用于口服遞送的活細胞制劑的制作方法
【專利說明】用于口服遞送的活細胞制劑
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及用于活細胞的口服遞送的制劑，所述活細胞例如細菌細胞。
[0002]目前，口服活細菌遞送被用于兩種主要類型的治療應(yīng)用中。首先，從腸分離物鑒定 出的未修飾的腸細菌菌株在抗生素治療后的腸的重新建群[1]、炎性腸病患者的癥狀緩解
[2] W及生物學(xué)治療遞送的基因工程化形式(例如IL-10[3])中具有治療應(yīng)用。其次，活細菌 是有前景的候選疫苗。目前，測試減毒活細菌的不同菌株在對抗諸如霍亂、腸毒性大腸桿菌 和傷寒的疾病中的保護作用的很多人群臨床試驗正在進行中（[4])?；罴毦呙绯^常規(guī) 疫苗的優(yōu)勢在于它們是口服給藥的，運避免了注射和用針?；蚬こ袒幕罴毦呙邕€可 W攜帶來自病原體或腫瘤的異源DNA或抗原來刺激或引發(fā)對抗病原體或腫瘤細胞的免疫應(yīng) 答。
[0003] 由于穩(wěn)定性的原因，通常對用于活遞送的細菌進行干燥。用于活細菌遞送的干燥 制劑的備選方案是"濕"的形式，例如諸如酸乳的食品?；罴毦谝后w形式時具有明顯的穩(wěn) 定性問題，即使是冷藏。已經(jīng)提議了用于細菌口服遞送的多種微封裝系統(tǒng)[5]，但是都遭受 細菌在膽存時降解運一相同問題，并且需要昂貴的冷藏設(shè)備來減少降解。
[0004] 制備干燥的細菌的各種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。最常見的是使用常規(guī)冷凍干燥。此 夕h最近還關(guān)注于使用諸如海藻糖和薦糖的二糖，二糖能穩(wěn)定生物分子并使干燥的細菌在 室溫下更穩(wěn)定[6]、[7]。二糖穩(wěn)定化的干燥的細菌可W例如常規(guī)膽存在室溫下。
[0005] 目前，干燥的活細菌的口服給藥是W下兩種常見形式:冷凍干燥的細菌的腸膠囊 和需要在碳酸氨鹽緩沖液中重懸的冷凍干燥的細菌的藥囊。通常，給予非常高劑量的細菌， 并且需要多劑量才僅產(chǎn)生適當(dāng)?shù)男Ч?。有趣的是，臨床數(shù)據(jù)表明腸膠囊制劑的功效顯著低 于碳酸氨鹽緩沖液系統(tǒng)[引[15]，但是對腸膠囊為何功效相對較低還知之甚少。
[0006] 對于碳酸氨鹽緩沖液系統(tǒng)的作用機制的了解還很少。吞服的碳酸氨鹽緩沖液的量 不太可能吸收分泌至胃中的酸，所W似乎是W運種方式給藥的細菌會遇到一定酸度。盡管 存在運些可能的局限，但是在諸如霍亂[9]和腸毒性大腸桿菌[10]的疾病的疫苗菌株的現(xiàn) 行的人群臨床試驗中，與碳酸氨鹽緩沖液或相似酸中和緩沖液的共同給藥目前是遞送的標(biāo) 準(zhǔn)模式。
[0007] 胃具有分泌鹽酸并將內(nèi)容物降至pH IW下的能力。很少的細菌能在該pH下存活
[11]，并且已證實干燥的活細菌比來自新鮮培養(yǎng)物的細菌更敏感[12]。"腸溶"衣可W用于 避免活細菌制劑在胃酸中死亡。腸溶衣是在酸性條件下不會溶解的聚合物層，但是在胃排 空后它會在腸中溶解，從而將干燥的細菌釋放到小腸上段。如上文所述，已有的活細菌疫苗 的腸膠囊的功效相對較低，盡管它們具有保護細菌對抗胃酸的能力[引。
[000引腸含有酶和其它殺微生物成分的復(fù)雜混合物。膽汁是從膽囊分泌到十二指腸中。 膽汁通常包含至少50%的膽汁酸，膽汁酸作為清潔劑來溶解和消化脂肪食物成分。膽汁酸 在殺細菌方面也很強。諸如沙口氏菌（Salmonella SPP.)的通常存在于腸內(nèi)部位的細菌菌 株對于諸如膽汁鹽的清潔劑具有演變的抗性機制，運允許它們在腸中存活和生長。
[0009]細菌在干燥或冷凍后通常喪失了它們對于膽汁酸的抗性。從腸溶制劑中釋放入腸 的干燥的細菌對于膽汁酸是敏感的，并且不能在腸環(huán)境中存活[12]。
[0010] 本發(fā)明設(shè)及下述發(fā)現(xiàn):在干燥的活細胞的制劑中滲入少量膽汁酸結(jié)合劑能顯著增 加細胞在腸道中的存活。因此，運些制劑可W用于將諸如細菌細胞的活細胞口服遞送至腸。
[0011] 本發(fā)明的一方面提供了用于對個體口服給藥的固體制劑，其包含干燥的活細胞和 膽汁酸結(jié)合劑。
[0012] 膽汁結(jié)合劑允許水性液體滲入制劑，但是吸收膽汁酸并阻止它們滲入制劑。運能 保護干燥的活細胞免受膽汁酸毒性的損害，直至它們被滲入的水性液體再水合并恢復(fù)其膽 汁耐受性。運可W例如增加將細胞遞送至腸的功效。
[0013] 干燥的活細胞可W是微生物細胞。本文所述的制劑中可W使用任何微生物細胞， 并且細胞的類型取決于制劑的具體使用目的。
[0014] 在一些實施方案中，可W使用細菌細胞，例如來自腸細菌的細胞。腸細菌是本領(lǐng)域 公知的，并且包括病原體和非致病性種類，例如腸桿菌科化111日1'〇6日(31日1'1日[日日日），所述腸桿 菌科例如埃希氏菌屬（Escherichia)、沙口氏菌屬（Salmonella)、克雷伯氏菌屬 化Iebsiella)、腸桿菌屬化nterobacter)、沙雷氏菌屬（Serratia)、變形菌（Proteus spp) W及雙歧桿菌屬（Bif idobacterium)、擬桿菌屬（Bacteroides)、梭菌屬（Clostridium)、假 單胞菌屬（Pseudomonas )、瘤胃球菌屬（Ruminococcus )、乳酸桿菌屬(Xactobaci 1 Ius )、乳球 菌屬（Lactococcus)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)和鏈球菌（Str巧tococ州S spp.)。
[0015] 使用本文所述的制劑將腸細菌細胞遞送至腸可W用于，例如抗生素治療后的患者 的腸內(nèi)菌群的恢復(fù)W及炎性腸病患者的癥狀緩解。
[0016] 在其它實施方案中，所述干燥的活的微生物細胞可W是真核細胞，例如酵母或真 菌細胞，例如酵母（Saccharomyces SPP .)、曲霉（AspergiIlus S郵.）或念珠菌（Candida SPP.)O
[0017] 在一些實施方案中，可W使用具有特定的酶學(xué)性質(zhì)或其它性質(zhì)的微生物細胞。將 所述細胞遞送至腸可W用于，例如疾病相關(guān)化合物或毒素的分解或代謝或通過影響腸吸收 來降低膽固醇水平，所述疾病相關(guān)化合物或毒素例如草酸鹽，草酸鹽是腎結(jié)石形成的危險 因素。
[0018] 在一些實施方案中，所述微生物細胞可W表達治療因子，例如表達重組蛋白。合適 的重組多膚對于細菌細胞可W是外源的（即所述細菌細胞不會天然表達的多膚，例如人多 膚），并且可W對患者具有治療效果。合適的重組多膚包括細胞因子，包括諸如IL-IO的白細 胞介素;趨化因子；W及抗體、抗體片段或與免疫應(yīng)答的介質(zhì)結(jié)合的相關(guān)結(jié)合分子，所述介 質(zhì)例如細胞因子(例如中和炎性腸病中的TNF-a的細胞因子）。
[0019] 用于表達重組多膚的合適的微生物細胞包括來自乳酸細菌的細胞，，諸如乳酸乳 球菌（L. 1 曰Ctis) (Europesn Journsl of Phsrnmceutics 曰nd Bioph曰rm曰ceutics(2005) 60 : 349)的乳球菌化actococci);腸桿菌科和上文所述的其它腸細菌；W及其它微生物細 胞，例如酵母和真菌，例如酵母或念珠菌。
[0020] 在一些實施方案中，所述干燥的活細胞可W是活細菌疫苗的細胞。活細菌疫苗通 常是毒力已被減弱的細菌細胞，例如通過使一個或多個毒力基因失活。適于用作疫苗的減 毒細菌細胞的很多實例是本領(lǐng)域已知的。
[0021] 細菌疫苗可W是細菌病原體的減毒細胞。減毒疫苗表達病原體的天然內(nèi)源性抗原 可W刺激或引發(fā)針對病原體的有毒力的非疫苗菌株的保護性免疫應(yīng)答。合適的細菌疫苗包 括W下細胞的減毒細胞:霍亂弧菌(V化rio cholerae);大腸桿菌化.coli)的腸毒性菌株， 例如0 1 5 7 : H7、0 1 2 1和0 1 0 4 : H2 1 ;志賀氏菌（Sh i g e 11 a )，例如頻疾志賀氏菌 (S.dysenteriae)、宋內(nèi)志賀氏菌（S. sonnei)、鮑氏志賀氏菌（S.boydii)和福氏志賀氏菌 (S.f Iexneri);彎曲桿菌，例如空腸彎曲桿菌（CJejuni);和沙口氏菌，例如腸沙口氏菌 (Salmonella enterica)(特別是傷寒血清變型）。
[0022] 用于傷寒的治療或預(yù)防性處理的活細菌疫苗是本領(lǐng)域公知的，并且包括傷寒沙口 氏菌（Salmonella typM)菌株Ty21a(Vivotif?)、Ty800、CVD908、CVD908-htr、CVD915和 Z冊。
[0023] 用于霍亂的治療或預(yù)防性處理的活細菌疫苗也是本領(lǐng)域公知的，并且包括郵1(-70、CVD lOl'CVD 102、CVD 104、CVD 105、395N1、JJM43、TCP2、CVD 103、CVD 103-RM、CVD 103-叱3(八41_!化礎(chǔ)〇1飯）、00)110、8址腳111-3、口6削-3、化削-5和化削-15。
[0024] 用于志賀氏菌病和細菌性頻疾的治療或預(yù)防性處理的活細菌疫苗也是本領(lǐng)域公 知的，并且包括減毒志賀氏菌的減毒疫苗菌株，例如CVD1204和WRSSl。
[0025] 用于腹瀉的治療或預(yù)防性處理的活細菌疫苗也是本領(lǐng)域公知的，并且包括減毒腸 毒性大腸桿菌細胞，例如PTL002和PTL003。
[0026] 用于李斯特菌病的治療或預(yù)防性處理的活細菌疫苗也是本領(lǐng)域公知的，并且包括 單核細胞增多性李斯特菌化isteria monocytogenes)的減毒菌株，例如Lmdd。
[0027] 細菌疫苗可W包含編碼外源抗原即不是由疫苗細胞天然表達的抗原(例如人或病 毒抗原或來自不同細菌種類的抗原）的異源核酸。細菌疫苗可W刺激或引發(fā)針對外源抗原 的保護性免疫應(yīng)答，例如當(dāng)抗原出現(xiàn)在病原體或諸如癌細胞或病毒感染的細胞的疾病細胞 的表面上時。
[0028] 術(shù)語"異源"表示的核酸序列是重組序列，所述重組序列被人工使用基因工程或重 組手段，即通過人為干預(yù)，引入構(gòu)建體、載體或細胞。異源的核巧酸序列在自然界中不會一 起出現(xiàn)。對于細胞是異源性的核巧酸或氨基酸序列不會天然存在于該類型、品種(variety) 或種類的細胞中（即外源的或外來的）。對于細胞是異源性的核酸序列可W編碼異源氨基酸 序列，即對于該細胞是外源的或外來的氨基酸序列。
[0029] 在一些實施方案中，異源核酸可W由微生物細胞表達來產(chǎn)生外源抗原。外源抗原 可W由微生物細胞分泌、出現(xiàn)在微生物細胞的表面上或保留在微生物細胞的細胞內(nèi)。
[0030] 在其它實施方案中，異源核酸可W不由微生物細胞表達。例如，異源核酸可W在遞 送至腸后被轉(zhuǎn)移到個體的宿主細胞并在宿主細胞中表達。可W例如WDNA接種或DNA轉(zhuǎn)移的 方法表達異源核酸來產(chǎn)生外源抗原，或者可W例如WRNA干擾的方法表達異源核酸來產(chǎn)生 有義或反義RNA分子。
[0031] 可W由異源核酸編碼的合適的外源抗原包括疾病相關(guān)抗原，例如腫瘤抗原和病 毒、細菌和其它病原體的抗原，例如來自于變形鏈球菌（Streptococcus mu化ns)、宋內(nèi)志賀 氏菌、大腸桿菌、空腸彎曲桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis)、炭痘芽抱 桿菌（日日。111118 311*^日^3)、^￥、流感病毒、肝炎病毒、乳頭瘤病毒、鑲狀追原蟲 (Plasmodium falciparum)、上拉熱弗朗西絲菌（FranciselIa tularensis)和曼森血吸蟲 (Schistosoma mansoni)的抗原，或來自腫瘤的抗原，例如化r2/neu或前列腺特異性抗原 (PSA)O
[0032] 其它合適的外源抗原包括來自個體的分子，例如抗體個體基因型，例如用于產(chǎn)生 抗個體基因型免疫應(yīng)答。
[0033] 任選地，細菌疫苗還可W共表達重組異源免疫調(diào)節(jié)多膚，例如細胞因子，例如TNF-a、GM-CSF、Iレl、Iレ6、Iレ12、Iレ18、IFN-a、IFN-丫；趨化因子，例ク日C化-25;或抑制細胞因 子(例如化-l〇、TGF-e)或其它免疫應(yīng)答介導(dǎo)物或免疫細胞(例如調(diào)節(jié)性T細胞或抑制性T細 胞)的抗體或抗體片段或其它結(jié)合多膚。運可W用于增強對外源抗原的免疫應(yīng)答。
[0034] 用于表達外來抗源的合適的細菌疫苗包括活細菌疫苗菌株，例如減毒病原菌，例 如腸沙口氏菌、霍亂弧菌、腸毒性大腸桿菌、志賀氏菌和空腸彎曲桿菌;和非病原菌細胞，包 括腸細菌，例如腸細菌科；W及其它細菌，例如枯草芽抱桿菌(Bacillus subtlis)和乳酸