MiRNA-22在制備MMP14和Snail表達(dá)抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及miRNA-22在制藥上的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居各類腫瘤之首，而且預(yù)后較差。每年 約有17萬人死于胃癌，幾乎接近全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4。
[0003] 微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為20~25nt的內(nèi)源性非編碼RNA分 子，普遍存在于真核生物中。它不編碼蛋白質(zhì)或多肽，而是與靶基因的信使RNA(mRNA)的 3' -非翻譯區(qū)（3' -UTR)互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA的降解或者抑制靶mRNA的翻譯，從而實(shí)現(xiàn) 轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。研究表明，大約50%的miRNAs在基因組上定位于腫瘤相關(guān)區(qū)域或脆 性位點(diǎn)（fragile site)。MiRNAs作為一類新的癌基因或抑癌基因，其表達(dá)失衡與多種腫瘤 發(fā)生密切相關(guān)。MiRNA-22位于染色體17pl3 (1，563, 947bp-l，564, 031bp)，被證實(shí)在諸如結(jié) 腸癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、食道癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移 方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，是一類新的抑癌基因。
[0004] 腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要也是最本質(zhì)的生物學(xué)特征，是引起惡性腫瘤 患者預(yù)后不良和死亡的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP14是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中的重要 酶類，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)包括基底膜均有降解作用，從而破壞了機(jī)體防御腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的能 力，增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性。此外，MMP14還能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌proMMP2和proMMP9。Snail在 細(xì)胞水平調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附，是上皮型鈣粘蛋白（E-cadherin)重要的轉(zhuǎn)錄抑制子，其過度 表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞迀移以及誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而引起腫瘤的發(fā)展、侵襲和 轉(zhuǎn)移。近來研究發(fā)現(xiàn)，MMP14和Snail基因在胃癌組織中的表達(dá)上調(diào)，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展 和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于對(duì)MMP14和Snail基因與miRNA-22之間的關(guān)系進(jìn)行 深入研究，為尋找新型腫瘤治療藥物提供新的思路和方法。
[0006] 經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 1. MiRNA-22、miRNA-22mimics 或 miRNA-22agomir 在制備 MMP14 和 Snail 表達(dá)抑 制劑中的應(yīng)用。
[0008] MiRNA mimics (又稱miRNA模擬物）是針對(duì)miRNA的成熟體設(shè)計(jì)并合成的小片段 雙鏈miRNA，作用與miRNA的成熟體相同，可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的含量，但結(jié)構(gòu)略有不 同。MiRNA agomir是在化學(xué)合成的mimics的基礎(chǔ)上，經(jīng)過特殊化學(xué)修飾升級(jí)的產(chǎn)品，結(jié)構(gòu) 與使用方式與mimics有不同，但作用是一樣的，都是使得內(nèi)源性的miRNA上調(diào)。與miRNA mimic相比，miRNA agomir在動(dòng)物體內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性和miRNA活性，更易通過細(xì)胞膜、 組織間隙而富集于靶細(xì)胞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用全身或局部注射等方法進(jìn)行給藥，作用效 果持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。
[0009] 2. MiRNA-22、miRNA-22mimics 或 miRNA-22agomir 在制備 MMP14 和 Snail 過度表 達(dá)所致腫瘤的治療藥物中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步，所述腫瘤為胃癌。
[0011] 進(jìn)一步，所述治療藥物是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物。
[0012] 進(jìn)一步，所述治療藥物是抑制胃癌細(xì)胞增殖、腹腔播散和肺轉(zhuǎn)移的藥物。
[0013] 3. MiRNA-22、miRNA-22mimics 或 miRNA-22agomir 在制備抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲 和轉(zhuǎn)移的試劑中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步，所述胃癌細(xì)胞為SGC-7901細(xì)胞或HGC-27細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明對(duì)MMP14和Snail基因與miRNA-22之間的關(guān)系 進(jìn)行了深入研究，以胃癌為腫瘤模型。研究結(jié)果表明，MMP14和Snail基因?yàn)閙iRNA-22的 靶基因，miRNA-22能夠通過抑制MMP14和Snail的表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和 轉(zhuǎn)移，尤其對(duì)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有良好的抑制作用。因此，miRNA-22、miRNA-22mimics或 miRNA-22agomir不僅可以用于制備MMP14和Snai 1表達(dá)抑制劑，以及抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵 襲和轉(zhuǎn)移的試劑，更重要的是可以用于制備MMP14和Snail過度表達(dá)所致腫瘤的治療藥物， 從而為開發(fā)新型腫瘤治療藥物提供了新的思路和方法。
【附圖說明】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0017] 圖1為熒光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0018] 圖2為細(xì)胞轉(zhuǎn)染后免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：1泳道為陰性對(duì)照miR-NC組，2泳道為 miR_22mimics 組。
[0019] 圖3為MiR-22和MMP14pcDNA或Snail pcDNA共轉(zhuǎn)染免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：1泳道 為陰性對(duì)照 miR-NC 組，2 泳道為 miR-22mimics 組，3 泳道為 miR-22mimics+pcDNA3. 1-MMP14 組或 miR-22mimics+pcDNA3. 1-Snail 組。
[0020] 圖4為miR-22通過抑制MMP14和Snail的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲（左）和轉(zhuǎn)移 (右）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0021] 圖5為建立裸鼠胃癌模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0022] 圖6為體內(nèi)腹腔播散實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0023] 圖7為體內(nèi)腹腔播散成瘤后免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：1泳道為陰性對(duì)照組，2泳道為 Agomir-22 組。
[0024] 圖8為體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：A為肺組織HE染色，B為Agomir-22組和陰性對(duì) 照組中發(fā)生和沒有發(fā)生腫瘤肺部轉(zhuǎn)移的裸鼠數(shù)量。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0026] 腫瘤侵襲（ECM550)試劑盒和細(xì)胞迀移分析（ECM220)試劑盒購(gòu)自Millipore公 司；野生型 MMP14-3' UTR，Snail-3' UTR 和突變型 MMP14-3' UTR，Snail-3' UTR 的正、反義 序列由上海生工生物工程有限公司合成；MMP14和Snail -抗購(gòu)自Abeam公司；GAPDH -抗 購(gòu)自 Cell signaling 公司；miR_22mimics 和陰性對(duì)照 miR-NC、Agomir-22 和 Agomir 陰性 對(duì)照購(gòu)自RIBOBIO公司；CCK8試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK和雙熒光素酶 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒pcDNA3. 1-MMP14和pcDNA3. Ι-Snail購(gòu)自百恩 維生物科技公司；SGC-7901細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。
[0027] 實(shí)施例1熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP14和Snail基因?yàn)閙iR-22的靶基因
[0028] 合成野生型（wt)MMP14-3, UTR、Snail-3' UTR 和突變型（mut)MMP14-3, UTR， Snail-3' UTR寡核苷酸序列。具體方法如下：
[0029] 野生型 MMP14-3' UTR 正義序列：CCTTGCCCAAACTCAGGCAGCTG(SEQ ID No. 1)
[0030] 野生型 MMP14-3' UTR 反義序列：CAGCTGCCTGAGTTTGGGCAAGG(SEQ ID No. 2)
[0031] 野生型 Snail-3' UTR 正義序列：GATGCCCCGAGCCCAGGCAGCTA(SEQ ID No. 3)
[0032] 野生型 Snail-3' UTR 反義序列：TAGCTGCCTGGGCTCGGGGCATC(SEQ ID No. 4)
[0033] 突變型 MMP14-3' UTR 正義序列：CCTTGCCCAAACTCAGGTTCATG(SEQ ID No. 5)
[0034] 突變型 MMP14-3' UTR 反義序列：CATGAACCTGAGITTGGGCAAGG(SEQ ID No. 6)
[0035] 突變型 Snail-3' UTR 正義序列：GATGCCCCGAGCCCAGGTCAGTA(SEQ ID No. 7)
[0036] 突變型 Snail-3' UTR 反義序列：TACTGACCTGGGCTCGGGGCATC(SEQ ID No. 8)
[0037] 將上述成對(duì)的正義序列和反義序列兩條核苷酸片段按1 μ g/μ L的濃度各取 2 μ L，與 1 X 退火緩沖液（10mM、ρΗ8· 0 的 Tris+50mM NaCl+lmM EDTA) 46 μ L 混合，于 9(TC 放置3min再30°C放置lh進(jìn)行退火，分別制得野生型MMP14-3' UTR、野生型Snail-3' UTR、 突變型MMP14-3' UTR和突變型Snail-3' UTR寡核苷酸序列。
[0038] 將microRNA熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-REPORT用Hind III和Spe I雙酶切后，與上 述野生型 MMP14-3' UTR、野生型 Snail-3' UTR、突變型 MMP14-3' UTR 或突變型 Snail-3' UTR 寡核苷酸序列進(jìn)行連接，分別制得野生型MMP14-3'