tt檢驗(yàn)得到用于分析每視野的血管數(shù)和血管 長度的定量結(jié)果數(shù)據(jù)。studentt檢驗(yàn)重復(fù)五次，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差示出（統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義：*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***ρ〈0· 001)。
[0090] 結(jié)果示于圖3中，確認(rèn)混有⑶-ECM粉末的實(shí)驗(yàn)組抑制了血管生成。此外，如圖4 所示，當(dāng)對每視野的血管的數(shù)量和長度進(jìn)行定量時(shí)，確認(rèn)了與混有羊膜粉末的實(shí)驗(yàn)組相比， 混有⑶-ECM粉末的實(shí)驗(yàn)組顯示出更少數(shù)量的血管（參見圖4Α)，并且與混有羊膜粉末的實(shí) 驗(yàn)組相比，混有⑶-ECM粉末的實(shí)驗(yàn)組顯示出更短的血管（參見圖4Β)。
[0091] 因此，確認(rèn)了本發(fā)明的⑶-ECM粉末能夠強(qiáng)烈地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，而 傳統(tǒng)的羊膜粉末不能顯著地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。
[0092] 根據(jù)實(shí)施例3-5的體外實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)本發(fā)明用于形成CD-ECM的材料能夠抑制血管內(nèi) 皮細(xì)胞的附著和增殖，并且還能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管化和血管浸潤，由此最終抑制血 管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。
[0093] 實(shí)施例6 :基質(zhì)膠的血管浸潤的肉眼觀察
[0094] 使用于形成實(shí)施例1的CD-ECM的材料接受評價(jià)，以確定該材料是否可以抑制血管 浸潤，所述評價(jià)采用基質(zhì)膠浸潤分析（BDBioscience，Cat. 354234和356234)以裸露眼球進(jìn) 行測試。
[0095] 首先，將實(shí)施例1的CD-ECM粉末或羊膜粉末與基質(zhì)膠混合，然后，將混合物注射入 裸鼠的背部皮下組織。作為對照組，僅將基質(zhì)膠注射入裸鼠的背部皮下組織。此處，將"基 質(zhì)膠"、"基質(zhì)膠+CD-ECM粉末"和"基質(zhì)膠+羊膜粉末"各自沿脊椎的兩側(cè)注射入10只裸鼠 中，以便移植物處于縱向方向。在移植一周后，將各脊椎樣品進(jìn)行收集并進(jìn)行肉眼觀察，從 而確定樣品的形狀、大小及樣品中的血管浸潤的存在。
[0096] 圖5中示出了通過C⑶照相機(jī)拍攝的三維圖像的結(jié)果，確認(rèn)了如下：僅用基質(zhì)膠進(jìn) 行處理的對照組與用基質(zhì)膠和羊膜粉末處理的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出增高的血管浸潤，而用基質(zhì)膠 和⑶-ECM粉末處理的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制血管浸潤。
[0097] 因此，確認(rèn)了與傳統(tǒng)的羊膜材料相比，本發(fā)明的用于形成CD-ECM的材料對血管浸 潤具有更強(qiáng)的抑制作用。
[0098] 實(shí)施例7 :基質(zhì)膠的血管浸潤的免疫組織化學(xué)觀察與分析
[0099] 使用于形成實(shí)施例1的CD-ECM的材料接受評價(jià)，從而確定該材料是否可以抑制血 管化及血管浸潤，并且所述評價(jià)使用基質(zhì)膠浸潤分析在免疫組織化學(xué)上進(jìn)行觀察和分析。 [0100] 首先，將實(shí)施例1的CD-ECM粉末或羊膜粉末與基質(zhì)膠混合，然后，將混合物注射入 裸鼠的背部皮下組織。作為對照組，僅將基質(zhì)膠注射入裸鼠的背部皮下組織。此處，將"基 質(zhì)膠"、"基質(zhì)膠+CD-ECM粉末"和"基質(zhì)膠+羊膜粉末"各自沿脊椎的兩側(cè)注射入10只裸鼠 中，以便移植物處于縱向方向。在移植一周后，收集各脊椎樣品。
[0101] 將收集的樣品用4%福爾馬林固定24小時(shí)，然后脫水，在進(jìn)行石蠟包埋后制作 4 μ m厚的切片。另外，為觀察血管的分布和形態(tài)，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法使用蘇木精/ 曙紅（H&E)進(jìn)行染色。
[0102] 此外，為確定α平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA)標(biāo)記物與血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物（⑶31) 的表達(dá)（表明各樣品中存在血管生成），使收集的樣品各自接受根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn) 行的免疫化學(xué)染色
[0103] 此外，根據(jù)各樣品的化學(xué)染色（例如，Η&Ε染色）和免疫化學(xué)染色（針對a -SM和 ⑶31)，通過使用顯微鏡（Nikon E600,日本）檢測確定血管生成的存在（參見圖6)。根據(jù)染 色的顯微照片，通過使用 Image J程序（Wayne Rasband，National Institutes of Health， USA)對每單位面積的血管數(shù)和血管的直徑進(jìn)行測定和定量（參見圖7)。
[0104] 結(jié)果示于圖6和圖7中。圖6示出在進(jìn)行化學(xué)染色（例如，H&E染色）和免疫化學(xué) 染色（針對a-SMA和⑶31)后的各樣品組織切片在400X放大倍數(shù)（Nikon E600,日本） 下的顯微照片。通過實(shí)施化學(xué)染色（例如，H&E染色）識(shí)別血管生成的存在，作為結(jié)果確認(rèn) 了：僅用基質(zhì)膠處理的對照組與用基質(zhì)膠和羊膜粉末處理的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出血管浸潤，而用 基質(zhì)膠和CD-ECM粉末處理的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制血管化及血管浸潤。
[0105] 此外，作為使用針對a -SMA和⑶31的免疫化學(xué)染色識(shí)別各實(shí)驗(yàn)組中的血管生成 的存在的結(jié)果，確認(rèn)了僅用基質(zhì)膠處理的對照組與用基質(zhì)膠和羊膜粉末處理的實(shí)驗(yàn)組顯示 出表明a -SM及⑶31的表達(dá)的免疫化學(xué)染色圖像，而用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉末的實(shí)驗(yàn)組顯 示出清晰的未染色的圖像（表明a -SM和⑶31未表達(dá)）。此處，在用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉 末處理的實(shí)驗(yàn)組中未識(shí)別出血管結(jié)構(gòu)。
[0106] 另外，如圖7中所示，當(dāng)根據(jù)染色的組織切片對每單位面積的血管數(shù)（即，毛細(xì)結(jié) 構(gòu)/mm 2)和血管直徑（即，毛細(xì)結(jié)構(gòu)直徑，μ m)進(jìn)行測定和定量時(shí)，用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉末 處理的實(shí)驗(yàn)組顯示出無血管結(jié)構(gòu)。同時(shí)，與用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉末處理的實(shí)驗(yàn)組以及僅用 基質(zhì)膠處理的對照組相比，用基質(zhì)膠和羊膜粉末處理的實(shí)驗(yàn)組顯示出更長的血管和更多數(shù) 量的血管。
[0107] 因此確認(rèn)了，與傳統(tǒng)的羊膜材料相比，本發(fā)明的用于形成CD-ECM的材料具有更強(qiáng) 的血管化及血管浸潤的抑制作用。
[0108] 實(shí)施例8 :血管生成因子及抗血管生成因子的免疫組織化學(xué)觀察與分析
[0109] 按照與本發(fā)明實(shí)施例7相同或相似的方法來收集各樣品，然后，實(shí)施免疫組織化 學(xué)分析和評價(jià)以確認(rèn)各實(shí)驗(yàn)組中的血管生成因子（angiogenic factor)和抗血管生成因子 (anti-angiogenic factor)的表達(dá)。
[0110] 將按照與本發(fā)明實(shí)施例7相同或相似的方法收集的各樣品，根據(jù)本領(lǐng)域公知的方 法進(jìn)行免疫化學(xué)染色以識(shí)別血管生成因子（例如，VEGF、HIF_la等）和血管生成抑制因子 (例如，內(nèi)皮抑制素）的表達(dá)。然后，通過顯微鏡（Nikon E600,日本）識(shí)別經(jīng)由在各樣品上 實(shí)施的免疫化學(xué)染色（針對VEGF、HIF-I α和內(nèi)皮抑制素）觀察到的血管生成的存在（參 見圖8)。
[0111] 圖8顯示了進(jìn)行免疫化學(xué)染色（針對VEGF、HIF-I α和內(nèi)皮抑制素）后的各樣品 組織切片在400Χ放大倍數(shù)（Nikon Ε600,日本）下的顯微照片。通過針對血管生成因子 (例如VEGF和HIF-I α )進(jìn)行免疫化學(xué)染色識(shí)別各實(shí)驗(yàn)組中血管生成的存在，作為結(jié)果確 認(rèn)了，僅用基質(zhì)膠處理的對照組與用基質(zhì)膠和羊膜粉末處理的實(shí)驗(yàn)組顯示出經(jīng)免疫染色的 VEGF和HIF-Ia (表明了它們的表達(dá)）。然而，用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉末處理的實(shí)驗(yàn)組顯示 出未染色的VEGF及HIF-I a (表明它們未表達(dá)）。此處，在用基質(zhì)膠和⑶-ECM粉末處理的 實(shí)驗(yàn)組中未識(shí)別出血管結(jié)構(gòu)。
[0112] 同時(shí)，通過針對抗血管生成因子（例如，內(nèi)皮抑制素）進(jìn)行免疫化學(xué)染色來識(shí)別各 實(shí)驗(yàn)組中的血管生成的存在，作為結(jié)果確認(rèn)了，內(nèi)皮抑制素在血管化及血管浸潤的區(qū)域表 達(dá)，因此，識(shí)別出了針對內(nèi)皮抑制素的陽性染色。
[0113] 因此確認(rèn)了，與傳統(tǒng)的羊膜材料相比，本發(fā)明的用于形成CD-ECM的材料具有更強(qiáng) 的抑制血管化及血管浸潤的作用，因此，在形成血管的組織中觀察到抗血管生成因子的表 達(dá)。
[0114] 因此，根據(jù)實(shí)施例3-8的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了，本發(fā)明的用于形成CD-ECM的材料能夠抑制 血管內(nèi)皮細(xì)胞的附著和增殖，并且除抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)外，還能有效地抑制血管內(nèi) 皮細(xì)胞的血管化和血管浸潤，由此最終抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。因此，可將本發(fā)明的 用于形成CD-ECM的材料用來形成治療血管生成相關(guān)疾病的組合物以及進(jìn)行角膜或結(jié)膜移 植。
[0115] 實(shí)施例9 :角膜血管生成抑制效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0116] 為確認(rèn)本發(fā)明的用于形成CD-ECM的材料是否能夠用來形成治療血管生成相關(guān)疾 病的組合物以及進(jìn)行角膜或結(jié)膜移植，實(shí)施了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。也就是說，將八周齡的新西蘭白兔 用于實(shí)驗(yàn)性地引起雙眼球中的角膜血管生成。然后，將一只眼球（左眼球：實(shí)驗(yàn)組）移植 ⑶-ECM，同時(shí)另一只眼球（右眼球：對照組）不進(jìn)行移植，由此比較本發(fā)明的⑶-ECM的角膜 血管生成的抑制效果。實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。
[0117] A.弓丨起角膜血管生成發(fā)生的模型的制備
[0118] 為引起角膜血管生成的發(fā)生，使新西蘭白兔的角膜緣接受使用7-Omersilk在中 層基質(zhì)（mid-stromal level)處構(gòu)建的四點(diǎn)縫合。
[0119] B.制備CD-ECM和羊膜
[0120] 通過本發(fā)明實(shí)施例1的⑶-ECM制備⑶-ECM，采用在剖腹產(chǎn)術(shù)后立即從產(chǎn)婦的胎 盤分離的羊膜來制備羊膜，其中，所述產(chǎn)婦在乙肝、丙肝、HIV及梅毒的血清檢查中呈陰性。 將由此分離的羊膜用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)漂洗后，在硝化纖維素紙上展成薄層從而以相 對的方向獲取羊膜上皮，加入培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)與100%的甘油按照1:1的比例混合，然后放入冰箱或者置于-70°C的溫度下。
[0121] C.