[0075]所述FDA溶液的配方為:配置5mg/mL的母液，即稱5mg FDA加入ImL丙酮溶解，搖勻，避光4°C保存；使用時(shí)用PBS將FDA母液稀釋1000倍，得到5 μ g/mL FDA溶液。
[0076]3,MTT細(xì)胞活性檢測:干細(xì)胞在復(fù)合膜培養(yǎng)I天、3天、7天及14天后取樣檢測，吸掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，隨后每孔加入MTT/PBS溶液150 μ L，37°C避光孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，用PBS清洗兩遍后每孔加入150 μ L 二甲基亞砜(DMS0)，反復(fù)吹打使結(jié)晶物溶解。將此溶液分別對應(yīng)加入酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長為570nm處測試其光吸收值。
[0077]所述MTT/PBS溶液的配方:稱取25mg MTT (3_ (4，5_ 二甲基噻唑)-2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍(lán)，sigma公司)，放入小燒杯中，加入5mL PBS使之溶解，配成的溶液濃度為5mg/mL。
[0078]結(jié)果如附圖6所示，本發(fā)明制備的酪蛋白-生長因子復(fù)合多層膜上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有很好的增殖能力，細(xì)胞活性改善效果明顯。
[0079]實(shí)施例8人源成骨細(xì)胞在酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜上的粘附和生長
1、把人源成骨細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研宄院細(xì)胞資源中心)接種在滅菌后的生長因子復(fù)合多層膜上，用全培養(yǎng)基(DMEM/F12，0.3 mg/mL G418，10% FBS)于37°C、5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。第五天取樣，小心吸掉培養(yǎng)，用PBS清洗幾遍，用4%多聚甲醇在室溫環(huán)境下固定30min。
[0080]2、用IXwash buffer洗兩次，用l%triton x-100浸泡5min，以穿透細(xì)胞膜，加上1% BSA室溫封閉lh。用vinculin—抗(vinculin為粘著斑蛋白)室溫孵育Ih后，用I Xwashbuffer洗三遍。
[0081]3、用vinculin 二抗和鬼筆環(huán)肽的混合液，室溫孵育45min，用IXwash buffer洗三遍。
[0082]4、加入4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )，室溫孵育3min，IXwash buffer洗三遍。
[0083]5、取樣拍照，結(jié)果如附圖7所示，結(jié)果表明，結(jié)果顯示，復(fù)合多層膜上的成骨細(xì)胞連接成片，緊緊貼在材料的表面，形成單層的細(xì)胞面，細(xì)胞與細(xì)胞聯(lián)系密切，單個(gè)細(xì)胞鋪展面較大，細(xì)胞中央的突起的細(xì)胞核清晰可見。這說明本發(fā)明的酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附及鋪展。
[0084]實(shí)施例9應(yīng)用人源成骨細(xì)胞評價(jià)生長因子復(fù)合多層膜的促成骨分化能力
1、將成骨細(xì)胞接種在實(shí)施例1制備的復(fù)合多層膜上，放置在39.5°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，并用組織培養(yǎng)專用的聚苯乙烯(TCPS)和未改性PU膜上的細(xì)胞作為陰性對照，于7天提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄。
[0085]2、取用上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品進(jìn)行相對定量熒光PCR檢測，分析TCPS、未改性I3U膜和本發(fā)明制備復(fù)合多層膜上成骨細(xì)胞的成骨分化特異基因OPN、0C, ALP和COLI的表達(dá)情況，從而評價(jià)生長因子復(fù)合多層膜促成骨分化的能力。
[0086]3、結(jié)果:各處理組的成骨細(xì)胞的成骨分化特異基因0PN、0C、ALP和COLI的表達(dá)情況分別如附圖8?11所示。
[0087]結(jié)果顯示，本發(fā)明的酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜上成骨細(xì)胞的ALP、0PN、C0LI以及OC基因表達(dá)非常高，這說明成骨組織的胞外基質(zhì)已經(jīng)逐步分泌形成、成熟以及礦化。同時(shí)，各基因的表達(dá)高于TPCS上的細(xì)胞對應(yīng)基因的表達(dá)，且遠(yuǎn)高于未改性I3U膜上的細(xì)胞，這說明本發(fā)明的酪蛋白/生長因子復(fù)合多層膜具有良好的促成骨分化能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種促成骨化的生物材料表面改性方法，其特征在于，利用層層自組裝技術(shù)及生長因子緩控釋技術(shù)，以酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長因子作為正電大分子層，在生物材料表面構(gòu)建層層靜電自組裝的生物多層膜； 所述生物材料為醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯或明膠。
2.一種促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜，其特征在于，是利用層層自組裝技術(shù)及生長因子緩控釋技術(shù)，以酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長因子作為正電大分子層，在生物材料表面構(gòu)建層層靜電自組裝的生物多層膜得到；制備得到的復(fù)合多層膜為酪蛋白/肝素層和生長因子/膠原層的循環(huán)； 所述生物材料為醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯或明膠。
3.權(quán)利要求2所述促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜的制備方法，其特征在于，包括步驟如下: 51.將基片表面進(jìn)行氨基化處理； 52.將表面氨基化的基片置于肝素/酪蛋白混合溶液中，浸泡5?30min;然后移至pH值為5?12的HEPES溶液中漂洗3?5次；所述肝素/酪蛋白混合溶液中肝素的濃度為0.0l?10mg/mL，酪蛋白的濃度為0.1?10mg/mL ； 53.將S2得到的完成組裝聚陰電解質(zhì)的基片置于生長因子/膠原混合溶液中，浸泡5?30min，然后移至pH值為5?12的HEPES溶液中漂洗3?5次；所述生長因子/膠原混合溶液中生長因子的濃度為0.1?10mg/mL，膠原的濃度為0.1?10mg/mL ； 54.步驟S3完成后，多次循環(huán)重復(fù)步驟S2和S3，即得到促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟SI所述氨基化處理是指將基片浸泡在體積比1:9的己二胺異丙醇溶液中，37°C胺解lh，再用純水清洗干凈。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟SI所述基片是醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯或明膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟S2所述肝素/酪蛋白溶液中肝素的濃度為0.04、0.4或4mg/mL ;酪蛋白的濃度為0.2 mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟S3所述生長因子/膠原溶液中生長因子的濃度為0.2 mg/mL;膠原的濃度為I mg/mL ;所述生長因子/膠原溶液調(diào)節(jié)其pH至4.8。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟S3所述生長因子是細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞生長因子或細(xì)胞分化因子。
9.權(quán)利要求3所述促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜在作為組織工程醫(yī)用材料方面的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，是作為組織工程中骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促成骨化的生物材料表面改性方法和一種促成骨化的生長因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜。具體是利用層層自組裝技術(shù)及生長因子緩控釋技術(shù)，以酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長因子作為正電大分子層，在生物材料表面構(gòu)建層層靜電自組裝的生物多層膜，得到的多層膜為酪蛋白/肝素層和生長因子/膠原層的循環(huán)。本發(fā)明創(chuàng)造性地將四種具有優(yōu)異物化性質(zhì)的生物大分子交替沉積到同一基底材料上，不僅很好的保護(hù)了生長因子的生物活性，而且可以調(diào)控生長因子的負(fù)載量和緩釋；并且具有良好的促生物礦化及成骨化能力，同時(shí)能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、生長和增殖能力，可廣泛應(yīng)用于軟骨、骨、血管、神經(jīng)和心臟瓣膜等組織修復(fù)工程。
【IPC分類】A61L27-54, A61L27-18, A61L27-40, A61L27-22
【公開號(hào)】CN104758981
【申請?zhí)枴緾N201510103992
【發(fā)明人】龔逸鴻, 莊良婷, 李燕, 曹智楠, 李裕民, 蔣慶
【申請人】中山大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月10日