專利名稱：一種分離純化紅毛新堿b化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多種色譜分離純化方法，特別涉及一種從紅毛七總生物堿中分離紅毛新堿B有效成分的分離純化方法。
背景技術(shù)：
紅毛七(Radix caulophylli)為小檗科植物類葉牡丹(Leontice robustum(Maxim.)Diels.)的干燥根及根莖，是陜西秦巴山區(qū)特有的天然藥用植物。已有的研究表明紅毛七中主要成分包括木蘭花堿、塔斯品堿、N-甲基金雀花堿等生物堿及葳嚴(yán)苮皂苷等物質(zhì)。紅毛七的提取物具有降壓、興奮子宮平滑肌、抗菌消炎、抗病毒、抗風(fēng)濕、抗痙攣等多種藥理作用。在我國紅毛七為非藥典收載的藥用植物，只在民間應(yīng)用，有關(guān)藥用成分的系統(tǒng)研究和報道較少。我們用細(xì)胞膜色譜篩選技術(shù)對紅毛七的活性作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)紅毛七總生物堿中多種有效成分具有不同的藥理活性，并首次發(fā)現(xiàn)了其中的一種生物堿化合物，命名為紅毛新堿B，經(jīng)用心血管細(xì)胞膜色譜模型篩選和初步藥理學(xué)實驗驗證，該化合物具有抗心肌缺血的藥理活性。
申請人用柱色譜分離技術(shù)，結(jié)合重結(jié)晶方法，從紅毛七總生物堿中分離純化得到紅毛新堿B。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，除了木蘭花堿以外，未見有從紅毛七中分離純化紅毛新堿B的方法報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從紅毛七總生物堿中分離純化紅毛新堿B化合物的方法。該方法快速、方便、有效，為紅毛新堿B的后續(xù)研究提供原料，也為紅毛七總生物堿的系統(tǒng)分離純化提供資料。
實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是，一種分離純化紅毛新堿B化合物的方法，原料選用紅毛七總生物堿浸膏，其特征在于，包括以下步驟
1)將紅毛七總生物堿浸膏用甲醇或乙醇充分溶解以后，過濾，得到紅毛七總生物堿的甲醇溶液或乙醇溶液；將此溶液用柱層析用硅膠吸附、分散，進(jìn)行柱色譜層析分離；2)將樣品上柱層析硅膠柱，以氯仿∶甲醇∶氨水＝3∶1∶0.1為洗脫劑進(jìn)行第一次洗脫，得到HMQ1～HMQ6六個部位，然后按照色帶收集樣品，得到紅色色帶的HMQ6浸膏；3)然后再對上述第一次洗脫后的甲醇溶液或乙醇溶液改用甲醇為洗脫劑進(jìn)行第二次洗脫，得到HMQ7、HMQ8和HMQ9，按照色帶收集樣品；4)紅毛新堿B的分離(1)樣品的制備將HMQ6和HMQ8的浸膏用甲醇充分溶解以后，過濾，得到紅毛七總生物堿中有效部位HMQ6和HMQ8的甲醇溶液，將此溶液與柱層析用硅膠拌樣，揮干甲醇后，用于柱層析分離；(2)色譜柱的準(zhǔn)備取柱層析硅膠，氯仿-甲醇-氨水＝6∶1∶0.05為流動相濕法裝柱，平衡柱子放置過夜，對紅毛七總生物堿中HMQ6和HMQ8的分離；(3)HMQ6和HMQ8的分離將HMQ6和HMQ8上柱樣品用準(zhǔn)備好的分離柱進(jìn)行分離，上柱樣品與裝柱所用的硅膠重量比為1∶50，上好樣品后，采用氯仿-甲醇-氨水＝6∶1∶0.05為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按照色帶收集樣品，分別記為HMQ6-1、HMQ6-2、HMQ6-3、HMQ6-4、HMQ6-5、HMQ8-1、HMQ8-2、HMQ8-3；對得到的上述樣品按照心血管細(xì)胞膜色譜模型和初步藥理學(xué)實驗進(jìn)行篩選，HMQ6-4樣品即為紅毛七總生物堿HMQ6中作用于心血管的化合物紅毛新堿B；5)紅毛新堿B的純化采用重結(jié)晶的方法對紅毛新堿B進(jìn)行純化，重結(jié)晶所用的溶劑為水和氨水的混合物，其比例為10∶1，于4℃保存，即可得到橘黃色絮狀沉淀的紅毛新堿B純品。
本發(fā)明的分離純化紅毛新堿B化合物方法快速、方便、有效。


圖1為本發(fā)明的制備方法的流程圖。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實施例方式
本發(fā)明從紅毛七總生物堿中分離純化紅毛新堿B的實施步驟為1)紅毛七總生物堿的分離(1)紅毛七總生物堿上柱樣品的制備將紅毛七總生物堿的浸膏用甲醇或乙醇充分溶解以后，過濾。得到紅毛七總生物堿的甲醇或乙醇溶液。將此溶液與柱層析用硅膠拌樣，揮干溶劑后，即可用于柱層析分離。
(2)分離柱的準(zhǔn)備取柱層析硅膠，氯仿-甲醇-氨水(3∶1∶0.1)為流動相濕法裝柱，平衡柱子(放置過夜)。平衡后的柱子即可用于紅毛七總生物堿的分離。
(3)紅毛七總生物堿的粗分將上柱樣品用準(zhǔn)備好的分離柱進(jìn)行分離。上柱樣品與裝柱所用的硅膠重量比為1∶20。上好樣品后，首先采用氯仿-甲醇-氨水(3∶1∶0.1)為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫過程按照色帶收集樣品，并分別記為HMQ1(黃色色帶)、HMQ2(紅棕色色帶)、HMQ3(黃色色帶)、HMQ4(青色色帶)、HMQ5(黃色色帶)、HMQ6(紅色色帶)。上述樣品收集完以后，對紅毛七總生物堿的甲醇或乙醇溶液改用甲醇為洗脫劑，進(jìn)行洗脫，得到HMQ7～HMQ9三個部位，按照色帶收集樣品，分別記為HMQ7(紅色色帶)、HMQ8(紅色色帶)、HMQ9(棕色色帶)。
(4)紅毛七總生物堿各分離部位的篩選經(jīng)過本中心的心血管細(xì)胞膜色譜模型和初步藥理學(xué)實驗進(jìn)行篩選，結(jié)果表明HMQ6和HMQ8為紅毛七總生物堿中作用于心血管的有效部位，所以對這兩個部位進(jìn)行進(jìn)一步分離。
2)紅毛新堿B的分離(1)樣品的制備將HMQ6和HMQ8的浸膏用甲醇充分溶解以后，過濾。得到紅毛七總生物堿中有效部位HMQ6和HMQ8的甲醇溶液。將此溶液與柱層析用硅膠拌樣，揮干甲醇后，即可用于柱層析分離。
(2)色譜柱的準(zhǔn)備取柱層析硅膠，氯仿-甲醇-氨水(6∶1∶0.05)為流動相濕法裝柱，平衡柱子(放置過夜)。平衡后的柱子即可用于紅毛七總生物堿中HMQ6的分離。取柱層析硅膠，甲醇為流動相濕法裝柱，平衡柱子(放置過夜)。平衡后的柱子即可用于紅毛七總生物堿中HMQ8的分離。
(3)HMQ6和HMQ8的分離將上柱樣品用準(zhǔn)備好的分離柱進(jìn)行分離。上柱樣品與裝柱所用的硅膠重量比為1∶50。上好樣品后，采用氯仿-甲醇-氨水(6∶1∶0.05)為洗脫劑進(jìn)行，按照色帶收集樣品，分別記為HMQ6-1(黃色色帶)、HMQ6-2(黃色色帶)、HMQ6-3(黃色熒光色帶)、HMQ6-4(紅色色帶即紅毛新堿B)、HMQ6-5(橘紅色色帶)。
(4)HMQ6和HMQ8各分離成分篩選經(jīng)過本中心的心血管細(xì)胞膜色譜模型和初步藥理學(xué)實驗進(jìn)行篩選，結(jié)果表明HMQ6-4即紅毛新堿B為紅毛七總生物堿HMQ6中作用于心血管的化合物。
5)紅毛新堿B的純化
申請人采用重結(jié)晶的方法對紅毛新堿B進(jìn)行純化，具體操作步驟如下分離得到紅毛新堿B的樣品，回收洗脫劑并將樣品蒸干后，用甲醇加入適量氨水作為溶劑，將樣品轉(zhuǎn)移至廣口瓶中。將廣口瓶于4℃保存，可見到橘黃色沉淀產(chǎn)生。用微型抽濾器抽濾，得到此橘黃色沉淀。
取紅毛新堿B的橘黃色沉淀適量，以水-氨水(10∶1)為溶劑，加熱溶解。待樣品完全溶解后，趁熱過濾，得到濾液。將此濾液置于廣口瓶中并于4℃保存，可見到橘黃色絮狀沉淀。如此反復(fù)重結(jié)晶即可得到紅毛新堿B的純品。
紅毛新堿B化合物的母體結(jié)構(gòu)式如下 其中R1和R2是相同或不同，并代表氫、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、鏈炔基；X1和X2是相同或不同，并代表氫、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、鏈烯基、鏈炔基、不飽和的單環(huán)烴、羥基、硫羥基、氨基、銨、鹵素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺；Y1和Y2是相同或不同，并代表氫、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、鏈烯基、鏈炔基、不飽和的單環(huán)烴、羥基、硫羥基、氨基、銨、鹵素、羧酸或酯或其硫酯、酮、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺；R代表氫、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、鏈炔基。
3)紅毛新堿B化合物的結(jié)構(gòu)分析(1)理化性質(zhì)研究紅毛新堿B與硅鎢酸試液、磷鉬酸試液以及碘化鉍鉀試液三種生物堿沉淀試劑作用，均表現(xiàn)出明顯的生物堿反應(yīng)。其熔點為256～258℃。
(2)元素分析采用PE-2400元素分析儀對紅毛新堿B進(jìn)行元素分析測定，推斷其化學(xué)式為C20H24NO6和C20H22NO6。
(3)紫外光譜法紅毛新堿B最大吸收峰為(λmax，nm)269，225，360，308，500。
(4)紅外光譜法紅毛新堿B主要紅外吸收峰為(νmax，KBr)3437cm-1(ν-OH)，2918cm-1(ν-CH)，1672cm-1(ν＝CO)，1269cm-1(ν-CN)，1600cm-1，1500cm-1(苯環(huán)的特征吸收峰)。
(5)質(zhì)譜法紅毛新堿B的MS(m/z)343，298，285，224，139，115，58(100)。
(6)核磁共振波譜法紅毛新堿B的1H-NMRδ4.02(2，10-OCH3)，6.61(3H)，3.45(4H)，3.48(5H)，3.16(N-CH3)，7.62(6a-OH)，7.31(8H)，6.81(9H)。
13C-NMRδ141.12(1C)，157.65(2C)，114.55(3C)，29.72(4C)，61.14(5C)，112.94(6a C)，198.15(7C)，123.04(8C)，114.12(9C)，157.79(10C)，140.95(11C)，129.47(12C)，129.87(13C)，135.00(15C)，126.62(17C)，57.95(2-OCH3)，58.06(10-OCH3)，45.77(N-CH3)。
綜合四譜信息，確定紅毛新堿B為一種生物堿類化合物，其化學(xué)名為1，6a，11-三羥基-2，10-二甲氧基-6，6-甲基-7-氧-5，6，6a，7-四氫-[de，g]-4H-二苯并異喹啉(1，6a，11-trihydroxy-2，10-dimethoxy-6，6-dimethyl-7-oxo-5，6，6a，7-tetrahydro-4H-Dibenzo[de，g]quinolinium)。通過查閱CA，未發(fā)現(xiàn)與此結(jié)構(gòu)相同的化合物。
權(quán)利要求
1.一種分離純化紅毛新堿B化合物的方法，原料選用紅毛七總生物堿浸膏，其特征在于，包括以下步驟1)將紅毛七總生物堿浸膏用甲醇或乙醇充分溶解以后，過濾，得到紅毛七總生物堿的甲醇溶液或乙醇溶液；將此溶液用柱層析用硅膠吸附、分散，進(jìn)行柱色譜層析分離；2)將樣品上柱層析硅膠柱，以氯仿∶甲醇∶氨水＝3∶1∶0.1為洗脫劑進(jìn)行第一次洗脫，得到HMQ1～HMQ6六個部位，然后按照色帶收集樣品，得到紅色色帶的HMQ6浸膏；3)然后再對上述第一次洗脫后的甲醇溶液或乙醇溶液改用甲醇為洗脫劑進(jìn)行第二次洗脫，得到HMQ7～HMQ9三個部位，按照色帶收集樣品，得到紅色色帶的HMQ8浸膏；4)紅毛新堿B的分離(1)樣品的制備將HMQ6和HMQ8的浸膏用甲醇充分溶解以后，過濾，得到紅毛七總生物堿中有效部位HMQ6和HMQ8的甲醇溶液，將此溶液與柱層析用硅膠拌樣，揮干甲醇后，用于柱層析分離；(2)色譜柱的準(zhǔn)備取柱層析硅膠，氯仿-甲醇-氨水＝6∶1∶0.05為流動相濕法裝柱，平衡柱子放置過夜，對紅毛七總生物堿中HMQ6和HMQ8的分離；(3)HMQ6和HMQ8的分離將HMQ6和HMQ8上柱樣品用準(zhǔn)備好的分離柱進(jìn)行分離，上柱樣品與裝柱所用的硅膠重量比為1∶50，上好樣品后，采用氯仿-甲醇-氨水＝6∶1∶0.05為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按照色帶收集樣品，分別記為HMQ6-1、HMQ6-2、HMQ6-3、HMQ6-4、HMQ6-5、HMQ8-1、HMQ8-2、HMQ8-3；對得到的上述樣品按照心血管細(xì)胞膜色譜模型和初步藥理學(xué)實驗進(jìn)行篩選，HMQ6-4樣品即為紅毛七總生物堿HMQ6中作用于心血管的化合物紅毛新堿B；5)紅毛新堿B的純化采用重結(jié)晶的方法對紅毛新堿B進(jìn)行純化，重結(jié)晶所用的溶劑為水和氨水的混合物，其比例為10∶1，于4℃保存，即可得到橘黃色絮狀沉淀的紅毛新堿B純品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離紅毛新堿B化合物的方法，原料選用紅毛七總生物堿浸膏，將紅毛七總生物堿浸膏用適量甲醇或乙醇溶解后，與柱層析硅膠拌樣。取柱層析用硅膠，氯仿－甲醇－氨水濕法裝柱，平衡柱子。將所拌好的樣品上柱層析硅膠柱，氯仿－甲醇－氨水為洗脫劑進(jìn)行洗脫。按照色帶收集樣品。然后改用甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按照色帶收集樣品。最后用甲醇－鹽酸為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按照色帶收集樣品，即可得到紅毛七總生物堿中的HMQ1～HMQ9九個部位，然后對HMQ6和HMQ8兩個部位進(jìn)行進(jìn)一步分離。分別采用氯仿－甲醇－氨水為洗脫劑或甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按照色帶收集樣品。即可得到化合物紅毛新堿B，其方法快速、簡便、有效。
文檔編號C07D221/18GK1733732SQ20051004310
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者賀浪沖, 王娜, 王嗣岑, 杜鵑, 張健, 溫彬宇 申請人:西安交通大學(xué)