專利名稱：芳香烴化合物的降解細(xì)菌及其分離純化和生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌，尤其涉及一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌及其分離純化和生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
芳香烴類化合物在自然界中普遍存在，它們是煤炭、石油等化石性燃料的天然組成成分；植物體也可產(chǎn)生多種酚類次生代謝產(chǎn)物；另外人類在工業(yè)(特別是制藥、印染等工業(yè))生產(chǎn)過程中也會產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的芳香烴類化合物。在自然界中它們多以酚或鹵代烴的形式存在。由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有特殊的熱穩(wěn)定性，同時又難溶于水，所以一般很難消除。而極低含量的這類物質(zhì)就可以對人體造成強(qiáng)效的或潛在的危害。
以多環(huán)芳香烴為例，這是一類在環(huán)境中普遍存在的物質(zhì)，其產(chǎn)生主要是有機(jī)物的不完全燃燒。如煤和石油制品的燃燒、原油加工、木材加工、汽車排放的尾氣污染物以及生活或工業(yè)廢物的焚燒處理等。在自然界中，這類物質(zhì)[特別是較高分子量(四環(huán)以上)的]可以保持其固有的毒性而持久存在。它們難溶于水，能在土壤中積累，且它們在食物鏈中有累積作用。在這類物質(zhì)以較低濃度存在的情況下，就能引發(fā)人體組織器官的癌變以及肝、腎、心肌等多種組織器官的功能衰竭。
如何消除這類污染物在很長時間內(nèi)一直困擾著人們。微生物降解法顯然是比較優(yōu)秀的方法之一，而其關(guān)鍵就在于如何獲得具有特定降解能力的微生物菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌分離純化方法。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌，從餐櫥油煙的污染土壤與來自針葉林的腐殖土混合中分離出來，現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。
一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌，其特征在于，該細(xì)菌為帕氏氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203053，保藏日期2003年6月20日。
帕氏氫噬胞菌的特征為G+，個體形態(tài)為彎桿狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，產(chǎn)淺黃綠色-褐色色素，不代謝乳糖；最適宜生長溫度為26-28℃，最適宜生長pH為6.8-7.2，兼性自養(yǎng)，兼厭氣性。
一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌分離純化方法，其特征在于取餐櫥油煙的污染土壤與來自針葉林的腐殖土混合；將該混合土壤與溶解于橄欖油的芳香烴化合物混合均勻，密閉培養(yǎng)3天。將含芳香烴化合物的土壤與生理鹽水混合，離心分離，去除大顆粒物質(zhì)后保留上層均勻渾濁的液體；將渾濁的液體再進(jìn)行離心分離，收集離心所得的沉淀；將該沉淀在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽固體瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線接種，培養(yǎng)溫度為27～29℃，培養(yǎng)2～7天，直至出現(xiàn)明顯單個菌落；將篩選獲得的單菌落，在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上連續(xù)傳6代，使之成為菌落形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。
本發(fā)明所用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為單位為克/升A液Na2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0B液MgSO4·7H2O 0.2MnSO4·H2O 3.0毫克ZnSO4·7H2O 0.2毫克CoCl2·6H2O 15.3毫克分別配制A、B液，按A液與B液的體積比為1∶0.8-1.2混合，調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2，攪拌均勻，靜置，使其無沉淀產(chǎn)生；將基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基121℃滅菌15分鐘后冷卻。
基礎(chǔ)鹽固體瓊脂平板培養(yǎng)基配方在上述培養(yǎng)基A、B液混合均勻，靜置，無沉淀后，加入2.0～2.5wt％瓊脂粉，攪拌均勻，121℃滅菌15分鐘。趁熱倒入培養(yǎng)皿平板，冷卻后保藏在萘蒸氣環(huán)境中。
本發(fā)明的碳源由萘組成，用丙酮溶解，丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8。
本發(fā)明的芳香烴化合物選自萘、芴或蒽。
該菌株可用一般發(fā)酵工業(yè)中的通用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明的細(xì)菌，一個工藝流程。從常規(guī)分離、篩選方法不超過20天，且很容易將萘代謝菌與具有忍受高濃度萘的自養(yǎng)菌分離。
本發(fā)明采用的生產(chǎn)方法為靜置培養(yǎng)出的單菌落→種子液→種子罐→生產(chǎn)罐→產(chǎn)品分裝(或用吸附劑吸附后再包裝)。
一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)將菌種接種在基礎(chǔ)鹽簡單培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌后倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2.0-2.5wt％，冷卻備用。
將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養(yǎng)48小時，至出現(xiàn)典型的單菌落培養(yǎng)物。
2)將上述培養(yǎng)菌種接入基礎(chǔ)種子瓶，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；培養(yǎng)基配方為單位g/L
Na2HPO4·12H2O9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O0.2檸檬酸鐵銨5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8；3)將種子液接入種子罐培養(yǎng)，種子罐培養(yǎng)基為單位g/L蛋白胨 10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖 2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min后冷卻備用；用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8，作為限制因子。
4)將種子液接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐培養(yǎng)基為單位g/L蛋白胨 10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖 2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min后冷卻。
5)培養(yǎng)液可直接分裝成產(chǎn)品也可用吸附劑吸附后再進(jìn)行分裝。
降解微生物菌株的定性檢測方法為用pH6.8～7.2的磷酸鹽緩沖溶液將培養(yǎng)收獲的菌體清洗兩次，并使至成為靜止細(xì)胞，用此靜止細(xì)胞在含有飽和萘的磷酸鹽緩沖液體系中反應(yīng)2小時，離心去除細(xì)胞后，將上清液用二氯甲烷等體積萃取，無水硫酸鎂干燥樣品后做氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)檢測，得到GC/MS譜。由此可知菌株對萘是否具有降解能力。
本發(fā)明的降解細(xì)菌，可使萘等芳香烴類環(huán)境污染物降解90％以上。本發(fā)明的細(xì)菌至少可用于降解廢水或環(huán)境中殘留的芳香化合物和稠環(huán)芳香化合物，對于保護(hù)環(huán)境，保護(hù)人們的健康具有重要的意義。它可用于被芳香烴類化合物污染的土壤及水體的環(huán)境修復(fù)，以及特殊污染物的高效、安全的集中處理，在芳香烴類化合物污染環(huán)境的修復(fù)以及特殊污染物的集中無害化處理中能長期、高效使用。適合在全國石油化工行業(yè)及因長期使用化石類燃料而出現(xiàn)芳香烴污染的地區(qū)使用。它使用方便，成本低，效果好。能在芳香烴類化合物過飽和的水體中生存并使其得到快速降解。
試驗(yàn)表明，該技術(shù)在芳香烴類化合物污染環(huán)境的修復(fù)以及特殊污染物的集中無害化處理中能長期、高效使用，與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的菌株專一性和適應(yīng)性強(qiáng)，便于增殖和利用開發(fā)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采集針葉林腐殖土與餐櫥油煙混合，噴濕，密閉，28℃發(fā)酵2天。待發(fā)酵的土壤樣品表面出現(xiàn)大量放線菌、真菌菌絲體時，用橄欖油溶解萘、芴或蒽，傾倒在土壤樣品表面。密閉，28℃發(fā)酵3天。將此發(fā)酵土壤與2倍體積的生理鹽水混合，在1000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心3分鐘，去除大顆粒物質(zhì)后保留上層均勻渾濁的液體。將此均勻渾濁的液體在6000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度下離心15分鐘，收集離心所得的沉淀。將該沉淀在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上劃線接種，27～29℃培養(yǎng)2天，即出現(xiàn)明顯單個菌落。將篩選獲得的單菌落，分別在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上連續(xù)傳6代，每代培養(yǎng)48小時，使之成為菌落形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。將菌種接種在基礎(chǔ)鹽簡單培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O0.2檸檬酸鐵銨5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O0.2mg
CoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌后倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2wt％，冷卻備用。
將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養(yǎng)48小時，至出現(xiàn)典型的單菌落培養(yǎng)物。
2)將上述培養(yǎng)菌種接入基礎(chǔ)種子瓶，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；培養(yǎng)基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8；鑒定所獲得的菌株，每克活菌能在36小時內(nèi)降解1克萘，具有較強(qiáng)的萘降解能力。這個菌株的主要特征為G+，個體形態(tài)為彎桿狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，具有比較明顯的溶瓊脂性，產(chǎn)淺黃綠色-褐色色素。最適生長溫度為26-28℃，最適生長pH為6.8-7.2，兼性自養(yǎng)，兼厭氣性。
實(shí)施例2將瓊脂斜面上的菌種接種在固體瓊脂平板上，碳源為萘蒸氣，28℃培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)至出現(xiàn)典型的單菌落培養(yǎng)物。配制4000.0ml種子瓶培養(yǎng)基，分裝至20只500ml的錐形瓶中，121℃滅菌30min后冷卻備用。用時加入40ml/L丙酮∶萘＝5∶6(w/w)，挑取固體瓊脂平板上的單個菌落，接入基礎(chǔ)種子瓶，恒溫水浴搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在26-28℃，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分，密閉培養(yǎng)24小時。24小時后更換全部基礎(chǔ)種子瓶的無菌空氣。再繼續(xù)培養(yǎng)24小時后6000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘收獲菌體。將離心獲得的菌體接入種子罐。種子罐為0.5噸，投料量為0.4噸，培養(yǎng)基成分為蛋白胨4kg，酵母浸膏2kg，NaCl 2kg，葡萄糖0.8kg。加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min后冷卻備用。用時加入4L丙酮/萘溶液，其中含萘1.6kg。種子罐須先用蒸汽滅菌并冷卻至26-28℃攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1∶0.8，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將種子液接入生產(chǎn)罐，生產(chǎn)罐為5噸，投料量4噸，培養(yǎng)基成分為蛋白胨40kg，酵母浸膏20kg，NaCl 20kg，葡萄糖8kg。生產(chǎn)罐預(yù)先用蒸汽滅菌。
權(quán)利要求
1.一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌，其特征在于，該細(xì)菌為帕氏氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203053。
2.如權(quán)利要求1所述的降解細(xì)菌，其特征在于，帕氏氫噬胞菌為G+，個體形態(tài)為彎桿狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，產(chǎn)淺黃綠色-褐色色素，不代謝乳糖；最適宜生長溫度為26-28℃，最適宜生長pH為6.8-7.2，兼性自養(yǎng)，兼厭氣性。
3.如權(quán)利要求1所述的降解細(xì)菌分離純化方法，其特征在于取餐櫥油煙的污染土壤與來自針葉林的腐殖土混合；將該混合土壤與溶解于橄欖油的芳香烴化合物混合均勻，密閉培養(yǎng)3天。將含芳香烴化合物的土壤與生理鹽水混合，離心分離，去除大顆粒物質(zhì)后保留上層均勻渾濁的液體；將渾濁的液體再進(jìn)行離心分離，收集離心所得的沉淀；將該沉淀在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽固體瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線接種，培養(yǎng)溫度為27～29℃，培養(yǎng)2～7天，直至出現(xiàn)明顯單個菌落；將篩選獲得的單菌落，在以萘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上連續(xù)傳6代，使之成為菌落形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為單位為克/升A液Na2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0B液MgSO4·7H2O 0.2MnSO4·H2O3.0毫克ZnSO4·7H2O 0.2毫克CoCl2·6H2O 15.3毫克按A液與B液的體積比為1∶0.8-1.2混合，調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2，攪拌均勻，靜置，使其無沉淀產(chǎn)生；將基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基121℃滅菌15分鐘。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，基礎(chǔ)鹽固體瓊脂平板培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基A、B液混合均勻，靜置，無沉淀后，加入2.0～2.5wt％瓊脂粉，攪拌均勻，121℃滅菌。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，碳源由萘組成，用丙酮溶解，丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，芳香烴化合物選自萘、芴或蒽。
8.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的降解細(xì)菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)將菌種接種在基礎(chǔ)鹽簡單培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌后倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2.0-2.5wt％；將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養(yǎng)48小時，至出現(xiàn)典型的單菌落培養(yǎng)物；2)將上述培養(yǎng)菌種接入基礎(chǔ)種子瓶，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；培養(yǎng)基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8；3)將種子液接入種子罐培養(yǎng)，種子罐培養(yǎng)基為單位g/L蛋白胨10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min；用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質(zhì)量比為5∶1-1.8，作為限制因子；4)將種子液接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐培養(yǎng)基為單位g/L蛋白胨 10.0酵母浸膏5.0NaCl5.0葡萄糖 2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min；5)培養(yǎng)液直接分裝成產(chǎn)品或用吸附劑吸附后再進(jìn)行分裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌，尤其涉及一種芳香烴化合物的降解細(xì)菌及其分離純化和生產(chǎn)方法。降解細(xì)菌，從餐櫥油煙的污染土壤與來自針葉林的腐殖土混合中培養(yǎng)出來，現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。細(xì)菌為帕氏氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203053。該細(xì)菌為G
文檔編號C12N1/20GK1800350SQ20041008235
公開日2006年7月12日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者章儉, 夏春谷 申請人:中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所