促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜上人源成骨細胞粘附、鋪展情況。
[0044]圖8為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜上人源成骨細胞的成骨分化特異基因OPN的表達情況。
[0045]圖9為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜上人源成骨細胞的成骨分化特異基因OC的表達情況。
[0046]圖10為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜上人源成骨細胞的成骨分化特異基因ALP的表達情況。
[0047]圖11為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜上人源成骨細胞的成骨分化特異基因COLI的表達情況。
【具體實施方式】
[0048]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0049]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0050]實施例1層層自組裝法構(gòu)建促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜 1、制備
51.利用己二胺處理，將基片表面進行氨基化處理；
52.將表面氨基化的基片置于用HEPES配制的肝素/酪蛋白溶液(負電大分子組裝溶液)中，浸泡15min，使PU表面吸附上一層帶負電的酪蛋白和肝素；然后移至pH值為7的HEPES溶液中漂洗3次；
所述肝素/酪蛋白溶液中酪蛋白的濃度為0.2 mg/mL和肝素的濃度為4 mg/mL ；
53.將S2得到的完成組裝聚陰電解質(zhì)的基片置于aFGF/膠原溶液(正電大分子組裝溶液)中，浸泡15min，以吸附單分子層膠原和aFGF ;然后移至pH值為7的HEPES溶液中漂洗3次；
所述aFGF/膠原溶液用乙酸調(diào)節(jié)其pH至4.8，所述aFGF/膠原溶液中膠原的濃度為1.0mg/mL, aFGF 的濃度為 0.2 mg/mL ；
54.步驟S3完成后，多次循環(huán)重復(fù)步驟S2和S3，即得到促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜(根據(jù)循環(huán)次數(shù)不同，可得到不同組裝層數(shù)的復(fù)合多層膜)。
[0051]其中，步驟S2或S3所述HEPES溶液的配方為:2.383g Hepes和8.770g NaCl溶于 100mL 純水，加 NaOH 調(diào) PH 7.0。
[0052]實施例2通過組裝層數(shù)調(diào)控肝素在復(fù)合多層膜中的含量
按照實施例1的方法制備復(fù)合多層膜，利用甲苯胺藍法測定肝素在層層自組裝過程中的含量。
[0053]1、測定復(fù)合多層膜上負載肝素的含量
(O根據(jù)實施I進行組裝，每組裝上一層肝素后，把復(fù)合多層膜浸泡在500 UL的甲苯胺藍緩沖液中，搖床混合30min ;所述甲苯胺藍緩沖液的配方為:稱取0.2g NaCl, 100uL36%濃鹽酸和5mg甲苯胺藍溶于100mL去離子水。
[0054](2)加入ImL的正己燒，搖床混合均勾20min ；
(3)移走有機相，取下層水相，加入96孔板，在631nm波長下用紫外分光光度計檢測吸收值。
[0055](4)取Img肝素溶于1mL水中，配成0.lmg/mL的母液，用母液配備O、1、2.5、5、10
和25 μ g/mL等不同梯度的肝素標準液。對肝素標準液進行相同步驟，得到不同梯度濃度肝素溶液對應(yīng)的吸收值，繪制吸收值與肝素濃度對應(yīng)關(guān)系的標準曲線。
[0056](5)根據(jù)肝素標準曲線計算復(fù)合多層膜上負載肝素的含量，并分析肝素負載量與組裝濃度以及組裝層數(shù)之間的關(guān)系。
[0057]3、結(jié)果如附圖1所示，結(jié)果表明多層膜中肝素含量隨組裝層數(shù)增加而增加。
[0058]實施例3通過調(diào)節(jié)組裝層數(shù)來調(diào)控生長因子在多層膜中的含量
按照實施例1的方法制備復(fù)合多層膜，利用羅丹明標記酸性成纖維細胞生長因子后的熒光追蹤測定酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜的成功構(gòu)建。
[0059]1、用羅丹明(RD)標記酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)，得到羅丹明標記的酸性成纖維細胞生長因子(RD-aFGF)。
[0060]2、RD-aFGF替代未標記的aFGF，根據(jù)實施例1進行組裝，每組裝上一層aFGF后，用酶標儀檢測其熒光強度。
[0061]3、重復(fù)步驟2，酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜構(gòu)建完成，并分析熒光強度與組裝層數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果如附圖2所示，結(jié)果表明多層膜中生長因子含量隨組裝層數(shù)增加而增加。
[0062]實施例4通過調(diào)節(jié)組裝層數(shù)來調(diào)控酪蛋白在多層膜中的含量
按照實施例1的方法制備復(fù)合多層膜，利用FITC-casein熒光追蹤測定酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜的成功構(gòu)建。
[0063]1、用異硫氰酸熒光素(FITC)標記酪蛋白(casein)，得到異硫氰酸熒光素標記的酪蛋白(FITC-casein)。
[0064]2、用FITC-casein替代未標記的casein，根據(jù)實施例1進行組裝，每組裝上一層casein后，用酶標儀檢測其熒光強度。
[0065]3、重復(fù)步驟2，直到酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜構(gòu)建完成，并分析熒光強度與組裝層數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果如附圖3所示，結(jié)果表明多層膜中酪蛋白含量隨組裝層數(shù)增加而增加。
[0066]實施例5通過改變肝素組裝濃度調(diào)控肝素和生長因子在復(fù)合多層膜中的含量
1、按照實施例1的方法，不同之處在于分別改變實施例1中肝素溶液濃度為0.4 mg/mL和0.04 mg/mL，可獲得不同肝素含量的復(fù)合多層膜。
[0067]2、按照實施例2和3的測定方法，測定復(fù)合多層膜中肝素、生長因子的含量。
[0068]3、結(jié)果表明復(fù)合多層膜中肝素和生長因子的含量可由組裝材料溶液濃度(肝素溶液濃度)進行有效的調(diào)控。
[0069]實施例6酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜的體外礦化
1、配制模擬礦化液(模擬體內(nèi)礦化條件)，各離子濃度如下:Na+ 142.0 mM，K+ 5.0mM,Mg2+ 1.5mM，Ca2+ 2.5mM，CF 103.0mM, HC03_ 4.2mM，HPO42- 1.0mM, S042_ 0.5mM。
[0070]2、把實施例1制備的酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜及對照組未改性的膜浸泡在模擬礦化液中，隔天換液；礦化后樣品用去離子水輕緩沖洗后冷凍干燥。
[0071]3、將礦化樣品固定于樣品臺上，噴金處理，置于熱場發(fā)射掃描電鏡下觀察。
[0072]觀察到7天礦化后，酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜表面上散落分布的羥基磷灰石；14天礦化后，羥基磷灰石沉積增加并連成了一片(如附圖4所示)。表明了本發(fā)明方法制備的酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜具有很好的促成骨化作用。
[0073]實施例7酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜的細胞相容性評價
1、將實施例1制備的復(fù)合多層膜滅菌后置于24孔板內(nèi)，并把P4代骨髓間充質(zhì)干細胞按2000細胞/cm2(cell/cm2)密度接種于酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜上，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α -MEM, 10% FBS, 100 U/mL 青霉素，100 μ g/mL 鏈霉素，0.25 μ g/mL 二性霉素 B)于 37°C的5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2天換液。
[0074]2、FDA染色:去掉培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗三次，加入200 μ L的FDA溶液，培養(yǎng)箱中放置1min，錫箔紙避光。取出，吸去染色液，用PBS清洗三次，加入PBS后置于熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長484nm，發(fā)射波長520nm。結(jié)果如附圖5所示，本發(fā)明制備的酪蛋白-生長因子復(fù)合多層膜上骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附和生長情況非常好。