足了骨修復和再生中對于生物礦化和組織再生的特定要求。
[0024]酪蛋白是牛奶的主要組成成分，由乳腺上皮細胞合成的，是乳中特有的一組含有大量磷和鈣的蛋白，磷以磷酸酯鍵的形式與絲氨酸(Ser)的羥基結(jié)合。除磷和鈣外，酪蛋白含有少量的己糖、氨基糖和唾液酸等殘基。酪蛋白不是單一組分的蛋白質(zhì)，而是由一類在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上相近的蛋白質(zhì)組成的，包括a s1-酪蛋白，as2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ -酪蛋白。它們都是鏈狀的兩親性蛋白質(zhì)，主要特征是有高含量的磷酸絲氨酸殘基和相當多的脯氨酸。其中酪蛋白具有許多獨特的結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)含有5個磷酸絲氨酸，結(jié)合位點集中在N端，主要肽鏈的第14~21位，豐富的磷酸絲氨酸結(jié)構(gòu)能夠形成一個高度的磷酸化區(qū)，使得酪蛋白很容易吸附鈣離子而凝聚成沉淀，形成類似骨組織的磷灰石，因此，酪蛋白在骨組織工程中具有巨大的應用潛力，但目前還未被重視和較少使用。
[0025]生長因子(Growth factor)是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質(zhì)，存在于血小板和各種成體與胚胎組織及大多數(shù)培養(yǎng)細胞中，對不同種類細胞具有一定的專一性。生長因子是一類多肽類物質(zhì)，在組織的形成中扮演著重要的角色，對細胞的粘附、增殖、迀移、分化、基因表達起調(diào)控作用，并且不同組織器官細胞所需要的生長因子不同。生長因子在一般的環(huán)境中活性半衰期短，因此，在組織支架中如何負載生長因子、并維持生長因子的活性和有效活性劑量，以及在體內(nèi)的釋放和劑量調(diào)控，是當前組織工程支架要解決的問題。傳統(tǒng)的負載生長因子方法主要有物理吸附法、化學固定法和凝膠包埋。這些負載方式不能有效地保持生長因子的活性或無法得到長時間的釋放效果。
[0026]本發(fā)明利用層層自組裝技術(shù)改善生物材料表面的生物相容性，提供一種行之有效的生長因子緩釋方式，把酸性成纖維細胞生長因子(如酸性成纖維細胞生長因子aFGF)和酪蛋白負載到生物材料表面，酪蛋白對鈣離子有良好的吸引和接收能力，使其在材料表面沉淀和聚集，形成類似骨組織的磷灰石，從而構(gòu)建了生物相容性好、促成骨化的生物材料界面。靜電吸附的物理作用既不會破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)，而且作為聚陰離子的肝素和aFGF有很高的特異性結(jié)合能力，能夠有效提高aFGF的生物活性和穩(wěn)定性，并通過改變肝素的組裝濃度，從而調(diào)節(jié)酸性成纖維細胞生長因子的負載量，控制生長因子有效和持續(xù)地釋放。并且創(chuàng)造性地引入了天然具有促生物礦化的生物大分子酪蛋白，從而構(gòu)建具有促成骨化特性的生物活性復合多層膜。為組織工程支架材料表面生物活性化和功能化提供了一種簡單、行之有效的方法。
[0027]以常用的生物可降解聚酯材料為基底材料，不同的聚陰和聚陽解質(zhì)交替組裝到聚酯基體表面，構(gòu)成了促成骨化的酪蛋白/生長因子復合多層膜，其中，每個循環(huán)中，第一層物質(zhì)為酪蛋白和肝素，第二層為生長因子和膠原。創(chuàng)造性地將四種具有優(yōu)異物化性質(zhì)的生物大分子交替沉積到同一基底材料上，并根據(jù)肝素特異性結(jié)合生長因子這一特性，從而通過改變肝素的濃度，調(diào)節(jié)生長因子的負載量。特別地，引入了天然具有生物礦化能力的生物大分子酪蛋白，對鈣離子有很強的吸附力，從而鈣離子在材料表面沉淀、凝聚成團，形成類似骨組織的磷灰石，為構(gòu)建促成骨化復合膜提供了依據(jù)。
[0028]本發(fā)明實施例中采用的技術(shù)及表征手段包括復合多層膜構(gòu)建、甲苯胺藍法測定肝素含量、FITC標記酪蛋白和羅丹明標記aFGF的熒光追蹤、模擬體液體外礦化以及細胞相容性評價。為了監(jiān)控和驗證技術(shù)的有效性，以及復合多層膜的作用，本發(fā)明主要采用以下方法進行檢測:
(I)甲苯胺藍法測定層層自組裝過程中，負載在生物材料上的肝素量不斷增加，從而證明組裝的成功發(fā)生。肝素可與甲苯胺藍分子相結(jié)合，而發(fā)生顏色變化，甲苯胺藍由藍色轉(zhuǎn)變成紫色，通過測定與甲苯胺藍結(jié)合后復合多層膜的吸光值，以及肝素濃度和吸光值對應關(guān)系的標準曲線，即可得到復合多層膜中肝素的含量；分析不同組裝層數(shù)，肝素負載量的變化情況。
[0029](2)通過測定RD-aFGF的熒光強度的變化，判斷生長因子負載情況。用羅丹明標記的生長因子(RD-aFGF)替代未標記的aFGF進行層層自組裝，通過測定復合多層膜的熒光強度隨組裝層數(shù)的增加，從而判斷生長因子的成功組裝和負載。
[0030](3)通過測定FITC-casein的熒光強度的變化，從而監(jiān)測酪蛋白的成功負載和復合多層膜中酪蛋白(casein)的含量，以及組裝發(fā)生的過程。用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的酪蛋白(FITC-casein)替代未標記的酪蛋白進行層層自組裝，通過測定復合多層膜的熒光強度，從而監(jiān)控自組裝的發(fā)生，檢測組裝過程中，酪蛋白含量的變化。
[0031](4)掃描電子顯微鏡觀察膜材料體外礦化后的表面形貌。體外礦化實驗:把負載了酪蛋白/生長因子的復合多層膜浸泡在模擬體液中，并置于37°C、0.5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液，7天和14天后，取樣清洗干燥后，掃描電鏡下觀察復合膜的體外礦化特征。
[0032](5)熒光素二乙酸酯(FDA)染色檢測骨髓間充質(zhì)干細胞在生長因子復合多層膜上的粘附以及生長情況；四唑鹽(MTT)比色法測定骨髓間充質(zhì)干細胞在生長因子復合多層膜上的活性以及增殖情況。把P4代的人骨髓間充質(zhì)干細胞在接種于滅菌后的膜材料上，經(jīng)一定時間的培養(yǎng)后，進行活細胞染色和細胞活性檢測。
[0033](6)細胞骨架染色檢測人源成骨細胞在生長因子復合多層膜上的粘附以及鋪展情況。在滅菌后的復合多層膜上接種人源成骨細胞，培養(yǎng)5天、7天分別取樣，進行細胞骨架染色和熒光定量PCR檢測，熒光定量PCR測定人源成骨細胞在生長因子復合多層膜上分化情況。
[0034]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明利用層層自組裝技術(shù)把酪蛋白和生長因子負載到生物材料表面，創(chuàng)造性地將四種具有優(yōu)異物化性質(zhì)的生物大分子交替沉積到同一基底材料上，構(gòu)建了促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜，通過肝素和生長因子特異性的結(jié)合，從而很好保護生長因子的生物活性，并且可以通過改變肝素的濃度，控制復合多層膜中肝素的含量，從而調(diào)控生長因子的負載量，而且生長因子可從聚電解質(zhì)復合多層膜中有效、持續(xù)地釋放。
[0035]另外，引入了天然具有生物礦化能力的生物大分子酪蛋白，對鈣離子有很強的吸附力，從而鈣離子在材料表面沉淀、凝聚成團，形成類似骨組織的磷灰石，為構(gòu)建促成骨化復合膜提供了依據(jù)。負載到材料表面的酪蛋白具有良好的促生物礦化能力，從而得到具有促成骨化的生物活性膜。生物活性膜很好地提高骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附、生長、增殖能力；并且體外礦化實驗表明，鈣離子能有效地在該復合膜表面沉淀、聚集，并形成類似骨組織的磷灰石，為促干細胞成骨化提供了可能性，可用于組織工程中骨缺損修復。
[0036]同時，本發(fā)明制備促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜的方法操作簡單，可重復性好，能很好保護生長因子的生物活性，且具有促成骨化的潛能，可廣泛應用于軟骨、骨、血管、神經(jīng)和心臟瓣膜等組織工程。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明制備促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜過程中肝素含量的變化情況。
[0038]圖2為本發(fā)明制備促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜過程中的生長因子含量的變化情況。
[0039]圖3為本發(fā)明制備促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜過程中酪蛋白含量的變化情況。
[0040]圖4為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜在體外礦化的能力表征。
[0041]圖5為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜上骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附和生長情況。
[0042]圖6為本發(fā)明促成骨化的生長因子可控緩釋體系復合多層膜上骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力。
[0043]圖7為本發(fā)明