳統(tǒng)光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物水溶液用紫外線輻射時(shí)，認(rèn)為交聯(lián)難以進(jìn)行，因?yàn)樗肿铀坪醴恋K光反應(yīng)交聯(lián)基彼此靠近，并且比起二聚來主要進(jìn)行反式成為順式的異構(gòu)化作用。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，形成光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的步驟包括制備高濃度光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水溶液，以便光反應(yīng)交聯(lián)基彼此更頻繁地靠近；使溶液層成為紫外線易于透射的形狀，隨后對(duì)其進(jìn)行紫外線輻射。
按照本發(fā)明，當(dāng)對(duì)光反應(yīng)透明質(zhì)酸進(jìn)行紫外線輻射時(shí)，通過適當(dāng)選擇光反應(yīng)條件，如光反應(yīng)溶液濃度、紫外線輻射時(shí)間等，或者DS，能夠得到具有諸如粘彈性等目的物理性能的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
優(yōu)選待光輻射的在水介質(zhì)中的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液的濃度(下文往往稱為“光反應(yīng)濃度”)為約0.5～10％重量。用分子量約1,000,000的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物時(shí)，更優(yōu)選濃度為1～4％重量。在較低濃度下，如下文所述，異構(gòu)化作用發(fā)生優(yōu)于二聚作用。相反，在較高濃度下，難以得到均勻凝膠。
當(dāng)對(duì)低于所述規(guī)定濃度的較稀水溶液進(jìn)行紫外線輻射時(shí)，如上所述，傾向于優(yōu)先產(chǎn)生異構(gòu)體。當(dāng)繼續(xù)用紫外線輻射時(shí)，透明質(zhì)酸糖化物鏈本身因受紫外線的作用而分解，結(jié)果分子量降低。從這些觀點(diǎn)出發(fā)，重要的是創(chuàng)造一種光固化交聯(lián)反應(yīng)有效進(jìn)行而對(duì)透明質(zhì)酸的糖化物鏈無有害影響的反應(yīng)環(huán)境。所以必需制備上述規(guī)定濃度的水溶液。圖1表示在水介質(zhì)中進(jìn)行光固化交聯(lián)的基本原理，其中，(a)表示在稀溶液中紫外線輻射光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的變化。水分子妨礙光反應(yīng)交聯(lián)基彼此進(jìn)行易于交聯(lián)的分子排列，主要結(jié)果是異構(gòu)化作用。(b)表示在規(guī)定濃度的溶液中，進(jìn)行紫外線輻射，光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的變化。與在稀溶液中比較，疏水光反應(yīng)交聯(lián)基受水分子干擾較少，似乎通過疏水鍵合力彼此吸引，取得了易于交聯(lián)的分子排列。這樣光反應(yīng)交聯(lián)基通過輻射而二聚，同時(shí)包含水介質(zhì)，借此實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。為了改善在規(guī)定濃度的溶液中交聯(lián)作用的光反應(yīng)性，特別優(yōu)選使用引入了含有上述間隔基的具有高柔韌性的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物。
上述光反應(yīng)濃度取決于引入到透明質(zhì)酸中的光反應(yīng)交聯(lián)基的取代度(DS)。DS能夠以每個(gè)透明質(zhì)酸的二糖成分單元引入的光反應(yīng)交聯(lián)基的比率(％)為基礎(chǔ)計(jì)算。例如每個(gè)二糖成分單元有一個(gè)光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的DS是100％，或者每200個(gè)糖化物成分單元含有一個(gè)，則DS是1％。在相同光輻射條件下DS越低，交聯(lián)比越小。
在本發(fā)明中，為了在上述規(guī)定的光反應(yīng)濃度下實(shí)現(xiàn)交聯(lián)，在透明質(zhì)酸分子量等于或大于500,000的情況下，光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的DS可以約為0.05～10％，優(yōu)選約為0.3～5％，更優(yōu)選約為0.5～3％，然而可以依起始透明質(zhì)酸的分子量變化。
作為待光輻射的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液的溶劑，水介質(zhì)包括水、緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水等。對(duì)于生物醫(yī)學(xué)材料應(yīng)用，特別優(yōu)選緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水[例如磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)等]。當(dāng)應(yīng)用含水介質(zhì)而不是水時(shí)，能用介質(zhì)種類和溶質(zhì)濃度精細(xì)控制本發(fā)明所制凝膠的物理性能，取決于用途進(jìn)行適當(dāng)選擇。
光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液通常由下述的方法制得光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物只要從合成反應(yīng)系統(tǒng)分離并提純出來，就溶于水介質(zhì)中。作為光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液，在某些情況下，光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物可以照合成反應(yīng)系統(tǒng)中的原來樣子使用，或者以其濃縮狀態(tài)使用。
當(dāng)光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的DS固定時(shí)，形成環(huán)丁烷環(huán)的比例，即交聯(lián)比，往往隨著上述光反應(yīng)濃度的范圍的變化而變化，因此所制凝膠的物理性能也變化。隨著光反應(yīng)濃度的增加，交聯(lián)比似乎也增加，正如測(cè)定光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性所證實(shí)的那樣，凝膠的彈性也增加。隨著交聯(lián)比的增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得較致密。在光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中的環(huán)丁烷環(huán)的比例可稱為交聯(lián)度，交聯(lián)度是DS和交聯(lián)比的乘積，并以每個(gè)透明質(zhì)酸二糖成分單元的二聚體摩爾比率(％)表示。優(yōu)選交聯(lián)度的范圍為每摩爾透明質(zhì)酸二糖成分單元0.01～0.5％。
干燥了的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(下文簡稱“干凝膠”)的吸水率受交聯(lián)度的影響，因此吸水率就成了交聯(lián)度的一種度量。以下式表示吸水率吸水率(％)＝所吸收的水的重量/干凝膠的重量×100隨著交聯(lián)度即交聯(lián)比的增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得較致密，所吸收的水減少，因此干凝膠的吸水率下降。當(dāng)干凝膠吸水率是將其在作為含水介質(zhì)的生理鹽水(0.9％氯化鈉水溶液)中浸漬24小時(shí)之后進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的干凝膠吸水率通常約為20(×100％)～150(×100％)，優(yōu)選30(×100％)～120(×100％)，更優(yōu)選40(×100％)～100(×100％)。
本發(fā)明的凝膠可以是含有0.5～10％重量光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物的凝膠，按透明質(zhì)酸含量計(jì)。特別是，優(yōu)選從重均分子量為約1,000,000的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物制備的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中透明質(zhì)酸含量為1～4％重量。
能夠以動(dòng)態(tài)粘彈特性表示凝膠的粘彈性方面的物理性能，例如儲(chǔ)能模量(G′)、損耗模量(G″)和損失正切δ(tanδG″/G′)等。儲(chǔ)能模量高；損耗模量低，表示彈性高，意味著是硬凝膠。相反，損耗模量高，儲(chǔ)能模量低，意味著凝膠具有高彈性。
本發(fā)明凝膠的物理性能，以頻率10赫茲下動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，優(yōu)選為100～500帕；損耗模量(G″)為10～300帕，優(yōu)選為50～150帕；損失正切δ(tanδ；G″/G′)為0.1～0.8，優(yōu)選為0.2～0.5。
在光輻射即紫外線輻射中，紫外線種類沒有特別的限制。通常采用下述光源進(jìn)行幾秒鐘至幾分鐘光輻射或紫外線輻射，所采用的光源提供含有光反應(yīng)必須波長的光，即200～600納米，優(yōu)選200～450納米(例如高壓汞燈、金屬鹵化物燈等)，同時(shí)采用遮擋紫外線的濾波器等[如派熱克斯玻璃(商品名)等]遮擋二聚不需要的短波。對(duì)輻射方式?jīng)]有特別限制，可按其用途適當(dāng)選擇各種方式。例如將光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液裝入作為盛本發(fā)明凝膠市售最終產(chǎn)品的容器中，然后按下述進(jìn)行輻射；將所述溶液置于一對(duì)用透射紫外線的板材制的帶式運(yùn)輸器之間，然后在運(yùn)動(dòng)中輻射；或者，將光反應(yīng)透明質(zhì)酸溶液送入并使其通過透射紫外線的材料制造的管的內(nèi)部，并在送料的同時(shí)用紫外線輻射。
在制備本發(fā)明凝膠的過程中，即使光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物水溶液，在用紫外線輻射之前和/或之后，用100～125℃高壓蒸汽熱處理5～30分鐘(壓熱器處理)，也能得到具有上述規(guī)格粘彈性的凝膠。這種熱處理相當(dāng)于醫(yī)用器具或醫(yī)藥所需要的消毒過程。
對(duì)于待紫外線輻射的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液的狀況，容納該光反應(yīng)溶液進(jìn)行光反應(yīng)的容器材料和形狀、以及受紫外線照射的部分的材料和形狀沒有特別限制，只要紫外線能夠透過就行。例如它們可以是層狀、管狀、注射器狀或小瓶狀等。考慮到交聯(lián)反應(yīng)均勻性，其形狀應(yīng)利于紫外線能均勻充分地透過。使紫外線輻射薄溶液層特別適于得到均勻交聯(lián)的凝膠。光反應(yīng)容器的形狀應(yīng)能裝光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液和所制得的光反應(yīng)系統(tǒng)中的本發(fā)明的凝膠，該容器并不一定總需要是密閉容器。例如容器可以是簡單的板形。
在應(yīng)用本發(fā)明凝膠作生物醫(yī)學(xué)材料如抗粘連材料之處，優(yōu)選保存本發(fā)明凝膠的容器的形狀，應(yīng)能夠直至應(yīng)用均能消毒保存所制得的本發(fā)明的凝膠，并且能從該容器適當(dāng)?shù)厝〕瞿z供應(yīng)用。這種保存用的容器也可以用作光反應(yīng)容器。直至應(yīng)用時(shí)凝膠均能消毒保存的、并且凝膠易于被施加到給藥體或部位(當(dāng)凝膠用于抗粘連材料時(shí)，物體或部位是應(yīng)防結(jié)連的損傷部位)的容器實(shí)例包括諸如注射器、管等容器。另外，易于取出和施加凝膠的容器的實(shí)例還包括諸如小瓶等容器。
當(dāng)光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物裝到容器中、所裝的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物被紫外線輻射進(jìn)行上述光反應(yīng)時(shí)，容器的材料必須選擇透射紫外線并且不發(fā)生紫外線降解的材料。此外，在本發(fā)明凝膠是用來作為生物醫(yī)學(xué)材料施加到人體的情況下，可以優(yōu)選對(duì)光反應(yīng)之后的凝膠采用，例如，高壓蒸氣(壓熱器處理)，進(jìn)行消毒。當(dāng)裝到容器中的光固化交聯(lián)凝膠采用壓熱器消毒進(jìn)行消毒時(shí)，可以優(yōu)選容器材料是玻璃、塑料以及抗熱性達(dá)到某種程度的其他材料。對(duì)裝入所述容器的凝膠量沒有特別限制，然而，例如從操作，經(jīng)濟(jì)和其他方面考慮，其量約為0.5～500毫升。
上述光輻射得到的水凝膠可以脫水，例如采用干燥等方法，然后通過加入需要量的水介質(zhì)溶脹，提供具有本發(fā)明的上述物理性能的凝膠。在這種情況下，優(yōu)選，采用對(duì)透明質(zhì)酸糖化物鏈及交聯(lián)結(jié)構(gòu)沒有有害影響的方法，進(jìn)行干燥。
光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠也有可能以上述干燥固體凝膠的形式貯存或運(yùn)輸，在應(yīng)用之前用適當(dāng)?shù)乃橘|(zhì)將其溶脹，緊接著以再溶脹的狀態(tài)應(yīng)用。
本發(fā)明凝膠作為生物醫(yī)學(xué)材料具有很大用途。透明質(zhì)酸所固有的高生物相容性和通過交聯(lián)新增加的適于作生物醫(yī)用材料使用的特性相結(jié)合，如在生物體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間延長(保持能力改進(jìn))以及改善的物理化學(xué)性能如粘彈性等，使本發(fā)明的凝膠非常適于在醫(yī)用領(lǐng)域中應(yīng)用。
因?yàn)楸景l(fā)明凝膠所包含的大部分是無害無毒水介質(zhì)，所以對(duì)生物體沒有毒性，并且具有高安全性。
更具體地說，本發(fā)明凝膠單次量大鼠腹膜內(nèi)投藥100毫升/千克[相當(dāng)于每千克2000毫克透明質(zhì)酸]，沒有發(fā)生起因于凝膠的致死和嚴(yán)重異常。
此外，為研究自動(dòng)過敏性進(jìn)行了抗原性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)豚鼠腹膜內(nèi)用20毫克或2毫克本發(fā)明的凝膠致敏，然后再腹膜內(nèi)給藥40毫克該凝膠。結(jié)果，沒有引起過敏性反應(yīng)。
當(dāng)用本發(fā)明的凝膠用作生物醫(yī)學(xué)材料如抗粘連材料時(shí)，認(rèn)為凝膠彈性增加，改善了組織間的阻隔效應(yīng)和在體內(nèi)的保持能力，而粘性增加改善了對(duì)組織的粘著性以及對(duì)受傷部位的可注射性。所以，對(duì)于這些應(yīng)用理想的是，優(yōu)選凝膠具有彈性和粘性的優(yōu)良平衡。如果凝膠的G′超過1500，或者損失正切δ小于0.1，則成為高彈性凝膠，所謂硬而脆的凝膠，難以注到受傷部位。另一方面，如果凝膠G′小于50，或者損失正切δ超過0.8，那朱成為其行為象溶液的高粘性凝膠，不能提供理想硬度，并且還失去了抗粘連作用所需要的阻隔效應(yīng)。因此，認(rèn)為本發(fā)明的凝膠具有作為抗粘連材料的最適合的物理化學(xué)性能。
器官粘連，例如往往發(fā)生在手術(shù)之后，從臨床觀點(diǎn)看是不希望發(fā)生的，據(jù)此需要開發(fā)有效的抗粘連材料?？拐尺B材料的理想特性是，該材料(1)在易發(fā)生粘連的器官之間具有阻隔作用；(2)在傷口部位具有覆蓋性能；(3)不延緩傷口的愈合；(4)在傷口愈合期間保持在體內(nèi)，并優(yōu)選在愈合之后在體內(nèi)分解并被吸收；(5)無害、無毒、生物相容等。
通過光固化交聯(lián)得到的、具有優(yōu)良生物相容性和安全性的本發(fā)明光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，達(dá)到了上述全部要求。特別重要的阻隔效應(yīng)由交聯(lián)凝膠的物理化學(xué)性能得到，而體內(nèi)保持能力由形成的光固化交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到。
凝膠的無定形性，例如，使凝膠能經(jīng)注射嘴或針注射，即將凝膠裝到注射器中，注射到微細(xì)損傷部位(例如創(chuàng)傷部位等)。就此而論，本發(fā)明凝膠的特征在于，具有比透明質(zhì)酸溶液高得多的彈性，而且具有的硬度柔軟得使其可通過注射器的針頭。該凝膠也能通過較小直徑的管子(注射嘴)注射到損傷部位，還期待著將其施用于腹腔鏡顯微手術(shù)等。
簡言之，包含上述本發(fā)明凝膠的抗粘連材料的特征如下(1)具有優(yōu)良抗粘連作用；(2)是一種具有能注射到損傷部位的物理性能的水凝膠；(3)當(dāng)注射或施用時(shí)，具有對(duì)組織的高粘著性，也具有對(duì)組織的優(yōu)良附著性，借此在必要的抗粘連期間內(nèi)保持在損傷部位；(4)無需除去，可以從施用目的部位如腹腔等被吸收、引起代射和排泄；以及(5)具有安全性，在任何單次量毒性試驗(yàn)、多次量毒性試驗(yàn)和抗原性試驗(yàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均沒有發(fā)現(xiàn)安全向題。
當(dāng)用本發(fā)明凝膠作抗粘連材料時(shí)，應(yīng)用領(lǐng)域舉例說明如下(1)產(chǎn)科和婦科領(lǐng)域與骨盆內(nèi)手術(shù)同時(shí)發(fā)生的粘連的抗粘連，這些手術(shù)包括不孕癥治療、子宮手術(shù)、管的手術(shù)、卵巢手術(shù)、子宮內(nèi)膜異位治療手術(shù)、剖腹產(chǎn)術(shù)、骨盆內(nèi)粘連切離術(shù)等。
(2)胃腸手術(shù)領(lǐng)域在腹部手術(shù)等之后與腸粘連同時(shí)發(fā)生的粘連的抗粘連。
(3)矯形外科手術(shù)與下述手術(shù)同時(shí)發(fā)生的粘連的抗粘連，包括跟腱手術(shù)、屈肌和腱的手術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)、椎板切除術(shù)等。
本發(fā)明凝膠作為生物醫(yī)學(xué)材料應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，除了上述的抗粘連材料之外，還有如下所述。
(1)眼科手術(shù)輔藥。例如在諸如眼內(nèi)晶狀體植入、全角膜移植術(shù)等手術(shù)中，將凝膠注入前房；或者在視網(wǎng)膜脫離等中，用凝膠保持眼內(nèi)壓；或者用凝膠補(bǔ)充玻璃體。
(2)關(guān)節(jié)功能改善劑。例如將凝膠注入關(guān)節(jié)腔，其目的是減輕疼痛、改善關(guān)節(jié)可動(dòng)范圍、在諸如膝關(guān)節(jié)變形性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)周炎等關(guān)節(jié)炎治療中使生病滑液等正?；?。
(4)成形外科領(lǐng)域缺損修復(fù)術(shù)。
(5)褥瘡或燒傷敷料。
(6)緩釋藥品材料或制劑。
關(guān)于用本發(fā)明凝膠作抗粘連材料，不能規(guī)定對(duì)損傷部位施加的凝膠量，因?yàn)樵摿恳朗┘硬课坏念愋?如器官的種類等)、尺寸或狀況和施加目的而變化。通常約為0.5～500毫升/部位，優(yōu)選約為1～100毫升/部位，更優(yōu)選約為2～50毫升/部位。
本發(fā)明光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將藥品加到網(wǎng)絡(luò)中能夠提供一種緩釋(sustained release)藥品的有用制劑。能夠通過把干凝膠浸入含藥品的溶液中將藥品加到凝膠中。另外，因?yàn)楣夤袒宦?lián)凝膠在交聯(lián)后不需提純，可以先將藥品加到待輻射的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的溶液中。上述任何方法均可以應(yīng)用。
另外，能夠?qū)⑺幤吠ㄟ^化學(xué)鍵(共價(jià)鍵、離子鍵等)化學(xué)鍵合到光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物上，然后可以進(jìn)行光反應(yīng)交聯(lián)。例如當(dāng)藥品以共價(jià)鍵引入時(shí)，借助酰胺鍵或酯鍵可以使藥品和光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的羧基或羥基結(jié)合在一起，然后進(jìn)行紫外線輻射。另外，當(dāng)通過離子鍵引入藥品時(shí)，能借助離子鍵鍵合到透明質(zhì)酸的羧基上的陽離子藥品可以與光反應(yīng)透明質(zhì)酸混合，然后進(jìn)行紫外線輻射。此外，含有鍵合藥品的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物也可以進(jìn)行交聯(lián)光反應(yīng)。
實(shí)例現(xiàn)參照制備實(shí)例、實(shí)例和試驗(yàn)實(shí)例較詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明，但是不言而喻，并不認(rèn)為本發(fā)明僅限于此。
制備實(shí)例1光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 0.53％)的制備在1.5升水中溶解10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉[Seikagaku公司的產(chǎn)品，重均分子量(Mw)為950,000]，然后將750毫升1，4-二噁烷加到該溶液中。每隔5分鐘，向所得溶液順序加入50毫升含有288毫克(2.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液，50毫升含有1240毫克(1.25毫摩爾)EDC·HCl的水溶液和50毫升含有355毫克(1.25毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液，同時(shí)用冰冷卻。在室溫下攪拌該混合物8小時(shí)之后，加入10克氯化鈉的水溶液，隨后攪拌1小時(shí)。將所得溶液倒入5升乙醇中。離心過濾(4000轉(zhuǎn)/分鐘×15分鐘)收集如此形成的目的沉淀物，順序用3份80％乙醇和1份乙醇洗滌，然后干燥，得到9.73克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為0.53％，內(nèi)毒素含量為0.8pg/mg)。
該制備實(shí)例和以下制備實(shí)例及實(shí)例中的內(nèi)毒素含量采用ToxicolorSystem LS-20儀、DIA儀和Et-1儀測(cè)定。所有儀器均購自Seikagaku公司(商標(biāo)名，下同)光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的內(nèi)毒素含量的測(cè)定方法，包括先將實(shí)例中敘述的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用酶(如軟骨素酶(chondroitinase)ABC，Seikagaku公司等產(chǎn)品)消化溶解，然后用上述方法進(jìn)行測(cè)定。
關(guān)于內(nèi)毒素含量，一個(gè)內(nèi)毒素單位(EU)相當(dāng)于345pg內(nèi)毒素。
制備實(shí)例2光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 0.75％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、65毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(3.25毫摩爾)二噁烷溶液、65毫升0.025M的EDC·HCl(1.625毫摩爾)水溶液，和65毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(1.625毫摩爾)水溶液。得到9.74克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為0.75％，內(nèi)毒素含量為2.5pg/mg)。
制備實(shí)例3光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 0.90％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用2.0克(5.0毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、3毫升含有69毫克(0.6毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的水溶液、3毫升含有58毫克(0.3毫摩爾)EDC·HCl的水溶液，以及3毫升含有85毫克(0.3毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到2.1克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為0.90％，內(nèi)毒素含量為2.4pg/mg)。
制備實(shí)例4光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 1.06％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、100毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(5.0毫摩爾)二噁烷溶液、100毫升0.025M的EDC·HCl(2.5毫摩爾)水溶液，和100毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(2.5毫摩爾)水溶液。得到9.64克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為1.06％，內(nèi)毒素含量為3.2pg/mg)。
制備實(shí)例5光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 1.26％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用5克(12.5毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、50毫升的288毫克(2.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液、50毫升的240毫克(1.25毫摩爾)EDC·HCl的水溶液，以及50毫升的355毫克(1.25毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到4.9克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為1.26％，內(nèi)毒素含量為1.0pg/mg)。
制備實(shí)例6光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 1.29％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、50毫升0.1M的N-羥基琥珀酰亞胺(5.0毫摩爾)二噁烷溶液、50毫升0.05M的EDC·HCl(2.5毫摩爾)水溶液，和50毫升0.05M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(2.5毫摩爾)水溶液。得到10.0克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為1.29％，內(nèi)毒素含量為2.5pg/mg)。
制備實(shí)例7光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 1.55％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、150毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(7.5毫摩爾)二噁烷溶液、150毫升0.025M的EDC·HCl(3.75毫摩爾)水溶液，和150毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(3.75毫摩爾)水溶液。得到9.92克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為1.55％，內(nèi)毒素含量為1.2pg/mg)。
制備實(shí)例8光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 1.93％)的制備在600毫升水中溶解4.0克(10.0毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)，再加入300毫升1.4二噁烷于該溶液中。每間隔5分鐘向所得溶液中順序加入10毫升含有230毫克(2.0毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的水溶液，10毫升含有192毫克(1.0毫摩爾)EDC·HCl的水溶液以及10毫升含有284毫克(1.0毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液，同時(shí)用冰冷卻。在室溫下攪拌所得混合物24小時(shí)之后，將2.0克氯化鈉的水溶液加入其中，隨后攪拌。將所制得的溶液倒入3.0升乙醇中。離心分離(4000轉(zhuǎn)/分鐘×15分鐘)收集如此形成的目的沉淀物，順序用80％乙醇洗滌3次，用乙醇洗滌1次，干燥，得到4.1克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為1.93％，內(nèi)毒素含量為2.1pg/mg)。
制備實(shí)例9光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 2.87％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、50毫升含有864毫克(7.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液、50毫升含有718毫克(3.75毫摩爾)EDC·HCl的水溶液、以及50毫升含有1.06克(3.75毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到10克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為2.87％，內(nèi)毒素含量為2.8pg/mg)。
制備實(shí)例10光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS 2.28％)的制備本衍生物按與制備實(shí)例1相同的方法進(jìn)行制備，使用50克(125毫摩爾二糖單元)透明質(zhì)酸鈉(Seikagaku公司產(chǎn)品，Mw為950,000)、250毫升含有3.45克(30毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺水溶液、250毫升含有2.88克(15毫摩爾)EDC·HCl的水溶液、以及250毫升含有15毫摩爾HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到49克光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物白色固體(DS為2.28％，內(nèi)毒素含量為3.2pg/mg)。
實(shí)例1本實(shí)例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該方法包括在水溶液中使制備實(shí)例6中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行光固化交聯(lián)，隨后用1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)置換介質(zhì)。
將制備實(shí)例6制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS為1.29％)的1.4％重量水溶液置于一對(duì)派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側(cè)均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計(jì)8分鐘)，然后在45℃下干燥。將1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)加到所制得的干燥凝膠之中，調(diào)節(jié)濃度至2％重量。然后將干燥凝膠溶脹1天，得到光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(內(nèi)毒素含量為0.11EU/g)。
實(shí)例2本實(shí)例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該方法包括對(duì)1.4％重量的在制備實(shí)例1，4和7中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進(jìn)行光固化交聯(lián)。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實(shí)例1、4和7制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS分別為0.53％、1.06％和1.55％)的1.4％重量的溶液分別置于一對(duì)派熱克斯耐熱玻璃板之間，每塊玻璃板的厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側(cè)用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計(jì)8分鐘)，得到光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
在DS分別為0.53％、1.06％和1.55％的凝膠中，內(nèi)毒素含量分別為0.03、0.12、和0.05EU/g。
實(shí)例3本實(shí)例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該方法包括對(duì)2.0％重量的在制備實(shí)例1～9中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進(jìn)行光固化交聯(lián)。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實(shí)例1～9中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS分別為0.53％、0.75％、0.90％、1.06％、1.26％、1.29％、1.55％、1.93％和2.87％)的2.0％重量的溶液分別置于一對(duì)派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側(cè)均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計(jì)8分鐘)，得到光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
實(shí)例4本實(shí)例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠；該方法包括對(duì)3.2％重量的在制備實(shí)例1、4和7中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進(jìn)行光固化交聯(lián)。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實(shí)例1，4和7中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物(DS分別為0.53％、1.06％、1.55％)的3.2％重量的溶液分別置于一對(duì)派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5mm，其間隔為1.0毫米，每側(cè)均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計(jì)8分鐘)，得到光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
實(shí)例5本實(shí)例涉及按下述方法得到的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該方法包括對(duì)實(shí)例3中的DS分別為1.55％和2.87％的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠進(jìn)行熱處理。
將實(shí)例3中從DS分別為1.55％和2.87％的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物制得的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠分別裝于10毫升安瓿中，在121℃壓熱器中進(jìn)行8分鐘熱處理。
物理性能測(cè)定測(cè)定下述材料的動(dòng)態(tài)粘彈性[儲(chǔ)能模量G′，損耗模量G″、損失正切δ，tanδ(G″/G′)]、動(dòng)態(tài)粘度(η)和吸水率；這些材料是，制備實(shí)例1，4，5和7中制得的制備濃度(溶液濃度以透明質(zhì)酸濃度表示)分別為1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的溶液，實(shí)例2～4制備的制備濃度分別為1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以及在實(shí)例5中制備的熱處理了的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。按如上所述，還測(cè)定了所制備的透明質(zhì)酸溶液的物理性能，其制備濃度與上述光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備濃度相同。采用Carri-Med公司制造的CSL-50型流變儀在下述條件下測(cè)定動(dòng)態(tài)粘彈性和動(dòng)態(tài)粘度。
測(cè)定方法振動(dòng)試驗(yàn)法，應(yīng)力控制測(cè)定溫度37℃測(cè)定外形尺寸(geometry)4厘米間隙800微米頻率10赫茲吸水率按照如下所述的使用歐洲專利0205674 A1中公開的蘭色葡聚糖(Blue Dextran)(下文縮寫為“B.D”)通過紫外線吸光度法進(jìn)行測(cè)定。使用生理鹽水(0.9％氯化鈉水溶液)作為水介質(zhì)。
當(dāng)干凝膠置于B.D.溶液中時(shí)，凝膠僅吸收水，因?yàn)榫哂懈叻肿恿康腂.D.不能進(jìn)入凝膠。所以，未吸收的剩余B.D.溶液濃度，與初始濃度比起來，隨著水被吸收而增加。這種濃度差異得自吸光度(610納米)，然后按下述方程計(jì)算吸水率吸水率(×100％)＝(1-y1/y2)/A×1000式中y1是初始濃度為每克0.1％重量B.D.溶液中干凝膠A毫克時(shí)的吸光度，y2是在B.D溶液中溶漲24小時(shí)之后的吸光度。
另外，還對(duì)在實(shí)例3中從DS為0.53％、0.75％、0.90％、1.26％、1.55％和1.93％的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物制備的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠干樣品進(jìn)行了吸水率測(cè)定。
關(guān)于動(dòng)態(tài)粘彈性等的某些測(cè)定結(jié)果示于表1。DS與吸水率的關(guān)系示于圖2。在表1中，分析樣品的實(shí)測(cè)濃度是通過按照咔唑-硫酸反應(yīng)法測(cè)定凝膠的透明質(zhì)酸成分含量得到的。
表1濃度 濃度頻率 10Hz實(shí)例序號(hào)DS(制備)(實(shí)測(cè))熱處理G′ G″ tanδ η(％)(％) (％) (Pa)(Pa)(Pa·s)2 0.531.4 1.22 - 66 41 0.630.71.061.4 1.37 - 146 65 0.451.01.551.4 1.24 - 149 64 0.431.0透明質(zhì)酸1.4 1.38 - 46 44 0.970.73 0.532.0 1.96 - 146 78 0.531.21.062.0 1.81 - 339 109 0.321.71.262.0 1.70 - 273 96 0.351.51.552.0 2.04 - 342 105 0.311.72.872.0 1.62 - 427 103 0.241.7透明質(zhì)酸2.0 2.00 - 241 102 0.421.64 0.533.2 2.63 - 550 216 0.393.41.063.2 2.77 - 818 223 0.273.51.553.2 2.78 - 1002248 0.253.9透明質(zhì)酸3.2 3.35 - 560 304 0.544.85 1.552.0 2.04 121℃，8分鐘 173 86 0.501.42.782.0 1.62 121℃，8分鐘 310 101 0.321.6透明質(zhì)酸3.2 3.02 121℃，8分鐘 407 281 0.694.5
實(shí)例6本實(shí)例涉及按下述方法制備的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，該方法包括對(duì)2.0％重量的在制備實(shí)例10中制得的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液，在不同條件下進(jìn)行紫外線輻射，并進(jìn)行熱處理。
將制備實(shí)例10中制備的DS為2.28％的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶解于1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中，成為2.0％重量的溶液。按照下述三種方法對(duì)所制得的溶劑進(jìn)行紫外線輻射。在紫外線輻射之前和/或之后，在下述條件下，對(duì)溶液(或凝膠)進(jìn)行熱處理。測(cè)定所得凝膠的交聯(lián)比、交聯(lián)度和粘彈特性。
紫外線輻射(UV輻射)條件(1)與實(shí)例2～4相同的方法。將光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水溶液置于一對(duì)派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，用3千瓦金屬鹵化物燈的紫外線從每側(cè)輻射4分鐘(共計(jì)8分鐘)。
(2)將該溶液置于一對(duì)聚乙烯薄膜之間，用400瓦高壓汞燈的紫外線從一側(cè)輻射3秒鐘。
(3)將該溶液在送入并通過直徑5毫米石英管的同時(shí)用400瓦高壓汞燈輻射。
熱處理?xiàng)l件(壓熱器處理法)A.在UV輻射之后，121℃，8分鐘B.在UV輻射之前，121℃，8分鐘C.在UV輻射之前，121℃，8分鐘；然后，在UV輻射之后，100℃，10分鐘D.在UV輻射之后，121℃，15分鐘測(cè)試結(jié)果示于下表2。
其中交聯(lián)比用如下方程計(jì)算。
交聯(lián)比(％)＝二聚的肉桂酸摩爾數(shù)×2/引入的肉桂酸摩爾數(shù)×100更具體地說，將肉桂酸或其二聚物從光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中化學(xué)裂解并提取出來。利用肉桂酸和其二聚體之間的分子量差異，通過凝膠滲透色譜法(GPC)將提取物分離成肉桂酸和其二聚體，定量測(cè)定每個(gè)組分，得到各自的摩爾數(shù)。然后按上述方程計(jì)算交聯(lián)比。
交聯(lián)度從下述方程計(jì)算。
交聯(lián)度(％)＝DS×交聯(lián)比/100正如從上述方程所見，當(dāng)交聯(lián)比是以引入的肉桂酸為基礎(chǔ)計(jì)算的數(shù)值時(shí)，交聯(lián)度(交聯(lián)比和DS的乘積)能以每個(gè)透明質(zhì)酸的二糖單元成分的二聚體的摩爾比(％)表示。
表2光輻熱處頻率10 赫茲DS射條件理?xiàng)l件交聯(lián)比交聯(lián)度G′G″tanδη(％) (％)％) (帕) (帕) (帕秒)2.28(1)A 4.1 9.4×10-2161680.42 1.12.28(2)A 1.9 4.4×10-2122560.46 0.92.28(3)B 2.5 5.6×10-2146700.48 1.32.28(3)C 2.5 5.6×10-2144840.59 1.32.28(2)D 1.9 4.4×10-2108840.78 1.
試驗(yàn)實(shí)例1在大鼠子宮角模型中的抗粘連作用本試驗(yàn)實(shí)例涉及下述材料在大鼠子宮角粘連模型中的抗粘連作用，這些材料是，實(shí)例1、3、5和6制得的凝膠，以及為比較用的，如實(shí)例1和3那樣制備的紫外線輻射前的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物溶液(下文稱為未交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠)、市售的抗粘連材料TC7[Interceed(商品名)，Johnson&Johnson公司生產(chǎn)]，以及在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水中的3.2％重量透明質(zhì)酸溶液。
1.試驗(yàn)動(dòng)物購置七周CrjSD(SPF)雌大鼠，試驗(yàn)前喂養(yǎng)一周。每組五只2.試驗(yàn)方法2-1大鼠子宮角粘連模型的準(zhǔn)備方法在戊巴比妥鈉麻醉下，對(duì)大鼠腹進(jìn)行備皮。劃約4厘米長中線切口。
(a)用眼科手術(shù)環(huán)鋸將右腹壁切至肌層，并用鑷子剝離肌層。
(b)暴露子宮角，從卵巢下約1厘米向子宮頸以2～3毫米間距劃4個(gè)橫切口。每次切開隨時(shí)用電灼術(shù)止血。
(c)將從子宮角上橫切口端約3～4毫米的部位以及從腹壁損傷端3～4毫米部位合攏，用8/0單股縫線將上述(a)和(b)中造成的外傷縫合。
2-2給藥試驗(yàn)組在腹壁損傷部位和子宮角切口部位間注入或嵌入下述材料，它們是均為1毫升的上述光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠、未交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠和透明質(zhì)酸溶液，以及面積為1.5×1.5厘米2的市售TC7。更具體地說，上述凝膠按如下方式給藥。將精確計(jì)量的各1毫升上述凝膠裝入1毫升注射器[Terumo注射器，用于結(jié)核菌素(tukerculin)(商品名)，經(jīng)r-射線消毒，管內(nèi)徑約4毫米，端部內(nèi)徑約1毫米]，經(jīng)注射器端部注入腹壁損傷部位和子宮角切口部位之間。
對(duì)照組在用于實(shí)驗(yàn)組的同一動(dòng)物左側(cè)腹壁和子宮角進(jìn)行相同操作，但是沒有嵌入抗粘連材料。
3.評(píng)判
3.評(píng)判植藥后七天，將大鼠在乙醚麻醉下經(jīng)頸動(dòng)脈驅(qū)血?dú)⑺?。解剖之后，按如下記分系統(tǒng)，評(píng)判經(jīng)受粘連部位的粘連程度。
0無粘連1稍粘連但易分開2中等粘連但可分開3嚴(yán)重粘連且不可分開4.結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果示于下表3。在表3中，紫外線輻射條件和熱處理?xiàng)l件與實(shí)例6所述相同。
表3光輻 熱處抗粘連效果實(shí)例序號(hào)DS射條件理?xiàng)l件試驗(yàn)組對(duì)照組(％)1 1.29(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，2- 1.29未輻射 - 2，2，2，2，22，2，2，2，23 1.06(1) - 1，1，0，0，02，2，2，2，23 1.26(1) - 2，0，0，0，02，2，2，2，2- 1.26未輻射 - 2，2，2，2，02，2，2，2，23 1.55(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，25 1.55(1) A 0，0，0，0，02，2，2，2，23 2.87(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，25 2.87(1) A 0，0，0，0，02，2，2，2，26 2.28(2) A 1，0，0，0，02，2，2，2，26 2.28(3) D 1，0，1，0，02，2，2，2，2比較例TC7-- - 2，2，2，2，22，2，2，2，23.2％透明質(zhì)酸溶液 A 2，2，2，2，22，2，2，2，2
正如從表3的結(jié)果所見，市售抗粘連薄膜TC7在本粘連模型中不完全有效，而按照本發(fā)明的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在本模型中具有充分有效的抗粘連作用。
具有與光交聯(lián)凝膠相似的粘彈性和粘度的未交聯(lián)凝膠或3.2％透明質(zhì)酸溶液沒有抗粘連效果，據(jù)此，可以認(rèn)為本發(fā)明光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的抗粘連作用歸因于光固化交聯(lián)。
試驗(yàn)實(shí)例2本試驗(yàn)實(shí)例涉及在與試驗(yàn)實(shí)例1相同的大鼠子宮角粘連模型中本發(fā)明凝膠的抗粘連作用，只是沒有對(duì)腹壁損傷部位和子宮角切口部位進(jìn)行止血。
本發(fā)明凝膠的抗粘連作用采用與試驗(yàn)實(shí)例1相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)和評(píng)價(jià)，不同之處在于，本實(shí)例沒有對(duì)腹壁和子宮角切口止血，所采用的是0.5毫升濃度為2％、DS為2.5％的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，并且在紫外線輻射之前對(duì)其在105℃下進(jìn)行了10分鐘熱處理，在紫外線輻射之后對(duì)其在121℃下進(jìn)行了8分鐘熱處理(n＝10)。
作為對(duì)照試驗(yàn)，采用與試驗(yàn)實(shí)例1相同的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組所使用的同一動(dòng)物進(jìn)行了試驗(yàn)，但沒有嵌入抗粘連材料。
所得結(jié)果示于表4。
表4動(dòng)物號(hào)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組12 022 032 042 052 062 072 082 292 010 2 0
0.5毫升劑量的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠對(duì)未接受止血的模型具有顯著抗粘連作用。換句話說，表4結(jié)果證明，光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠優(yōu)于市售TC7，后者不能施加到未進(jìn)行止血的損傷部位。
試驗(yàn)實(shí)例3光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在大鼠類腸粘連模型中的抗粘連效果1.試驗(yàn)材料光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，濃度為2％，DS為2.5％；在紫外線輻射前在105℃下進(jìn)行10分鐘熱處理，并且在紫外線輻射后在121℃進(jìn)行8分鐘熱處理。
2.試驗(yàn)動(dòng)物購置七周SD雌大鼠，在試驗(yàn)前喂養(yǎng)一周。
3.粘連模型的準(zhǔn)備方法對(duì)從回腸至結(jié)腸的漿液膜成直線地進(jìn)行剝離，剝離長度為20厘米，寬度為3～4毫米，不進(jìn)行止血。
4.給藥和分組從1毫升注射器注射規(guī)定量(0.5毫升、1.0毫升或2毫升)凝膠，施加到損傷部位。敷用之后，將腸管移入腹腔，然后封閉腹部。未敷用凝膠的粘連模型作為對(duì)照組。敷用0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升凝膠的模型分別作為0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升組。每組10只大鼠。
5.評(píng)判和結(jié)果植藥后七天，將大鼠在乙醚麻醉下經(jīng)頸動(dòng)脈驅(qū)血?dú)⑺?。解剖后，按與試驗(yàn)實(shí)例1相同的記分系統(tǒng)評(píng)判粘連程度。所得結(jié)果示于下表5。
表5試驗(yàn)組動(dòng)物序號(hào)對(duì)照組0.5毫升1.0毫升2.0毫升1 2 0 0 02 2 0 0 03 2 1 0 04 2 0 0 05 2 0 0 06 2 0 0 17 2 0 0 08 1-2 0 0 09 1-2 1-2 0 010 1-2 0 0 0與對(duì)照組相比，三個(gè)試驗(yàn)組全部具有顯著抗粘連作用。表5結(jié)果說明本發(fā)明凝膠不僅對(duì)抗粘連有效，而且，在考慮到有力的腸蠕動(dòng)的情況下，在對(duì)組織的粘著性以及與組織的生物相容性方面，它均顯示優(yōu)越性能。
另外，在上述試驗(yàn)實(shí)例1和2動(dòng)物試驗(yàn)中，植藥后七天解剖時(shí)，肉眼觀察得知大部分植入的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠消失。如此，顯示了本發(fā)明凝膠的生物降解能力。
如上所述并證明，光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠易于通過用紫外線輻射高濃度光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物水溶液制備。本發(fā)明的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在保持透明質(zhì)酸固有優(yōu)良性能的同時(shí)，如無毒、非抗原性、生物相容性、生物降解能力等，還具有如下物理性能，如適當(dāng)?shù)恼硰椥?、組織親合力和生物降解能力等。所以，預(yù)期它將作為高度安全的醫(yī)學(xué)材料用于各種領(lǐng)域，例如作為抗粘連材料、作為緩解藥品的載體等。另外，該凝膠能夠借助注射器、管等注射到機(jī)體受傷細(xì)微部位，所以預(yù)期會(huì)應(yīng)用于顯微外科等。
權(quán)利要求
1.一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)來0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)。
2.一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其交聯(lián)度為每摩爾的透明質(zhì)酸二糖成分單元0.01～0.5％，以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射。
3.按照權(quán)利要求1或2的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述的光反應(yīng)交聯(lián)基，是一種含有間隔基的肉桂酸衍生物，并且是化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上，從而提供所述的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物；使所述光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的所述光反應(yīng)相互交聯(lián)基通過紫外線輻射二聚，形成環(huán)丁烷環(huán)，借此形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；以及所述的凝膠是一種在所述網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中含有水介質(zhì)的水凝膠。
4.按照權(quán)利要求3的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述的間隔基是從氨基醇、氨基酸或肽衍生的基團(tuán)。
5.按照權(quán)利要求3或4的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中所述光反應(yīng)交聯(lián)基用如下通式(1)或(2)表示-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph (1)式中，R1和R2彼此獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基；Ph代表苯基；而n代表整數(shù)2～18；-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)式中，R3代表低級(jí)烷基或芳烷基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或-NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼此獨(dú)立代表氫原子或低級(jí)烷基；Ph代表對(duì)亞苯基；m代表整數(shù)1～6；以及h代表整數(shù)1～18。
6.按照權(quán)利要求1～5中任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中引入的所述光反應(yīng)交聯(lián)基的比例為每摩爾二糖單元成分0.05～10％。
7.一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)，然后對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行熱處理。
8.一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行熱處理，然后對(duì)加熱過的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)。
9.一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，以頻率10赫茲下的動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對(duì)其中含化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)交聯(lián)基的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行熱處理，然后對(duì)加熱過的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射，使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián)，然后再對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行熱處理。
10.按照權(quán)利要求1～9中的任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其中凝膠的內(nèi)毒素含量為0.25EU/g(內(nèi)毒素單位/克)或者更低。
11.一種制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，包括對(duì)含有0.5～10％重量的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水介質(zhì)溶液進(jìn)行紫外線輻射，其中透明質(zhì)酸的官能基上化學(xué)鍵合了光反應(yīng)交聯(lián)基；和通過光反應(yīng)相互交聯(lián)基二聚，形成分子間和/或分子內(nèi)交聯(lián)，得到網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
12.按照權(quán)利要求11制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，其中，在用紫外線輻射所述光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物的水介質(zhì)溶液之前和/或之后，對(duì)其進(jìn)行熱處理。
13.按照權(quán)利要求12制備光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法，其中，所述熱處理采用高壓蒸汽在100～125℃下進(jìn)行5～30分鐘。
14.一種生物醫(yī)學(xué)材料，它包含按照權(quán)利要求1～10中任何一項(xiàng)的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
15.按照權(quán)利要求14的生物醫(yī)學(xué)材料，它具有抗粘連作用。
16.一種生物醫(yī)學(xué)材料器材，它包含交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器。
17.按照權(quán)利要求16的生物醫(yī)學(xué)材料器材，其中，所述容器是能夠?qū)⑺瞿z排出以便注射的容器。
18.一種生物醫(yī)學(xué)材料器材，它包含權(quán)利要求1～10中任何一項(xiàng)敘述的光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器。
19.按照權(quán)利要求18的生物醫(yī)學(xué)材料器材，其中所述容器是能夠?qū)⑺瞿z排出以便注射的容器。
全文摘要
一種光固化交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠,以頻率10赫茲下動(dòng)態(tài)粘彈性表示,其儲(chǔ)能模量(G′)為50～1500帕,損耗模量(G″)為10～300帕,以及損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8;它是一種按下述方法制備的水凝膠,該方法包括:對(duì)有光反應(yīng)交聯(lián)基化學(xué)鍵合到透明質(zhì)酸官能基上的光反應(yīng)透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行紫外線輻射,使光反應(yīng)相互交聯(lián)基交聯(lián);以及制備該凝膠的方法和其作為生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1207744SQ96199650
公開日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1996年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月15日
發(fā)明者脅道典, 宮本建司 申請(qǐng)人:生化學(xué)株式會(huì)社