專(zhuān)利名稱：Tnf/ngf受體家族和其它蛋白質(zhì)的受體的功能的調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來(lái)說(shuō)本發(fā)明涉及屬于TNF/NGF超級(jí)家族的受體和其生物學(xué)功能的控制領(lǐng)域。TNF/NGF超級(jí)家族的受體包括受體例如p55和p75腫瘤壞死因子受體(TNF-Rs，下文中稱為p55-R和p75-R)和FAS配體受體(也稱為FAS/APO1或FAS-R和下文將稱為FAS-R)和其它。特別地，本發(fā)明涉及結(jié)合到其它蛋白質(zhì)的新的蛋白質(zhì)，所述的其它蛋白質(zhì)是本身直接或間接結(jié)合到TNF/NGF受體家族的成員和其它胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。
更具體地說(shuō)，涉及一種在此被稱為RAP-2(對(duì)于RIP-相關(guān)蛋白質(zhì)-2)的蛋白質(zhì)，和其同型，片段，衍生物以及結(jié)合到RAP-2的蛋白質(zhì)。
RAP-2結(jié)合到RIP(“受體相互作用蛋白質(zhì)”)并且能夠調(diào)節(jié)或介導(dǎo)RIP的功能并且從而也能夠直接或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)直接或間接結(jié)合到RIP的其它蛋白質(zhì)的功能。RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)是RAP-2功能的調(diào)節(jié)劑/介導(dǎo)劑。
相關(guān)領(lǐng)域的背景技術(shù)腫瘤壞死因子(TNF-α)和淋巴細(xì)胞毒素(TNF-β)(下文中稱為T(mén)NF，涉及TNF-α和TNF-β)是主要由單核細(xì)胞噬吞細(xì)胞形成的多功能的炎癥性的細(xì)胞因子，它定義細(xì)胞有許多作用Wallach，D.(1986)參見(jiàn)干擾素7(Ion Gresser，ed.)，pp.83-122，學(xué)術(shù)出版社，倫敦；和Beutler和Cerami(1987)。TNF-α和TNF-β通過(guò)結(jié)合到特異性的細(xì)胞表面受體啟動(dòng)其作用。一些效果有利于生物體例如它們可能毀壞腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞和增加粒性白細(xì)胞的抗細(xì)菌活性。以這種方式，TNF有助于生物體對(duì)抗腫瘤和感染因子的防御和有助于從受傷中恢復(fù)。因此TNF可以用作為抗腫瘤劑，在該申請(qǐng)中它結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面的受體，從而啟動(dòng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的情況發(fā)生。TNF也可以用作為抗感染劑。
但是，TNF-α和TNF-β也具有有害的作用。有證據(jù)表明TNF-a的過(guò)量產(chǎn)生在幾種疾病中起著主要的病理作用。例如，主要對(duì)脈管系統(tǒng)有作用INF-α已知是膿毒性的休克癥狀的主要的原因(Tracey等人，1986)。在一些疾病中，TNF通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞的活性和通過(guò)引起食欲缺乏可以引起體重過(guò)多的損失(惡病質(zhì))，和因此TNF-α被稱為惡液質(zhì)素(cachetin)。也將它描述為在風(fēng)濕病的疾病中對(duì)組織有損害的介導(dǎo)劑(Beutler和Cerami，1987)和作為在移植-對(duì)-宿主反應(yīng)中觀察到的損害的介導(dǎo)劑(Piquet等人，1987)。另外已知TNF參與發(fā)炎和許多其它疾病的過(guò)程。
特定地結(jié)合TNF-α和TNF-β的兩個(gè)不同的獨(dú)立地表達(dá)受體p55和p75TNF-Rs開(kāi)始和/或介導(dǎo)上述TNF的生物學(xué)作用。這能夠受體結(jié)構(gòu)上已經(jīng)具有不同的胞內(nèi)區(qū)域，表明它們形成不同的信號(hào)(參見(jiàn)Hohmann等人，1989；Engelmann等人，1990；Brockhaus等人，1990；Leotscher等人，1990；Schall等人，1990；Nophar等人，1990；Smith等人，1990；和Heller等人，1990)。但是，至今沒(méi)有闡述參與p55和p75TNF-Rs胞內(nèi)成信號(hào)的細(xì)胞原理例如各種蛋白質(zhì)和可能的其它因子。這就是胞內(nèi)形成信號(hào)，通常出現(xiàn)在配體即TNF(α或β)與受體結(jié)合之后，其作用是最終導(dǎo)致在觀察到的細(xì)胞對(duì)TNF的應(yīng)答中級(jí)聯(lián)反應(yīng)的開(kāi)始。
對(duì)于至今在研究的大多數(shù)細(xì)胞中上面特定的TNF的殺細(xì)胞作用，該作用主要通過(guò)p55 TNF-R觸發(fā)。抗p55 TNF-R的胞內(nèi)區(qū)域(配體結(jié)合區(qū)域)的抗體本身能夠觸發(fā)殺細(xì)胞作用(參見(jiàn)EP412486)，這與由抗體交叉連接的受體的效果相關(guān)，據(jù)信是胞內(nèi)的信號(hào)形成過(guò)程產(chǎn)生的第一步。從而，突變的研究已經(jīng)證明(Brakebusch等人，1992；Tartaglia等人，1993)p55 TNF-R的生物學(xué)功能取決于其胞內(nèi)區(qū)域的整體性。因此，已經(jīng)暗示導(dǎo)致TNF的殺細(xì)胞作用的表明信號(hào)形成的開(kāi)始出現(xiàn)是由于一個(gè)或多個(gè)p55TNF-R胞內(nèi)區(qū)域的關(guān)聯(lián)的結(jié)果。而且，TNF(α和β)出現(xiàn)在同源三聚體的形式，這樣已經(jīng)暗示借助于p55TNF-R根據(jù)其結(jié)合和交叉連接該受體分子的能力誘導(dǎo)表明信號(hào)的形成，即引起受體凝聚。
TNF/NGF超級(jí)家族的受體另一個(gè)成員是FAS受體(FAS-R)，也將其稱之為FAS抗原，在各種組織表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)和與包括TNF-R和NGF-R的細(xì)胞表面受體的成員具有同源性。FAS-R在細(xì)胞凋亡中介導(dǎo)細(xì)胞死亡(Itoh等人，1991)，并且顯示用作為自體反應(yīng)T細(xì)胞的負(fù)選擇劑，即T細(xì)胞的成熟過(guò)程中，F(xiàn)AS-R介導(dǎo)T細(xì)胞識(shí)別的自體抗原的程序化死亡。還已經(jīng)得出了FAS-R基因(lpr)的突變引起小鼠的淋巴細(xì)胞增殖的紊亂，這類(lèi)似于人自體免疫疾病系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)(Watanabe-Fukunaga等人，1992)。FAS-R的配體似乎是致死性T細(xì)胞攜帶的細(xì)胞表面相關(guān)的分子(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTLs)，因此當(dāng)CTLs與攜帶FAS-R的細(xì)胞接觸時(shí)，它們能夠誘導(dǎo)攜帶FAS-R細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。此外，已經(jīng)制備了單克隆抗體，它是與FAS-R特異性的，這些單克隆抗體能夠誘導(dǎo)攜帶FAS-R細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，包括由cDNA編碼的人轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞FAS-R(Itoh等人，1991)。
申請(qǐng)人已經(jīng)制備了許多途徑(參見(jiàn)實(shí)施例，歐洲專(zhuān)利第EP 186833，EP308378，EP398327和EP412486號(hào)申請(qǐng))，這些途徑通過(guò)利用抗TNF抗體或通過(guò)利用可溶性TNF受體以便競(jìng)爭(zhēng)TNF結(jié)合到細(xì)胞表面結(jié)合的TNF-Rs，通過(guò)抑制TNF與其受體的結(jié)合調(diào)節(jié)TNF的有害作用。此外，基于TNF結(jié)合到其受體是TNF誘導(dǎo)細(xì)胞作用所需要的，申請(qǐng)人已經(jīng)制備的途徑(參見(jiàn)例如EP 568925)通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-Ps的活性調(diào)節(jié)TNF的作用。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，EP 568925涉及調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或裂解TNF-Rs的方法，從而肽或其它分子可以與受體本身或與受體相互作用的效應(yīng)子蛋白質(zhì)相互作用，因此調(diào)節(jié)TNF-Rs的正常功能。對(duì)于EP568925，描述了在p55 TNP-R的胞外，膜內(nèi)和胞內(nèi)區(qū)域具有突變的各種突變體p55 TNF-P的構(gòu)建和特征。以這種方式，將p55TNF-R的上述區(qū)域內(nèi)的區(qū)域鑒別為是受體的功能所必須的，即配體(TNF)的結(jié)合和隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)信號(hào)形成最大限度地導(dǎo)致觀察到TNF對(duì)細(xì)胞的作用。此外，還描述了分離和鑒別蛋白質(zhì)，肽或其它因子的許多途徑，所述的因子能夠參與調(diào)節(jié)或協(xié)調(diào)的TNF-R的活性。分離和克隆編碼這樣的蛋白質(zhì)，肽的DNA序列的許多途徑，所述的DNA用于構(gòu)建用于生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)和肽的表達(dá)載體，和與TNF-R或與上述的蛋白質(zhì)和肽相互作用的用于制備抗體或其片段，也已經(jīng)在EP 568925中公開(kāi)了，其中所述的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合TNF-R的各種區(qū)域。但是，EP 568925沒(méi)有限定實(shí)際的蛋白質(zhì)和肽，它們結(jié)合到TNF-Rs的胞內(nèi)區(qū)域(例如，p55TNF-R)，它沒(méi)有描述分離和鑒別這樣的蛋白質(zhì)或肽的酵母的兩種雜交途徑，所述的蛋白質(zhì)和肽結(jié)合到TNF-Rs的胞內(nèi)區(qū)域。類(lèi)似地，EP568925沒(méi)有公開(kāi)能夠結(jié)合到FAS-R的胞內(nèi)區(qū)域的蛋白質(zhì)或肽。
然而眾所周知，腫瘤壞死因子(TNF)受體和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的受體FAS-R，由于白細(xì)胞產(chǎn)生的配體的刺激和細(xì)胞中激發(fā)破壞性活性，導(dǎo)致其自身死亡，所以該激發(fā)過(guò)程的機(jī)理仍然了解得很少。突變研究表明有關(guān)細(xì)胞毒性在FAS-R和p55 TNF受體(p55-R)信號(hào)形成時(shí)涉及胞內(nèi)區(qū)的不同的區(qū)域(Brakebusch等人，1992；Tartaglia等人，1993；Itoh和Nagata，1993)。這些區(qū)域(死亡區(qū)域)具有類(lèi)似的序列。FAS-R和p55-R的死亡區(qū)域趨向于自我關(guān)聯(lián)。它們的自我關(guān)聯(lián)明顯促進(jìn)了信號(hào)形成的啟動(dòng)所必要的受體的凝聚(參見(jiàn)Song等人，1994；Wallach等人，1994；Boldin等人，1995)，受體的高水平表達(dá)導(dǎo)致獨(dú)立于配體信號(hào)形成的激發(fā)(Boldin等人，1995)。
與其它受體誘導(dǎo)的作用類(lèi)似，由TNF受體和FAS-R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡通過(guò)一系列的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生，導(dǎo)致從配體-受體的結(jié)合到最終的酶促效應(yīng)子功能的激發(fā)的轉(zhuǎn)變，在這種情況下，研究工作已經(jīng)闡明了非酶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，這種作用啟動(dòng)細(xì)胞死亡的信號(hào)形成三聚體TNF或FAS-R配體分子與受體的結(jié)合，由申請(qǐng)區(qū)域基序傾向于自我關(guān)聯(lián)(Brakebusch等人，1992；Tartaglia等人，1993；Itoh和Nagata，1993)，增加了最后其胞內(nèi)分子相互作用(Boldin等人，1995a)，并且誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)(也可以相互結(jié)合)到受體胞內(nèi)區(qū)域-MORT-1(或FADD)到FAS-R(Boldin等人，1995b；Chinnaiyan等人，1995；Kischkel等人，1995)和TRADD結(jié)合到p55-R(Hsu等人，1995；Hsu等人，1996)。在死亡區(qū)域結(jié)合到FAS-R and p55-R胞內(nèi)區(qū)域的三個(gè)蛋白質(zhì)由受體通過(guò)同源區(qū)域的異源關(guān)聯(lián)參與細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)，并且也能夠獨(dú)立地激發(fā)細(xì)胞死亡，該三個(gè)蛋白質(zhì)由酵母的兩個(gè)雜交篩選程序鑒別。其中之一是蛋白質(zhì)，MORT-1(Boldin等人，1995b)也已知為FADD(Chinnalyan等人，1995)，它特異性地與FAS-R結(jié)合。第二個(gè)是TRADD(也參加Hsu等人，1995，1996)結(jié)合到p55-R，和第三個(gè)RIP(也參加Stanger等人，1995)，結(jié)合到FAS-R和p55-R。除了結(jié)合到FAS-R和p55-R，這些蛋白質(zhì)也能夠互相結(jié)合，這提供了FAS-R和p55-R之間的功能性“相互交談”(“cross-talk”)。這些結(jié)合通過(guò)保守的序列的基序出現(xiàn)，“死亡區(qū)域分子”，受體和它們的相關(guān)蛋白質(zhì)一樣如此。此外，雖然酵母的兩個(gè)雜交測(cè)試中證明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MORT-1自發(fā)地結(jié)合到FAS-R，其結(jié)合僅發(fā)生在受體刺激之后，暗示MORT-1參與FAS-R信號(hào)形成的啟動(dòng)。MORT-1不含有酶促活性的任何序列基序的特征，因此它激發(fā)細(xì)胞死亡的能力似乎不涉及MORT-1本身的內(nèi)在活性，但是，一些結(jié)合到MORT-1的其它蛋白質(zhì)的活化并且進(jìn)一步在信號(hào)形成級(jí)聯(lián)的下游起作用。已經(jīng)證明失去該分子的N-末端部分的MORT-1突變體的細(xì)胞表達(dá)通過(guò)FAS/APO1(FAS-R)或p55-R阻止細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)(Hsu等人，1996；Chinnalyan等人，1996)，表明該N-末端區(qū)域通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用轉(zhuǎn)移兩個(gè)受體殺細(xì)胞作用的信號(hào)形成。
因此，受體p55-R和FAS-R的“死亡區(qū)域的基序”以及它們?nèi)齻€(gè)相關(guān)的蛋白質(zhì)MORT-1，RIP和TRADD似乎是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位置。三個(gè)蛋白質(zhì)MORT-1，RIP和TRADD與p55-R和FAS-R胞內(nèi)區(qū)域相互作用。通過(guò)其死亡區(qū)域與這些受體的死亡區(qū)域結(jié)合，對(duì)于RIP和TRADD其死亡區(qū)域也自我關(guān)聯(lián)，(雖然MORT-1在這一方面的不同，其死亡區(qū)域不自我關(guān)聯(lián))。此外MORT-1和TRADD分別結(jié)合到FAS-R和p55-R并且也互相結(jié)合。而且MORT-1和TRADD有效地結(jié)合到RIP。因此，似乎三個(gè)蛋白質(zhì)MORT-1，RIP和TRADD之間的相互作用是由該三個(gè)蛋白質(zhì)介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)形成的總的調(diào)節(jié)的一部分。這三個(gè)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用的干擾導(dǎo)致由該作用引起的調(diào)節(jié)。例如，TRADD結(jié)合到MORT-1的抑制可以調(diào)節(jié)FAS-R-p55 TNF-R的相互作用。另外，除了上述TRADD結(jié)合到MORT-1的抑制，RIP的抑制可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)FAS-R-p55TNF-R的相互作用。
抗p55-R的死亡區(qū)域的單克隆抗體特異性地抗TRADD和RIP位點(diǎn)的結(jié)合位置，也可用于抑制或阻止這些蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此導(dǎo)致FAS-R和p55-R的之間的相互作用的調(diào)節(jié)。
最近也發(fā)現(xiàn)除了上述所述的細(xì)胞細(xì)胞毒性和其通過(guò)各種受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，其結(jié)合蛋白質(zhì)包括FAS-R，p55-R，MORT-1，TRADD，RIP，MACH，Mch4，和G1，許多這樣的受體和其結(jié)合蛋白質(zhì)也參與核的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性的調(diào)節(jié)，它是細(xì)胞生存或成活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，負(fù)責(zé)許多免疫和炎癥應(yīng)答基因的控制表達(dá)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNF-α實(shí)際上刺激NF-κB的活性，因此TNF-α能夠在細(xì)胞中結(jié)合兩類(lèi)信號(hào)，一類(lèi)激發(fā)細(xì)胞死亡和通過(guò)借助于NF-κB誘導(dǎo)基因表達(dá)的保護(hù)抗死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞的另一類(lèi)(參見(jiàn)Beg和Baltimore，1996；Wang等人，1996；Van Antwerp等人，1996)。也已經(jīng)報(bào)道了對(duì)于FAS-R的類(lèi)似的雙重的作用(參見(jiàn)如在上述Van Antwerp等人，1996所述的作用的參照)。因此顯示基于TNF-α和/或FAS-R配體的各種類(lèi)型的細(xì)胞刺激之上，在細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活之間存在有脆弱平衡，刺激的最終結(jié)果取決于細(xì)胞內(nèi)哪方面被刺激到最大程度，一種情況導(dǎo)致死亡(通常由于程序化死亡)，另一種情況是通過(guò)NF-κB的活性而存活。
另外，本發(fā)明人最近也進(jìn)一步闡明了TNF/NGF受體家族成員激活NF-κB的可能的途徑(參見(jiàn)Malinin等人，1997和本文提出的各種最后的參照；和共同擁有的正在審查的IsraeL專(zhuān)利申請(qǐng)第IL 117800和IL 119133號(hào))。簡(jiǎn)單地說(shuō)，它提出了TNF/NGF受體家族的幾個(gè)成員通過(guò)共同的接合器蛋白質(zhì)，TRAF2能夠激活NF-κB。稱之為NIK的新闡明的蛋白質(zhì)激酶(參見(jiàn)上述Malinin等人，1997和IL 117800和IL 119133)能夠結(jié)合到TRAF2和刺激NF-κB活性。事實(shí)上，已經(jīng)證明(參見(jiàn)前面所述的Malinin等人和IL申請(qǐng))在激酶缺陷的NIK突變體細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生以正常的內(nèi)源的方式不能刺激NF-κB和也在通過(guò)TNF借助于FAS-R誘導(dǎo)NF-κB活性的阻止，通過(guò)TRADD，RIP和MORT-1阻止NF-κB的誘導(dǎo)(它是結(jié)合這些受體p55-R和/或FAS-R受體的接合器蛋白質(zhì))。所有這些受體p55-R，p75-R，F(xiàn)AS-R和其接合器蛋白質(zhì)MORT-1，TRADD和RIP直接或間接結(jié)合到TRAF2，根據(jù)其與NIK結(jié)合的能力顯著調(diào)節(jié)NF-κB的誘導(dǎo)。
在FAS-R和/或p55-R刺激之后，在參與細(xì)胞死亡和生存之間的平衡的上述調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)RIP似乎具有重要的作用。RIP(參見(jiàn)Stanger等人，1995和也參見(jiàn)Malinin等人1997)在其C末端區(qū)域的死亡區(qū)域，能夠以獨(dú)立的方式并且也通過(guò)與MORT-1，p55-R，F(xiàn)AS-R和TRADD的死亡區(qū)域的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。RIP在其N(xiāo)-末端區(qū)域和中間體區(qū)域也具有蛋白質(zhì)激酶區(qū)域，所述中間體區(qū)域據(jù)認(rèn)為能夠與TRAF2結(jié)合，從而參與NF-κB誘導(dǎo)。因此，涉及RIP的特性和序列(DNA和氨基酸)的詳細(xì)資料列出在上述公開(kāi)文獻(xiàn)中(特別是Stanger等人，1995)，引入本文作為參考。
TNF也是參與宿主抗病毒防御的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子之一，類(lèi)似地，已經(jīng)將病毒發(fā)展為表達(dá)其蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性的基因，和這些調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的病毒蛋白質(zhì)據(jù)認(rèn)為促進(jìn)動(dòng)物宿主內(nèi)的病毒的存在，這樣的蛋白質(zhì)的被研究得較透徹例子之一是來(lái)自于C組2和5型人腺病毒(Ad)的E3-14.7K，它具有TNF-介導(dǎo)的細(xì)胞溶解性的強(qiáng)拮抗劑。
對(duì)于分離TNF的信號(hào)形成級(jí)聯(lián)的分子成份的目的，所述的成份借助于病毒感染靶擊E3-14.7K，通過(guò)兩種雜交篩選最近分離了人類(lèi)E3-14.7K結(jié)合蛋白質(zhì)(對(duì)于FIP-2的14K相互作用蛋白質(zhì)，Li，Y.等人，1998)。發(fā)現(xiàn)FIP-2對(duì)其自身免疫毒性，并且逆轉(zhuǎn)對(duì)E3-14.7K細(xì)胞毒性的保護(hù)性作用，由TNFR-I或RIP的過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)的。發(fā)現(xiàn)FIP-2具有與RAP-2的一些同源性。RAP-2和FIP-2之間的總的相似形程度是相當(dāng)?shù)偷?，因?yàn)閺膬蓚€(gè)氨基酸序列的共用排列看到的(圖3)。但是在對(duì)著蛋白質(zhì)的C-末端的特異性區(qū)域同源性變得更顯著，最后的實(shí)際上的相同性是30C末端氨基酸。值得注目的是，除了上面提到的C-末端，F(xiàn)IP-2的推測(cè)的亮氨酸拉鏈基序在RAP-2中高度保守(不同的是Ile到Ala的替代)。
最近將編碼涉及亨廷頓(Huntington’s)疾病的蛋白質(zhì)的稱之為HYPL的類(lèi)似序列在GenBank登記，主題為“亨廷頓相互作用蛋白質(zhì)HYPL”(登記號(hào)AF049614)，所述的疾病似乎是與RAP-2遠(yuǎn)緣同源。但是，描述蛋白質(zhì)的功能的文獻(xiàn)還沒(méi)有公開(kāi)。
最近由Yamaoka S.等人(1998)公開(kāi)的報(bào)道了鼠RAP-2同源性的鑒別。通過(guò)關(guān)鍵詞的檢索鑒別了鼠的同源NEMO(對(duì)于NF-κB基本調(diào)節(jié)劑)，它調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)形成的活化。對(duì)HTLV-I Tax-轉(zhuǎn)化的大鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞變異體進(jìn)行定性，命名為5R，它對(duì)所有測(cè)試的NF-κB激活的刺激(LPS，PMA，IL-I，TNF)反應(yīng)遲鈍，并且執(zhí)行其遺傳互補(bǔ)作用。由于該程序，回收編碼NEMO 48kD蛋白質(zhì)的cDNA。基于該數(shù)據(jù)，據(jù)說(shuō)SR細(xì)胞缺乏該蛋白質(zhì)，并且它是高分子量IκB-激酶復(fù)合物的一部分，并且是其體外形成所需要的，NEMO可能與IKKβ同源二聚體化并且直接相互作用。
以色列第120485號(hào)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了RIP-關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，稱之為RAP，它特異性地結(jié)合到RIP并且抑制NF-κB誘導(dǎo)。
以色列第123758號(hào)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)和其涉及另一個(gè)稱之為RAP-2的RIP相關(guān)的蛋白質(zhì)，它具有相同或類(lèi)似的活性。
根據(jù)本發(fā)明RAP-2也稱之為303或RAP-303或RAT-303。對(duì)于一貫性理由在此稱之為RAP-2。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供新的蛋白質(zhì)RAP-2，包括所有異型，其類(lèi)似物片段或其衍生物能夠結(jié)合到RIP蛋白質(zhì)(下文稱為‘RIP’)。因?yàn)镽IP能夠直接或間接與炎癥，細(xì)胞的細(xì)胞毒性，細(xì)胞死亡的編碼介導(dǎo)劑相互作用例如p55-R和FAS-R，以及接合器或調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)例如MORT-1，TRADD，MACH，Mch4，G1和其它的相互作用，例如，通過(guò)結(jié)合到RIP本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)能夠影響通過(guò)將FAS配體結(jié)合到其受體和TNF結(jié)合到其受體(p55-R)啟動(dòng)的胞內(nèi)信號(hào)形成過(guò)程，并且本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)是p55-R和FAS-介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞的作用的調(diào)節(jié)劑。RIP也能夠與TRAF2相互作用并且從而能夠直接或間接與NIK的相互作用，這樣RIP具有參與NF-κB誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞存活途徑的調(diào)節(jié)劑。同樣，借助于FAS-R，p55-R和其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)MORT-1和TRADD通過(guò)結(jié)合到RIP或結(jié)合到RIP激活的TRAF2可以直接或間接誘導(dǎo)NF-κB和細(xì)胞存活，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以是借助于共同的或相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)形成途徑通過(guò)操作是細(xì)胞存活過(guò)程的介導(dǎo)劑，其中各種上述的蛋白質(zhì)操作以誘導(dǎo)細(xì)胞存活。類(lèi)似地，對(duì)于p75-R結(jié)合到與RIP結(jié)合的TRAF2，本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)也可以是RIP-相關(guān)的介導(dǎo)的p75-R介導(dǎo)的活性的調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是對(duì)上述新的RAP-2蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物，片段提供衍生物拮抗物(例如抗體，肽，有機(jī)化合物，或甚至其異型)，該拮抗物可用于抑制信號(hào)形成過(guò)程，或更具體地說(shuō)，如果需要包括炎性細(xì)胞細(xì)胞毒性，或細(xì)胞存活過(guò)程。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用上述新的RAP-2蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物，片段和衍生物，以分離和定性另外的蛋白質(zhì)或因子，它可能參與受體活性的調(diào)節(jié)，例如可結(jié)合到RAP-2蛋白質(zhì)并且影響其活性的其它蛋白質(zhì)和/或分離和鑒別新的蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段和衍生物結(jié)合到其上的在信號(hào)形成過(guò)程中上游或下游的其它受體，和因此它們也參與其功能。
本發(fā)明也提供了RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)，它能夠調(diào)節(jié)/介導(dǎo)RAP-2功能。
本發(fā)明的又一目的是提供了能夠?qū)氲郊?xì)胞與RAP-2和可能的RAP-2異型結(jié)合或相互作用的抑制劑，該抑制劑可以在細(xì)胞毒性過(guò)程中起抑制RIP-關(guān)聯(lián)的活性的作用，因此，如果需要，以加強(qiáng)細(xì)胞存活，或具有在細(xì)胞存活過(guò)程中抑制RIP-關(guān)聯(lián)的活性，因此如果需要，以加強(qiáng)細(xì)胞毒性。
而且，本發(fā)明的目的之一是使用上面提到的新的RAP-2蛋白質(zhì)，其異型和類(lèi)似物，片段和衍生物作為抗原片段以制備其多克隆抗體和/或單克隆抗體。該抗體依次可用于從不同的來(lái)源純化新的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞提取物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。
此外，這些抗體可用于診斷目的，例如用于鑒別涉及由p55-R，F(xiàn)AS-R或其它相關(guān)的受體介導(dǎo)的異常功能的紊亂。
本發(fā)明的再一目的是提供了藥物組合物，包括上述新的RAP-2蛋白質(zhì)，其異型或類(lèi)似物，片段或衍生物，以及包括上述抗體或其它拮抗劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)分離了新的蛋白質(zhì)RAP-2，RAP-2能夠結(jié)合到RIP或與RIP相互作用，并且因此它是RIP胞內(nèi)活性的調(diào)節(jié)劑或介導(dǎo)劑。RIP參與編碼信號(hào)形成調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)或介導(dǎo)，例如細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡相關(guān)的途徑，其中RIP本身具有細(xì)胞毒性和因此許多其它的細(xì)胞死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如MORT-1，TRADD，MACH，Mch4，G1，p55-R和FAS-R直接或間接結(jié)合。例如RIP以直接或間接的方式借助于存在于RI片段“死亡區(qū)域”基序/模塊和以所有前面所述的蛋白質(zhì)結(jié)合到或與其相關(guān)；是炎癥，細(xì)胞存活或成活性途徑的另一條途徑，其中RIP直接或間接借助于在RIP和RIP能夠結(jié)合到與NIK結(jié)合的TRAF2的激酶基序或區(qū)域可能具有活化作用，依次它們直接參與NF-κB的活化，其活化在炎性和細(xì)胞存活中起關(guān)鍵的作用。此外，p55-R能夠與TRADD和TRAF2(借助于TRADD)相互作用并且也對(duì)NF-κB的活化是重要的，從而在細(xì)胞存活途徑中，并且因此通過(guò)與FAS-R，TRADD和p55-R(借助于TRADD)以及TRAF2的結(jié)合或相互作用RIP也涉及通過(guò)這些蛋白質(zhì)炎癥的調(diào)節(jié)，細(xì)胞存活活化。因此，RIP是這些途徑的調(diào)節(jié)劑或介導(dǎo)劑，并且類(lèi)似地，通過(guò)結(jié)合到RIP本發(fā)明的新的RAP-2是這些胞內(nèi)途徑的調(diào)節(jié)劑或介導(dǎo)劑。
利用兩種雜交系統(tǒng)已經(jīng)分離和克隆了RAP-2，測(cè)序和定性，如下文所述的，RAP-2似乎是高度特異性RIP結(jié)合蛋白質(zhì)并且因此特異性的RIP調(diào)節(jié)劑/介導(dǎo)劑RAP-2不與TRADD，MORT-1，p55-R，p75-R和MACH結(jié)合。進(jìn)一步，似乎RAP-2不具有特征性的死亡區(qū)域模塊或基序，該結(jié)果與RAP-2對(duì)其本身不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的結(jié)果不一致。
如本文使用的，RIP活性意味著包括在炎癥和細(xì)胞死亡存活途徑中的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)。上文和下文以及上面提到的公開(kāi)文獻(xiàn)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中描述了這些活性，所有文獻(xiàn)全文被引入作為參考。類(lèi)似地，如本文使用的，RAP-2活性包括由于其與RIP的特異性結(jié)合而形成的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)RIP活性。由RAP-2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的RIP包括炎癥，細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活途徑的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)，如此RAP-2可以被視為以上提到的蛋白質(zhì)或可能涉及炎癥，細(xì)胞死亡和存活和RIP結(jié)合或以直接或間接方式相互作用的其它一些物質(zhì)的間接調(diào)節(jié)者和介導(dǎo)者。
本發(fā)明也公開(kāi)了能夠利用全長(zhǎng)RAP-2蛋白質(zhì)序列作為餌由兩個(gè)雜交篩選法鑒別的新的RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)。
在兩個(gè)雜交篩選法中應(yīng)用全長(zhǎng)RAP-2蛋白質(zhì)作為餌，新的RAP-2相互作用蛋白質(zhì)上文和下文表示克隆#10(或克隆#10-編碼的蛋白質(zhì)或RAT-結(jié)合蛋白質(zhì)#10或RBP-10)。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的共同的對(duì)5’末端的測(cè)序方法進(jìn)一步延伸所獲得的cDNA的序列，以重新構(gòu)建失去了起始密碼子的蛋白質(zhì)的部分開(kāi)放讀框。
克隆#10的結(jié)合的全部項(xiàng)目的兩種雜交測(cè)試表明該蛋白質(zhì)不僅與RAP-2結(jié)合，而且也顯示對(duì)TRAF2相當(dāng)強(qiáng)的親和性。但是克隆#10不與RIP，TRADD，MORT1，MACH，TNFR-1，TIP60和NIK以及幾個(gè)控制蛋白質(zhì)結(jié)合(例如lamin和cyclinD)但是胞內(nèi)排除在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的克隆#10與NIK的結(jié)合，考慮酵母中NIK行為的特性。證明克隆#10在后者的C-末端的200氨基酸內(nèi)結(jié)合RAP-2，即與RAP，TIP60，NIK和IKKβ結(jié)合不必須的區(qū)域。但是不準(zhǔn)確地該序列兩個(gè)使我們執(zhí)行幾輪GenBank檢索，目的在于鑒別克隆#10的同源性。已經(jīng)顯示與由克隆#10編碼的蛋白質(zhì)具有本質(zhì)上的相似性程度的唯一的蛋白質(zhì)是F40F12.5-來(lái)自于C.Elegans的推測(cè)的分子，其中沒(méi)有指派生理學(xué)作用。
有趣的是，發(fā)現(xiàn)F40F12.5與普遍存在的蛋白酶的高度保守家族的幾個(gè)成員一些相似性。這些酶反過(guò)來(lái)平衡普遍存在的機(jī)理的破壞性作用，已經(jīng)知道這種破壞作用在細(xì)胞中承擔(dān)大多數(shù)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)并的事件。而到處存在的連接酶負(fù)責(zé)將多聚樹(shù)狀物結(jié)合到預(yù)定的蛋白質(zhì)以進(jìn)行降解，到處存在的蛋白質(zhì)阻止生長(zhǎng)的樹(shù)狀物的有效的分枝?；谂c上面提到的到處存在的的相關(guān)蛋白酶的相似性對(duì)涉及F40F12.5功能的推測(cè)是有問(wèn)題的，至今沒(méi)有檢測(cè)是否特定的蛋白質(zhì)具有對(duì)到處存在的的聚合體的酶促活性。此外一對(duì)觀點(diǎn)不可能使得一致a)據(jù)信在到處存在的的蛋白酶的亞類(lèi)中的catalitic區(qū)域在F40F12.5，和克隆10中是不保守的；b)除了其催化位點(diǎn)，來(lái)源于到處存在的的蛋白酶家族的酶(從細(xì)菌到人)最終顯示沒(méi)有序列相似性，而F40F12.5和克隆10顯示一定程度的同源性。
因此，似乎RAP-2是特異性的RIP-結(jié)合蛋白質(zhì)并且因此RIP編碼活性的調(diào)節(jié)劑/介導(dǎo)劑。根據(jù)其結(jié)合RAP-2的能力RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)RIP有間接的影響并且也是RIP胞內(nèi)活性的調(diào)節(jié)劑/介導(dǎo)劑。
因此，由于RAP-2在調(diào)節(jié)/介導(dǎo)炎癥，細(xì)胞存活和/或細(xì)胞上文活性明顯具有作用，其中RIP直接或間接尤其是參與由各種刺激劑引起或誘導(dǎo)的哪些相關(guān)的細(xì)胞毒性和炎癥，所述刺激劑包括借助于TNF/NGF受體家族和其它可能的的受體轉(zhuǎn)移的哪些(對(duì)于RIP參與胞內(nèi)事件的方案和因此RAP-2參與，參見(jiàn)Malinin等人的

圖1，1997)。
RAP-2借助于以其它蛋白質(zhì)的復(fù)合物的部分存在的例如RIP和結(jié)合到RIP的蛋白質(zhì)也可用作為細(xì)胞毒性的抑制劑和炎癥的抑制劑，這樣它可以影響這些其它蛋白質(zhì)(例如p55-R，F(xiàn)AS-R，MACH，Mch4，G1和MORT-1)的細(xì)胞毒性或炎癥的作用，最終導(dǎo)致其細(xì)胞毒性或?qū)ρ装Y的活性的抑制。
RAP-2也可以用作為細(xì)胞毒性，炎癥的加強(qiáng)子或增強(qiáng)子，并且通過(guò)增強(qiáng)其它蛋白質(zhì)的活性，例如上文提到的RIP和結(jié)合到RIP的其它蛋白質(zhì)，有助于通過(guò)RIP回收這些蛋白質(zhì)，回收產(chǎn)物用于加強(qiáng)各種蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性或加強(qiáng)其炎性作用。
類(lèi)似地，本發(fā)明提供了編碼RIP相關(guān)的蛋白質(zhì)(RAP-2)，其異型，類(lèi)似物或片段的DNA序列能夠結(jié)合到RIP并且調(diào)節(jié)或介導(dǎo)RIP片段胞內(nèi)活性，所述的胞內(nèi)活性是炎性和/或細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)。
特別是，本發(fā)明提供了選自于下列組的DNA序列(a)來(lái)源于天然的RAP-2蛋白質(zhì)的編碼區(qū)的cDNA序列；(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)的序列雜交的并且編碼生物學(xué)活性的RAP-2蛋白質(zhì)的DNA序列；和(c)由于遺傳密碼簡(jiǎn)并為(a)和(b)中定義的DNA序列并且編碼生物學(xué)活性RAP-2蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明上文提到的DNA序列的另一個(gè)特異性實(shí)施方案是包括至少部分編碼至少部分一個(gè)異型的RAP-2蛋白質(zhì)的部分序列的DNA序列。上述DNA序列的另一個(gè)實(shí)施方案是編碼RAP-2蛋白質(zhì)的序列，如在圖1中描繪的。還有另一個(gè)實(shí)施方案是顯示于圖2的DNA序列。
本發(fā)明提供了RAP-2蛋白質(zhì)，和本發(fā)明所述的任何上述序列編碼的其類(lèi)似物，片段或衍生物，能夠結(jié)合到RIP和調(diào)節(jié)/介導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的生物學(xué)活性。
本發(fā)明的特異性實(shí)施方案是RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段或其衍生物。如從圖1和圖2推測(cè)的RAP-2蛋白質(zhì)序列顯示于圖3。另一個(gè)實(shí)施方案是任何RAP-2蛋白質(zhì)的異型，其類(lèi)似物，片段或衍生物。
本發(fā)明還提供了包括上述DNA的可重復(fù)表達(dá)的載體，這些可重復(fù)的表達(dá)載體能夠在合適的真核或原核宿主細(xì)胞中表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞含有這樣的可重復(fù)的表達(dá)載體；提供了在適合于所述蛋白質(zhì)，類(lèi)似物，片段或衍生物表達(dá)的條件下通過(guò)生長(zhǎng)這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)，或其類(lèi)似物，片段或衍生物的方法，實(shí)現(xiàn)所述的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯后修飾，如從所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基或從所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞提取物中獲得所述的蛋白質(zhì)和提取所述的表達(dá)蛋白質(zhì)，類(lèi)似物，片段或衍生物所需要的，上述定義結(jié)合用于包括RAP-2蛋白質(zhì)的所有異型。
另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了特異性于RAP-2蛋白質(zhì)的抗體或活性衍生物或片段，和本發(fā)明的類(lèi)似物，片段和衍生物。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面，提供了上述DNA或其編碼的蛋白質(zhì)的各種應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明其應(yīng)用包括如下所述(i)用于調(diào)節(jié)由蛋白質(zhì)RIP調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的胞內(nèi)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的調(diào)節(jié)的方法，包括以一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合到RAP-2蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物，片段或衍生物治療所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞的治療包括將所述的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物，片段或衍生物以適合于胞內(nèi)導(dǎo)入的方式導(dǎo)入到所述的細(xì)胞，或以攜帶所述序列的合適的載體將一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物，片段或衍生物導(dǎo)入到所述的細(xì)胞，所述的載體能夠以所述的序列在所述的細(xì)胞中表達(dá)的合適將所述的序列的插入在所述的細(xì)胞中有效起作用。
(ii)根據(jù)上述(i)所述，借助于RIP蛋白質(zhì)的作用，用于調(diào)節(jié)基于對(duì)細(xì)胞的作用由TNF家族的配體介導(dǎo)的炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的方法，其中所述的細(xì)胞的治療包括以適合于胞內(nèi)導(dǎo)入的方式將所述的RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物，片段或衍生物導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，或以適合于攜帶所述的序列的合適的載體的形式將編碼所述的G1蛋白質(zhì)，或異型，類(lèi)似物，片段或衍生物的DNA序列導(dǎo)入到所述的細(xì)胞，所述的載體能夠?qū)崿F(xiàn)所述的序列以所述的序列在所述的細(xì)胞作表達(dá)的形式插入到所述的細(xì)胞。
(iii)在上述(ii)的方法中，其中通過(guò)以重組動(dòng)物病毒載體轉(zhuǎn)染上述的細(xì)胞而治療所述的細(xì)胞，包括步驟(a)構(gòu)建攜帶編碼表達(dá)表面蛋白質(zhì)(配體)的序列和表面選自于RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物，片段和衍生物的第二個(gè)序列的重組動(dòng)物病毒載體，所述的表面蛋白質(zhì)能夠結(jié)合攜帶FAS-R和p55-R的細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞表面受體，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能夠調(diào)節(jié)/介導(dǎo)胞內(nèi)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑；和(b)以(a)所述的載體感染所述的細(xì)胞。
(iv)借助于RIP蛋白質(zhì)的作用通過(guò)TNF家族的配體介導(dǎo)的用于調(diào)節(jié)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活的方法，包括以本發(fā)明的抗體或活性片段或其衍生物治療所述的細(xì)胞，所述的治療是將合適的組合物應(yīng)用到所述的細(xì)胞，該組合物含有所述的抗體，活性片段或其衍生物，其中當(dāng)至少部分RAP-2蛋白質(zhì)與胞外表面接觸，所述的組合物配制為胞外應(yīng)用，當(dāng)所述的RAP-2蛋白質(zhì)完全是胞內(nèi)應(yīng)用時(shí)，所述的組合物配制為胞內(nèi)應(yīng)用。
(v)借助于RIP蛋白質(zhì)的作用通過(guò)TNF家族的配體介導(dǎo)的用于調(diào)節(jié)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活的方法，該方法包括以編碼本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)序列的至少部分的反義序列的寡聚核苷酸序列治療所述的細(xì)胞，所述的寡聚核苷酸序列能夠阻止RAP-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。
(vi)如上述(ii)用于治療腫瘤細(xì)胞或HIV感染的細(xì)胞或其它疾病細(xì)胞的方法，包括(a)構(gòu)建攜帶編碼病毒表面蛋白質(zhì)的序列和編碼選自于本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段和衍生物的蛋白質(zhì)的序列的重組動(dòng)物病毒載體，所述的表面蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到特異性的腫瘤細(xì)胞表面受體或HIV感染的細(xì)胞表面受體或由其它疾病細(xì)胞攜帶的受體，當(dāng)在所述的腫瘤中表達(dá)時(shí)，HIV感染的或其它疾病細(xì)胞能夠通過(guò)RIP蛋白質(zhì)的作用殺死所述的細(xì)胞；和(b)用(a)的載體感染所述的腫瘤或HIV感染的細(xì)胞或其它疾病細(xì)胞。
(vii)借助于RIP蛋白質(zhì)的作用通過(guò)TNF家族的配體介導(dǎo)的用于調(diào)節(jié)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活的方法，包括應(yīng)用核酶步驟，其中將表面能夠與編碼本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA序列相互作用的核酶序列的載體以在所述的細(xì)胞中允許所述的核酶序列表達(dá)的方式導(dǎo)入到所述的細(xì)胞，和其中所述的核酶序列在所述的細(xì)胞中表達(dá)，它與所述的細(xì)胞的mRNA序列相互作用并且裂解所述的mRNA序列導(dǎo)致所述的RAP-2蛋白質(zhì)在所述的細(xì)胞中的表達(dá)被抑制。
(viii)從本發(fā)明的所述的方法中選出的方法，其中所述的RAP-2蛋白質(zhì)編碼序列至少包括本發(fā)明的能夠結(jié)合RIP的RAP-2異型，其類(lèi)似物，片段和衍生物。
(ix)分離和鑒別本發(fā)明的能夠結(jié)合到RIP蛋白質(zhì)的方法，包括應(yīng)用酵母兩個(gè)雜交程序，其中編碼所述的RIP蛋白質(zhì)的序列由一個(gè)雜交載體攜帶，來(lái)自于cDNA或基因組DNA文庫(kù)的序列由第二個(gè)雜交載體攜帶，然后將載體用于轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，且陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞被分離，隨后通過(guò)提取所述的第二個(gè)雜交載體以獲得編碼結(jié)合到所述RIP蛋白質(zhì)上的蛋白質(zhì)的序列。
(x)根據(jù)上述(i)-(x)任一項(xiàng)所述的方法，其中RAP-2蛋白質(zhì)是RAP-2的異型，類(lèi)似物，片段和衍生物之一。
(xi)根據(jù)上述(i)-(x)任一項(xiàng)所述的方法，其中RAP-2蛋白質(zhì)或其任何的異型，類(lèi)似物，片段或衍生物參與由其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞的作用的調(diào)節(jié)，所述的RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物，片段或衍生物兩個(gè)直接或間接結(jié)合到介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)炎癥，借助于RIP蛋白質(zhì)的作用TNF家族對(duì)細(xì)胞的作用或如上所述的任何其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的作用介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的藥物組合物，包括作為活性成份的任何下列之一(i)本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)和生物學(xué)活性片段，類(lèi)似物，衍生物的混合物；(ii)編碼能夠結(jié)合細(xì)胞表面受體的蛋白質(zhì)和編碼本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性片段或其類(lèi)似物的重組動(dòng)物病毒載體；(iii)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)下列的反義下列的寡聚核苷酸下列，其中所述的寡聚核苷酸可能是上述(ii)的重組動(dòng)物病毒載體的第二序列。
本發(fā)明還提供了I.用于炎癥，由RIP蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的胞內(nèi)細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞成份途徑的或其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑，或其它NF-κB誘導(dǎo)劑或抑制劑對(duì)細(xì)胞的作用的調(diào)節(jié)的方法，包括以RAP-2蛋白質(zhì)，其異型，類(lèi)似物或片段或以編碼RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物或其片段的序列根據(jù)上述(i)-(x)的方法之一治療所述的細(xì)胞，所述的治療導(dǎo)致所述的RIP介導(dǎo)的作用的加強(qiáng)或抑制，從而也加強(qiáng)或抑制了FAS-R或p55-R-介導(dǎo)的作用，或所述的其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑，或其它NF-κB誘導(dǎo)劑或抑制劑的加強(qiáng)或抑制。
II.如上所述的方法，其中所述RAP-2蛋白質(zhì)，類(lèi)似物，片段或衍生物是RAP-2蛋白質(zhì)的一部分，它特異性地參與結(jié)合到RIP，或所述的其它誘導(dǎo)劑或介導(dǎo)劑，或其它NF-κB誘導(dǎo)劑或抑制劑，或所述的RAP-2蛋白質(zhì)序列編碼RAP-2蛋白質(zhì)的一部分，它特異性地參與RIP的結(jié)合，或所述的其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑其它NF-κB誘導(dǎo)劑或抑制劑。
III.如上所述的方法，其中所述的RAP-2蛋白質(zhì)是任何RAP-2異型之一，所述的異型能夠加強(qiáng)RIP-相關(guān)的作用。
IV.如上所述的方法，其中所述的RAP-2蛋白質(zhì)是任何RAP-2異型之一，所述的異型能夠抑制RIP-相關(guān)的作用，或其它或其它介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)對(duì)抗細(xì)胞的關(guān)聯(lián)作用和從而也能夠抑制對(duì)細(xì)胞的FAS-R-或p55-R-相關(guān)的作用，或其它細(xì)胞毒性介導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的作用。
V.如上所述的方法，其中所述的RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物，片段或衍生物能夠借助于直接或間接抑制NF-κB或直接或間接激活JNK或p38激酶加強(qiáng)或抑制對(duì)炎癥和細(xì)胞存活途徑。
可以采用用于分離和鑒別蛋白質(zhì)任何標(biāo)準(zhǔn)的篩選技術(shù)例如酵母雜交方法，親和層析方法和本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行RAP-2蛋白質(zhì)的分離，鑒定和定性。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在酵母兩個(gè)雜交篩選中將RAP-2蛋白質(zhì)本身，或其異型，片段或衍生物作為餌使蛋白質(zhì)結(jié)合其上。
結(jié)合到RAP-2，其異型，片段或衍生物的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的一部分。
也以下面的詳細(xì)描述的發(fā)明提供了本發(fā)明的其它方面和實(shí)施方案。
應(yīng)該注意到，在全文中使用的下列術(shù)語(yǔ)“RIP，和FAS-配體，或TNF對(duì)細(xì)胞的作用的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)”和任何其它的在說(shuō)明書(shū)中提到的“調(diào)節(jié)/介導(dǎo)”被認(rèn)為包括體外以及體內(nèi)的治療，另外也包括抑制或加強(qiáng)/增加。
附圖簡(jiǎn)述圖1(A，B)(SEQ ID NO1)顯示RAP-2的核苷酸序列，底下劃線為起始和終止密碼子。箭頭指示由兩個(gè)雜交篩選獲得的1.5Kb克隆的起始；圖2(A，B)(SEQ ID NO2)顯示克隆#41072(參見(jiàn)實(shí)施例1)的核苷酸序列，底下劃線為起始和終止密碼子。
圖3A(/1，/2)顯示人(20.4全長(zhǎng)和人shrt)和鼠(NEMO全長(zhǎng)和鼠部分)拼接RAP-2的變異體的推測(cè)的氨基酸序列和B(/1，/2)顯示利用在BCM Search Launcher(Baylor College of Medicine，Houston，TX)可獲得的軟件包裝盒排列的FIP-2的公開(kāi)的序列，盒子中的是同源的氨基酸，相同的氨基酸是灰色陰影。(B)中的星形表示FIP-2中的假設(shè)的亮氨酸-拉鏈(LZ)-類(lèi)似的基序。
圖4描述了RAP-2的分子特性。在人MTN印跡I(Clontech)與RAP-2的DNA片段的Northern印跡雜交中，在B中如在實(shí)施例3詳細(xì)描述的分析結(jié)合到RIP的RAP-2。在C中NIK-RAP-2的相互作用如在(B)中檢測(cè)，不同的是抗-FLAG抗體可用于Western印跡，隨后與抗-His6免疫測(cè)定。箭頭表示免疫測(cè)定的蛋白質(zhì)的位置。
圖5是通過(guò)實(shí)施例4中描述的RAP-2的異位的表達(dá)，由各種刺激激活的NF-κB和c-Jun的被動(dòng)下調(diào)的代表圖。用報(bào)道質(zhì)粒(對(duì)于NF-κB(A)是HIVLTR-Luc或CMV-Luc，對(duì)于c-Jun(B)活性測(cè)試是GAL4-Luc)，和對(duì)于指示的誘導(dǎo)劑的表達(dá)載體和空載體(在附圖中僅僅標(biāo)記為pcDNA3)或編碼全長(zhǎng)RAP-2的質(zhì)粒(在附圖中標(biāo)記為pcRAP-2-)臨時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，表達(dá)基因螢蟲(chóng)素酶的活化以相對(duì)的螢蟲(chóng)素酶單位(R.L.U.)表示。
圖6表示在寬的濃度范圍內(nèi)RAP-2對(duì)NF-κB和c-Jun顯示類(lèi)似的抑制行為。TRAF2與各種指示的量的pcRAP-2(有義)或pcRAP-2-a/s(反義)構(gòu)建體在HEK-293T細(xì)胞中臨時(shí)表達(dá)。為了評(píng)價(jià)NF-κB(A)和c-Jun(B)的激活，分別誘導(dǎo)pHIVLTR-Luc和pGAL4-Luc報(bào)道質(zhì)粒。實(shí)施例4的圖5描述了螢蟲(chóng)素酶的測(cè)試。
圖7顯示RAP-2強(qiáng)力地加強(qiáng)信號(hào)誘導(dǎo)的c-Jun的磷酸化作用，沒(méi)有干擾JNK1/2的激活水平。
(A)采用Western印跡分析方法用實(shí)施例5描述的磷-Jun抗體鑒別以指示的表達(dá)構(gòu)建體和在附圖中由負(fù)的標(biāo)記(-)表示的pcDNA3-載體和附圖中由加號(hào)(+)表示的pcRAP-2一起轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞總的細(xì)胞裂解液，在較低的泳道上顯示的對(duì)照膜用抗總的c-Jun Abs(NEB)預(yù)探測(cè)，(B)以實(shí)施例5詳細(xì)描述的抗磷-JNK的Abs，對(duì)總的裂解液進(jìn)行Western印跡分析，檢測(cè)來(lái)自于以pcDNA3或pcRAP-2轉(zhuǎn)染的和以hrTNFα治療以便增長(zhǎng)時(shí)間的HEK-293T細(xì)胞的活化的JNK1/2。
(C)將HA-JNK1表達(dá)質(zhì)粒與空載體，pcRAP-2和pcRIP各種組合共轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞，借助于其N(xiāo)-末端HA-標(biāo)簽進(jìn)行免疫測(cè)定，在體外激酶測(cè)試中測(cè)定細(xì)菌磷酸化純化的GST-Jun的能力。通過(guò)SDS-PAGE分析反應(yīng)產(chǎn)物。由箭頭標(biāo)記GST-Jun。
圖8顯示RAP-2不與NF-κB和AP-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到DNA。以單獨(dú)的指示的蛋白質(zhì)(-)或與pcRAP-2(+)一起轉(zhuǎn)染HEK-293T。將從細(xì)胞制備的核提取物與32P標(biāo)記的寡聚核苷酸共培養(yǎng)，所述的寡聚核苷酸包括對(duì)AP-1(A)或NF-κB(B)的經(jīng)典的識(shí)別序列。通過(guò)非變性的PAGE分析反應(yīng)產(chǎn)物。
圖9顯示RAP-2影響以可變量的RAP-2(有義)或RAP-2-反義(a/s)臨時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK-293T和HeLa細(xì)胞的NF-κB的基礎(chǔ)水平。如實(shí)施例4的圖6描述進(jìn)行所有的操作。
圖10(A，B)(SEQ ID NO3)顯示克隆#10的部分核苷酸序列。
圖11顯示系列的缺失的RAP-2的功能特性。在A中，圖示RAP-2的連續(xù)的C-末端缺失，所有的截?cái)嘈问焦蚕硗暾腞AP-2N-末端，而它們的C-末端由箭頭表示。底下劃線為RIP，NIK，IKKβ和TIP60結(jié)合區(qū)域。三個(gè)艙口方框與推測(cè)的亮氨酸-拉鏈類(lèi)似的基序?qū)?yīng)。B顯示利用NF-κB的HIV-LTR螢蟲(chóng)素酶報(bào)道質(zhì)粒，在A中描述的缺失構(gòu)建體的過(guò)量表達(dá)對(duì)由RelA，TRAF2TNF和NIK對(duì)HEK-293T細(xì)胞的NF-κB活化的作用。報(bào)道基因螢蟲(chóng)素酶活性的激活以相對(duì)的螢蟲(chóng)素酶單位(R.L.U.)表示。
圖12顯示RAP-2功能和結(jié)合區(qū)域的物理結(jié)構(gòu)圖。
(A)測(cè)試各種缺失的RAP-2與轉(zhuǎn)染的酵母(奇數(shù)列)和哺乳動(dòng)物HEK-293T細(xì)胞(偶數(shù)列)中的指示的蛋白質(zhì)的結(jié)合的能力。兩個(gè)最右邊的列顯示在如實(shí)施例9描述的以高量將相同缺失轉(zhuǎn)染到HEK-293T的能力，以抑制NF-κB活化和啟動(dòng)對(duì)TNF-α治療應(yīng)答的c-Jun高度磷酸化(c-Jun)。交叉的鮮明度與給定的作用的強(qiáng)度成比例。星形表示標(biāo)記的構(gòu)建體對(duì)Rel-A刺激的觀察到的作用是不同的[參見(jiàn)圖11(B)]。
(B)代表從缺失分析推斷RAP-2的結(jié)合(上部)和功能性(底部)區(qū)域的位置顯示于(A)，僅對(duì)蛋白質(zhì)的骨架進(jìn)行排列。艙口部分指示相應(yīng)的基本區(qū)域的邊界的可能的位置。
圖13顯示RAP-2的ser-148對(duì)于誘導(dǎo)ser-63的c-Jun高度磷酸化是必要的。
顯示了Western印跡，其中wt是指野生型，S148A是指148位的ser被丙氨酸替代，和該載體是空的對(duì)照載體。
發(fā)明詳述一方面本發(fā)明涉及新的蛋白質(zhì)RAP-2，它能夠結(jié)合到RIP蛋白質(zhì)，從而能夠特異性介導(dǎo)或調(diào)節(jié)RIP的比例活性，而RIP參與上文詳細(xì)描述的炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的調(diào)節(jié)或介導(dǎo)。因此RAP-2可以加強(qiáng)炎癥，細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞存活途徑的RIP活性，或可以加強(qiáng)這些途徑之一的RIP活性，而另一方面抑制它。
更具體地說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明，提供了新的蛋白質(zhì)RAP-2。已經(jīng)對(duì)RAP-2進(jìn)行測(cè)序和定性，發(fā)現(xiàn)RAP-2是具有對(duì)RIP的高度特異性的RIP-結(jié)合蛋白質(zhì)，但是沒(méi)有顯示與許多已知參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)形成途徑的蛋白質(zhì)的結(jié)合，導(dǎo)致產(chǎn)生炎癥，細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活。RAP-2也明顯與在這些途徑中具有活性的蛋白質(zhì)沒(méi)有共同的區(qū)域，即RAP-2沒(méi)有“死亡區(qū)域”基序或模塊，它不具有激酶基序或區(qū)域并且不具有蛋白酶區(qū)域或基序。所測(cè)定的RAP-2序列也是獨(dú)特的序列，如從與許多數(shù)據(jù)庫(kù)包括Genebank，人基因組水平1，‘dbest’數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的序列比較。如上文詳細(xì)描述的(也參照所有出版物和如上所述的專(zhuān)利申請(qǐng))RIP參與細(xì)胞內(nèi)的炎癥，細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活途徑。因此，RIP活性的調(diào)節(jié)或控制能夠調(diào)節(jié)這些途徑之一或所有的途徑，當(dāng)通過(guò)例如將TNF或Fas-配體結(jié)合到其受體時(shí)啟動(dòng)這樣的途徑(特別是TNF，p55-R)。RIP可以在測(cè)定該途徑活化到最大程度起著關(guān)鍵的作用，借助于其結(jié)合許多具有死亡區(qū)域的細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)的能力和也結(jié)合許多具有激酶活性的能力。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如特異性地結(jié)合到RIP的RAP-2蛋白質(zhì)可能在調(diào)節(jié)RIP活性中起著重要的作用，從而與其它相比調(diào)節(jié)到誘導(dǎo)一個(gè)途徑的程度。因此，本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)代表重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑或介導(dǎo)劑。
除了本發(fā)明的RAP-2全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，將較短的cDNA克隆，發(fā)現(xiàn)是由來(lái)源于幾個(gè)遠(yuǎn)緣的“全長(zhǎng)”cDNA區(qū)域的序列“阻塞”，明顯產(chǎn)生相同基因的拼接。通過(guò)研究ESTs集合鑒別人RAP-2的鼠的對(duì)應(yīng)體。
進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)染的HEK-293T和HeLa細(xì)胞中RIP-RAP-2相互作用的生理學(xué)相關(guān)性。但是這樣的復(fù)合物的形成不導(dǎo)致RIP酶促活性，如通過(guò)過(guò)量表達(dá)的RIP沒(méi)有磷酸化RAP-2證明的。
在哺乳動(dòng)物HEK-293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也導(dǎo)致RAP-2-NIK復(fù)合物的穩(wěn)定形成。
RAP-2似乎是NF-κB和c-Jun信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵元件，由于它結(jié)合到NIK，IKKβ和TIP60(組蛋白?；D(zhuǎn)移酶)和調(diào)節(jié)NF-κB和c-Jun依賴性轉(zhuǎn)錄。事實(shí)上，加強(qiáng)的RAP-2異位的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)NF-κB應(yīng)答的抑制，而借助于反義構(gòu)建體從細(xì)胞中缺失導(dǎo)致加強(qiáng)的NF-κB和c-Jun反式激活。
也發(fā)現(xiàn)RAP-2啟動(dòng)c-Jun高度磷酸化，沒(méi)有被JNK的活性介導(dǎo)。RAP-2不抑制c-Jun和RelA結(jié)合到DNA。通過(guò)依次缺失分析鑒別了RAP-2的結(jié)合和功能性區(qū)域，這些研究已經(jīng)指明RIP，NIK和TIP60的結(jié)合區(qū)域重疊并且發(fā)現(xiàn)在RAP-2的氨基酸95-264內(nèi)。但是發(fā)現(xiàn)由RAP-2介導(dǎo)的下游功能作用以將蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)域包括氨基酸1-264定位。
根據(jù)上述RAP-2似乎是應(yīng)力應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的信號(hào)減弱電路的決定性的元件有義編碼的構(gòu)建體的異位的表達(dá)抑制應(yīng)答，而反義編碼構(gòu)建體的表達(dá)加強(qiáng)應(yīng)答。事實(shí)上，在發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室也已知RAP-2為RAT(減弱的RIP′s)，并且因此在本文中認(rèn)為是RAT和/或RAT-303和/或克隆303。
多個(gè)拼接變異體的存在指示至少部分在給定的條件下RAP-2的最終的作用似乎取決于序列阻塞塊的存在，它對(duì)于普遍的異型的蛋白質(zhì)的結(jié)合/靶擊/轉(zhuǎn)導(dǎo)/修飾是必要的。例如如果將RAP-2結(jié)合到TIP60，允許前者的核的定位，假設(shè)具有拼接的核定位信號(hào)的(NL S)的RAP-2變異體可以是在NF-κB/AP-1的抑制中缺陷或相反過(guò)度地活化。序列分析顯示RAP-2攜帶已知的NLSs的大多數(shù)的陽(yáng)性電荷的幾個(gè)簇(E，K和R)特性。
已構(gòu)建了結(jié)合到RIP的RAP-2的物理圖譜到RAP-2區(qū)域，上述的蛋白質(zhì)起始于177-218氨基酸和末端在264位。RAP-2內(nèi)的RIP結(jié)合區(qū)域沒(méi)有與IKKβ也沒(méi)有與NIK結(jié)合位點(diǎn)重疊。
結(jié)合到TIP60，許多核蛋白質(zhì)的家族稱之為組蛋白?；D(zhuǎn)移酶，明顯該圖譜在該區(qū)域橫跨氨基酸95-264內(nèi)。發(fā)現(xiàn)參與同源-二聚體的區(qū)域定位于氨基酸217-264之間。
累積的資料暗示所有的RAP-2的功能性作用(命名為NF-kB的抑制和誘導(dǎo)c-Jun高度磷酸化)的圖譜為相同區(qū)域。
由克隆#10編碼的蛋白質(zhì)明顯在氨基酸218-309之間起始的并且在氨基酸416位區(qū)域內(nèi)結(jié)合，因此其結(jié)合位點(diǎn)可以包括與RIP，NIK，IKKβ和TIP60結(jié)合位點(diǎn)的重疊區(qū)域。
此外，由所有誘導(dǎo)劑足于有效地調(diào)節(jié)信號(hào)形成的區(qū)域定位到該蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)段。
由氨基酸95-416包括的區(qū)域有作用，雖然它明顯較弱，與由全長(zhǎng)蛋白質(zhì)引起的情況的比較，因此由內(nèi)源的RAP-2的加強(qiáng)的聚合產(chǎn)生的。
此外，除了RelA，在我們的實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的所有作用通過(guò)小至100個(gè)RAP-2的N-末端氨基酸介導(dǎo)的，事實(shí)上包括1-102個(gè)氨基酸的片段介導(dǎo)不同的作用，盡管相當(dāng)溫和。
另一方面，ReIA-介導(dǎo)的作用的抑制需要更長(zhǎng)的部分的RAP-2。至今為止，我們定義了在氨基酸1-264區(qū)域內(nèi)的邊界，它明顯授與氨基酸157和264之間的區(qū)域具有一些特異性，RelA-相關(guān)的結(jié)合特性。
根據(jù)上面的觀點(diǎn)，似乎a.除了ReIA，RAP-2結(jié)合RIP，克隆#10和最有可能的NIK和TIP60對(duì)于該蛋白質(zhì)的功能不需要，如過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)的NF-κB的抑制劑。
b.顯然RAP-2對(duì)RelA過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)的激活的作用至少部分被不同的結(jié)合事件介導(dǎo)，基本上，發(fā)現(xiàn)上面提到的蛋白質(zhì)有助于給定的活性，如從目前進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)推測(cè)。
由于FAS-R和TNF受體引起死亡的獨(dú)特的能力，以及TNF受體攻擊各種其它組織損毀活性的能力，這些受體功能的異常對(duì)生物體特別有害。的確，已經(jīng)證明這些受體的過(guò)量和缺陷功能有助于各種疾病的生理學(xué)表現(xiàn)。參與這些受體的信號(hào)形成活性的分子的鑒別和調(diào)節(jié)這些分子的功能的方式的發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成了對(duì)這些疾病的新的治療途徑的潛在的線索。考慮RIP在FAS-R和p55-R毒性中的疑存在的重要作用，因此借助于RIP的調(diào)節(jié)RAP-2對(duì)FAS-R和TNF疑存在重要的調(diào)節(jié)作用，設(shè)計(jì)可能在其中RAP-2有助于加強(qiáng)RIP介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的條件下，借助于阻止RAP-2結(jié)合到RIP或抑制RAP-2和RIP之間的相互作用可以阻止RIP的毒性功能的藥物(如上所述RIP對(duì)其本身和與具有死亡區(qū)域的其它蛋白質(zhì)具有細(xì)胞毒性)。
同樣，還已知(如上所述)FAS-R和p55-R參與NF-κB的激活，并且從而參與細(xì)胞存活的激活。因此，當(dāng)需要?dú)⑺兰?xì)胞時(shí)，例如癌癥細(xì)胞，HIV感染的細(xì)胞等，加強(qiáng)FAS-R和p55-R的細(xì)胞毒性作用是令人滿意的(和它們相關(guān)的蛋白質(zhì)例如MORT-1，MACH，Mch4，G1，TRADD)，而在相同時(shí)間已知其誘導(dǎo)NF-κB的能力。因此，當(dāng)RAP-2與RIP相互作用或結(jié)合導(dǎo)致在加強(qiáng)NF-κB的誘導(dǎo)中增強(qiáng)RIP的可能的作用(借助于TRAF2和借助于激酶區(qū)域和/或RIP的中間體區(qū)域)，然后阻止RAP-2和RIP之間的相互作用以抑制，或至少阻止NF-κB激活的增強(qiáng)，從而轉(zhuǎn)移TNF-或FAS-配體-誘導(dǎo)的作用與細(xì)胞毒性的側(cè)面的平衡以最大程度地提供增加的細(xì)胞死亡。
類(lèi)似地，對(duì)于相反的情況下(與上文提到的情況相反)，RAP-2與RIP的激活事實(shí)上導(dǎo)致對(duì)FAS-R和p55-R炎癥或細(xì)胞毒性作用的抑制，例如抑制，各種自體免疫疾病等，當(dāng)認(rèn)為增加的細(xì)胞存活，然后設(shè)計(jì)加強(qiáng)RAP-2和RIP之間的相互作用以增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞死亡的總體抑制和轉(zhuǎn)移細(xì)胞存活之間的平衡。也根據(jù)上面提到的RAP-2′s與RIP的相互作用導(dǎo)致在加強(qiáng)NF-κB激活中的RIP′s功能的抑制，然后當(dāng)需要細(xì)胞存活時(shí)，阻止RAP-2和RIP的相互作用，從而加強(qiáng)NF-κB激活中的RIP′s活性是必要的。
考慮上文提到的，它產(chǎn)生了RIP在炎癥，細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活途徑的誘導(dǎo)或介導(dǎo)之間的平衡具有關(guān)鍵的作用，因此RAP-2由于是RIP的調(diào)節(jié)劑具有等同的重要作用。利用上、下文提到的各種藥物或治療影響RAP-2-RIP相互作用/結(jié)合，可允許通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳輸途徑將死細(xì)胞轉(zhuǎn)移成活細(xì)胞，反之亦然。
本發(fā)明也涉及編碼RAP-2蛋白質(zhì)的DNA序列和由該DNA序列編碼的RAP-2蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼RAP-2蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性類(lèi)似物，片段和衍生物，其類(lèi)似物和衍生物的DNA序列。參與標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以制備這樣的類(lèi)似物，片段和衍生物(參見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989)，其中可以缺失，疊加或由另一個(gè)密碼子替代編碼RAP-2蛋白質(zhì)的DNA序列中的一個(gè)或多個(gè)密碼子，以產(chǎn)生具有至少與天然蛋白質(zhì)相比具有一個(gè)氨基酸殘基變化。
可編的RAP-2蛋白質(zhì)，異型，類(lèi)似物，片段或衍生物的上述DNA序列包括能夠與來(lái)源于天然的RAP-2蛋白質(zhì)的編碼區(qū)的cDNA雜交的DNA，其中這樣的雜交是在適度地、嚴(yán)格地條件下進(jìn)行的，和可雜交的DNA序列編碼生物學(xué)活性的RAP-2蛋白質(zhì)。因此這些雜交的DNA序列包括與天然的RAP-2cDNA序列具有高度的同源性，代表了RAP-2類(lèi)似的序列，例如可以是編碼各種RAP-2異型的天然衍生的序列，或編碼屬于一組RAP-2類(lèi)似的序列編碼的具有RAP-2活性的蛋白質(zhì)的天然存在序列。進(jìn)一步，例如這些序列也可以包括非天然存在的，合成產(chǎn)生的序列，它們與天然的RAP-2cDNA序列類(lèi)似，但是包含許多需要的修飾。這樣的合成序列包括所有可能的編碼RAP-2的類(lèi)似物、片段和衍生物的序列，所有這些均具有RAP-2活性。
為了獲得上面所述的天然存在的RAP-2類(lèi)似的序列，可以利用天然RAP-2cDNA或其部分作為探針篩選和分離來(lái)自于各種組織的天然衍生DNA或RNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)程序(參見(jiàn)Sambrook等人，1989列出的標(biāo)準(zhǔn)程序)。
同樣，為了制備上面提到的編碼RAP-2的類(lèi)似物，片段或衍生物的各種合成的RAP-2類(lèi)似的序列，可以使用下文詳細(xì)描述的關(guān)于類(lèi)似物、片段和衍生物的制備的許多標(biāo)準(zhǔn)程序。
“基本上對(duì)應(yīng)于”RAP-2蛋白質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)不僅包括RAP-2蛋白質(zhì)而且包括是RAP-2類(lèi)似物的多肽或蛋白質(zhì)。
基本上對(duì)應(yīng)于RAP-2蛋白質(zhì)的多肽是那些多肽，其中一個(gè)或多個(gè)RAP-2蛋白質(zhì)的氨基酸已經(jīng)被另一個(gè)氨基酸替代，去除和/或插入，條件是獲得的蛋白質(zhì)基本上顯示與其對(duì)應(yīng)的RAP-2蛋白質(zhì)相同或有較高的生物學(xué)活性。
為了基本上對(duì)應(yīng)于RAP-2蛋白質(zhì)，通常RAP-2蛋白質(zhì)的序列中的變化例如異型相對(duì)較少。雖然變化的量可以多于10，優(yōu)選地不多于10個(gè)變化，更優(yōu)選地不多于5個(gè)變化，最優(yōu)選地不多于三個(gè)這樣的變化，當(dāng)將任何技術(shù)用于尋找基本上對(duì)應(yīng)于RAP-2蛋白質(zhì)的潛在的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)，一種這樣的技術(shù)是應(yīng)用在編碼蛋白質(zhì)DNA上的常規(guī)的誘變技術(shù)，導(dǎo)致產(chǎn)生幾個(gè)修飾。篩選這樣的克隆表達(dá)的蛋白質(zhì)以結(jié)合到RIP上并調(diào)節(jié)如上所述的RIP對(duì)調(diào)節(jié)/介導(dǎo)胞內(nèi)途徑的活性的能力。
“保守的”變化是預(yù)期不會(huì)改變蛋白質(zhì)的活性并且通常首先被篩選到的那些變化，因?yàn)轭A(yù)期這些變化不會(huì)基本上改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的大小、電荷或構(gòu)型，因此預(yù)期不會(huì)改變其生物學(xué)特性。
RAP-2蛋白質(zhì)的保守的替代包括類(lèi)似物，其中多肽的至少一個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被一個(gè)不同的氨基酸保守地替代了。優(yōu)選地根據(jù)下面在表IA列出的這樣的替代，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以測(cè)定這樣的替代以提供修飾的結(jié)構(gòu)和功能特性的合成的多肽分子，而保持RAP-2的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
表IA原始的殘基 典型的替代AlaGly；SerArg LysAsn Gln；HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly Ala；ProHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；Tyr；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu或者，RAP-2蛋白質(zhì)的另一組的替代是其中至少已經(jīng)去除了多肽中的一個(gè)氨基酸殘基并且根據(jù)下面的表IB在其位置插入不同的殘基。在多肽中制備的替代的類(lèi)型可以是基于不同的種的同源性蛋白質(zhì)之間的氨基酸變化的頻率的分析，例如Schulz等人，G.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原則，Springer-Verlag，NewYork，NY，1798，和Creighton，T.E.的圖3至圖9結(jié)構(gòu)和分子特性，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，CA 1983的表1-2中列出的那些?；谶@樣的分析，本文將另一種保守的替代定義為下面的5組之一內(nèi)的交換表IB1.小的脂肪族的，非極性的或稍微極性的殘基Ala，Ser，Thr(Pro，Gly)；2.極性的帶負(fù)電的殘基和其氨化物Asp，Asn，Glu，Gln；3.極性的，帶正電的殘基His，Arg，Lys；4.大的脂肪族的非極性的殘基Met，Leu，Ile，Val(Cys)；和5.大的芳香的殘基Phe，Tyr，Trp。
上述括號(hào)中的三個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)的體系結(jié)構(gòu)中具有特異性的作用。Gly是唯一的失去側(cè)鏈的殘基并且因此給予鏈靈活性。但是這趨向于促進(jìn)第二結(jié)構(gòu)的形成而不是a-螺旋狀的。由于其異常的幾何結(jié)構(gòu)，故可緊緊地夾住該鏈并且通常趨向于促進(jìn)β-圈-類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，雖然在某些情況下Cys能夠參與二硫鍵的形成，它對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊是重要的。注意上文Schulz等人合并組1和2。還應(yīng)該注意由于Tyr結(jié)合氫的潛力，故其與Ser和Thr等具有明顯的家族關(guān)系。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知例如上面所述的本發(fā)明的保守的氨基酸的替代，并且預(yù)期在氨基酸替代之后保持該多肽的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)上的特性。本發(fā)明的大多數(shù)的缺失和替代是那些在蛋白質(zhì)或多肽分子中的特性沒(méi)有產(chǎn)生基團(tuán)的變化。將“特性”定義為以非排除性的方式改變第二結(jié)構(gòu)，例如a-螺旋或β-片狀的變化，以及在生物學(xué)活性中的變化，例如結(jié)合到RIP和/或RIP的介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞死亡的影響。
在蛋白質(zhì)中生產(chǎn)氨基酸替代的例子，在可用于獲得本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的類(lèi)似物，該方法的步驟是已知的，例如美國(guó)專(zhuān)利Mark等人的RE 33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111；和Lee等人的5,017,691中列出的和美國(guó)第4,904,584號(hào)專(zhuān)利(Shaw等人)中列出的賴氨酸替代的蛋白質(zhì)。
另外，上文討論的保守替代不能明顯改變RAP-2蛋白質(zhì)的活性，無(wú)論是保守的替代還是較少的保守和更多的隨機(jī)變化，都可導(dǎo)致RAP-2蛋白質(zhì)的類(lèi)似物的生物學(xué)活性增加。
當(dāng)確認(rèn)替代或缺失的準(zhǔn)確效果時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過(guò)常規(guī)的結(jié)合和細(xì)胞死亡測(cè)試可估算替代，缺失等的作用。利用這樣的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試篩選不能涉及過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。
可接受的RAP-2類(lèi)似物是至少保留結(jié)合到RIP的能力的類(lèi)似物，即，如上所述介導(dǎo)RIP在細(xì)胞內(nèi)途徑中的能力的類(lèi)似物。以這樣的方式，可以產(chǎn)生具有所謂的主要的負(fù)作用的類(lèi)似物，稱之為不能結(jié)合到RIP或在隨后的信號(hào)形成或結(jié)合之后的其它活性的缺陷。例如可以將這樣的類(lèi)似物用于抑制RIP的作用，或抑制NF-κB對(duì)RIP的誘導(dǎo)(直接或間接)作用，這取決于這些活性是通過(guò)RAP-2和RIP的相互作用轉(zhuǎn)換的(參見(jiàn)上文)，并且通過(guò)這樣的類(lèi)似物與天然的RAP-2與RIP的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。
在遺傳水平上，這些類(lèi)似物通常是通過(guò)在編碼RAP-2蛋白質(zhì)的DNA中的核苷酸的位點(diǎn)特異性誘變制備的，從而產(chǎn)生編碼該類(lèi)似物的DNA，并且之后合成DNA和在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)多肽。通常該類(lèi)似物顯示與天然存在的蛋白質(zhì)相同或增加的良好的生物學(xué)活性，Ausubel等人，分子生物學(xué)目前的方案，Greene出版社和Wiley Interscience，NewYork，NY，1987-1995；Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY，1989。
本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的制備，或編碼相同多肽的交替的核苷酸序列，不同于天然的序列，因?yàn)檫z傳密碼的已知的簡(jiǎn)并允許改變，本發(fā)明的序列可以通過(guò)編碼較早制備的類(lèi)似物或天然形式的RAP-2蛋白質(zhì)的DNA的位點(diǎn)特異性誘變獲得。位點(diǎn)特異性誘變?cè)试S通過(guò)利用編碼需要的突變體的DNA序列的特異性的核苷酸序列，以及足夠量的鄰接的核苷酸制備該類(lèi)似物，以提供足夠大小的引物的序列并且序列的互補(bǔ)性，以在橫斷的缺失的交叉點(diǎn)的兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙螺旋。通常，優(yōu)選的引物長(zhǎng)度為20到25個(gè)核苷酸，被改變的序列的各側(cè)有5到10個(gè)互補(bǔ)的核苷酸。通常，位點(diǎn)特異性誘變是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的，如Adelman等人，DNA2183(1983)出版物例舉的，其公開(kāi)的內(nèi)容引入本文作為參考。
將會(huì)認(rèn)識(shí)到，通常位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)利用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于位點(diǎn)特異性誘變的典型的載體包括例如M 13噬菌體載體，例如由Messing等人公開(kāi)的，第三次Cleveland關(guān)于大分子和重組DNA的年會(huì)，編輯A.Walton，Elsevier，Amsterdam(1981)，其公開(kāi)例如引入本文作為參考。這些噬菌體易于通過(guò)商業(yè)途徑獲得，通常其用途是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的。或者，可以使用含有復(fù)制的單鏈?zhǔn)删w原點(diǎn)的質(zhì)粒載體(Veira等人，酶學(xué)方法1533，1987)以獲得單鏈DNA。
本文描述的位點(diǎn)特異性誘變通過(guò)下面所述獲得首先獲得其序列內(nèi)包括相關(guān)的多肽的DNA序列的單鏈載體。攜帶需要的突變的序列的寡聚核苷酸通過(guò)自動(dòng)的DNA寡聚核苷酸合成制備。然后將這些引物用單鏈蛋白質(zhì)-序列-含有序列的載體退火，并且與DNA聚合酶例如電傳機(jī)聚合酶I Klenow片段接觸，完成攜帶突變的鏈的合成。因此突變的序列和第二鏈攜帶需要的突變。然后將該異源雙螺旋用于轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，例如大腸桿菌JM101細(xì)胞，和選擇包括攜帶突變的序列的排列的重組載體在選擇這樣的克隆之后，可以去除突變的RAP-2蛋白質(zhì)序列并且置于合適的載體，通?？捎糜谵D(zhuǎn)染合適的宿主的類(lèi)型的轉(zhuǎn)移或表達(dá)載體。
因此，使用已知的DNA或RNA擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR和化學(xué)寡聚核苷酸合成也可以體外和/或體內(nèi)檢測(cè)，獲得和/或修飾編碼RAP-2的蛋白質(zhì)的基因或核苷酸。PCR允許由重復(fù)的DNA聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增(數(shù)目增加)特異性的DNA序列。該反應(yīng)可用作為克隆的替代；所有這些是了解核酸序列所需要的。為了實(shí)施PCR，設(shè)計(jì)與需要的序列互補(bǔ)的引物。然后通過(guò)自動(dòng)的DNA合成產(chǎn)生該引物。由于可以設(shè)計(jì)引物以雜交到該基因的任何部分，創(chuàng)造條件以便可以忍受互補(bǔ)堿基對(duì)的錯(cuò)配。這些錯(cuò)配的區(qū)域的擴(kuò)增導(dǎo)致誘變產(chǎn)物的合成，引起具有新的特性的肽的產(chǎn)生(即位點(diǎn)特異性誘變)。也參見(jiàn)Ausubel，見(jiàn)上文，第16章。也通過(guò)偶合互補(bǔ)的DNA(cDNA)的合成利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行PCR，將RNA用作為合成促乳素(prolactin)受體的胞外區(qū)域的合成的起始材料，沒(méi)有克隆。
此外，設(shè)計(jì)PCR引物以摻入新的限制性位點(diǎn)或其它特性，例如在待擴(kuò)增的基因片段末端的終止密碼子。擴(kuò)增的基因序列的5’和3’末端的限制性位點(diǎn)的替代允許編碼RAP-2蛋白質(zhì)或其片段的基因序列，習(xí)慣用于鄰接載體中的其它序列和/或克隆位點(diǎn)。
PCR和RNA和/或DNA擴(kuò)增的其它方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的，并且基于本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)可用于本發(fā)明，不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。DNA或RNA擴(kuò)增的已知的方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和相關(guān)的擴(kuò)增過(guò)程(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利Mullis等人的4,683,195，4,683,202，4,800,159，4,965,188；Tabor等人的4,795,699和4,921,794；Innis的5,142,033；Wilson等人5,122,464；Innis等人5,091,310；Gyllensten等人的5,066,584；Gelfand等人的4,889,818；Silver等人的4,994,370；Biswas等人4,766,067；Ringold的4,656,134；PCR方案方法和應(yīng)用的指導(dǎo))和利用靶序列的反義RNA作為雙鏈DNA合成的模板進(jìn)行RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增(Malek等人的美國(guó)第5,130,238號(hào)專(zhuān)利，商品名為NASBA)；和將DNA擴(kuò)增的使用與抗體標(biāo)記結(jié)合的貿(mào)易PCR[Ruzicka等人，科學(xué)260487(1993)；Sano等人，科學(xué)258120(1992)；Sano等人，生物技術(shù)91378(1991)]，所有的專(zhuān)利文獻(xiàn)和出版物全部引入本文作為參考。
以類(lèi)似的方式，參照如上所述的RAP-2蛋白質(zhì)的類(lèi)似物制備RAP-2蛋白質(zhì)的生物學(xué)化學(xué)片段(例如任何的RAP-2或其異型)。RAP-2蛋白質(zhì)的合適的片段是那些保留了RAP-2的能力并且可以調(diào)節(jié)或介導(dǎo)RIP的生物學(xué)活性或其它與RIP直接或間接相關(guān)的其它蛋白質(zhì)，因此，參照如上所述的類(lèi)似物，制備具有顯性的負(fù)值或顯性的正值的作用的RAP-2蛋白質(zhì)片段。應(yīng)該注意到這些片段代表特殊類(lèi)型的本發(fā)明的類(lèi)似物，稱之為將它們定義為來(lái)源于全長(zhǎng)RAP-2蛋白質(zhì)序列的RAP-2蛋白質(zhì)的部分(例如，來(lái)自于任何的RAP-2或其異型)，各個(gè)這樣的部分或片段具有任何上面所述的需要的活性。這樣的片段可以是肽。
類(lèi)似地，采用對(duì)RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物或片段或通過(guò)結(jié)合RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物或片段到另一個(gè)或者分子例如抗體，酶，受體等如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)側(cè)面基團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)的修飾可以制備衍生物。因此采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的手段如本文使用的“衍生物”覆蓋了可以從功能性基團(tuán)制備的衍生物，這些基團(tuán)存在于殘基的側(cè)鏈或C-末端或N-末端基團(tuán)并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該衍生物可以是化學(xué)成份例如碳水化合物或磷酸殘基，條件是這樣的組分具有與RAP-2蛋白質(zhì)相同的或較高的生物學(xué)活性。
例如，衍生物可以包括羧基的脂肪族的酯，可以與氨或一級(jí)或二級(jí)胺反應(yīng)的羧基的酰胺，與?；煞菪纬傻腘-?；苌锘蛴甚；糠中纬傻陌被釟埢挠坞x的氨基(例如，烷?；蛱辑h(huán)的芳酰基團(tuán))或游離的羥基的O-?；苌?例如絲氨?；蛱K氨酰殘基的那些)。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”計(jì)劃僅包括不會(huì)將一個(gè)氨基酸改變?yōu)?0個(gè)共同存在的天然氨基酸的那些衍生物。
RAP-2是蛋白質(zhì)或多肽即氨基酸殘基的序列。計(jì)劃將構(gòu)成較大序列的包括本文定義的整個(gè)RAP-2蛋白質(zhì)的序列的多肽包括在這樣的多肽的范圍內(nèi)，只要疊加不影響本發(fā)明的氨基酸的新特性，即，如果它們保留或增加RAP-2蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或可以被例舉以剩下具有RAP-2蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。因此，例如計(jì)劃將本發(fā)明包括具有其它的氨基酸或多肽的RAP-2蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。
新的RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段和其衍生物具有許多可能的應(yīng)用，例如(i)在如上所述的炎癥，細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活中可以將RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段和衍生物用于調(diào)節(jié)RIP的功能。例如，如果RAP-2可以調(diào)節(jié)RIP’s對(duì)NF-κB，JNK(Jun激酶)或p38激酶的活化的作用，當(dāng)在抗腫瘤，抗或原炎癥，抗HIV的應(yīng)用是令人滿意的，這樣的RAP-2作用導(dǎo)致加強(qiáng)這樣的RAP-2-RIP的作用。在某些情況下，采用本身已知的標(biāo)準(zhǔn)的程序可以將調(diào)節(jié)炎癥，加強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，或阻止細(xì)胞存活作用的RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段或衍生物導(dǎo)入到細(xì)胞。例如，當(dāng)RAP-2蛋白質(zhì)完全是胞內(nèi)(如懷疑)和僅僅應(yīng)該導(dǎo)入到細(xì)胞中，而通過(guò)RIP介導(dǎo)的FAS-R配體或TNF或其它細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的作用是令人滿意的，用于將該蛋白質(zhì)特異性導(dǎo)入到細(xì)胞的系統(tǒng)是必要的。一種方式是通過(guò)制備重組動(dòng)物病毒，例如來(lái)源于牛痘的病毒，其中導(dǎo)入了下面的兩個(gè)基因，編碼結(jié)合到特異性地由該細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的配體的基因，例如AIDs(HIV)病毒蛋白質(zhì)gp120，該蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合到某些細(xì)胞(CD4淋巴細(xì)胞和相關(guān)的白血病)，或者特異性地結(jié)合到攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞的其它配體，所述細(xì)胞是攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞；和編碼RAP-2蛋白質(zhì)的基因。因此在病毒上表達(dá)的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白質(zhì)將會(huì)靶擊特異性于腫瘤細(xì)胞或其它攜帶FAS-R-或p55-R的細(xì)胞的病毒，在借助于病毒將RAP-2編碼序列導(dǎo)入到細(xì)胞并且一旦在細(xì)胞中表達(dá)之后將會(huì)導(dǎo)致RIP介導(dǎo)的FAS-R配體或TNF作用或依賴性RIP的加強(qiáng)。采用標(biāo)準(zhǔn)的程序構(gòu)建這樣的重組動(dòng)物病毒(參見(jiàn)例如Sambrook等人，1989)。另一種可能是導(dǎo)入寡聚核苷酸形式的RAP-2蛋白質(zhì)的序列(例如，融合一種RAP-2或其異型)，所述的核苷酸可以通過(guò)細(xì)胞吸附并且表達(dá)。
(ii)可以將它們用于抑制由RIP介導(dǎo)的FAS-R配體或TNF或相關(guān)的蛋白質(zhì)的作用或獨(dú)立的RIP的作用，例如，在類(lèi)似于在膿毒性的休克，移植-對(duì)-宿主排斥，或急性的肝炎中組織損害的情況下，其中阻止FAS-R配體或TNF誘導(dǎo)的FAS-R或p55-R胞內(nèi)信號(hào)形成或獨(dú)立的RIP作用，或其它蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)形成和同時(shí)增加細(xì)胞存活途徑是令人滿意的。在這種情況下，例如采用標(biāo)準(zhǔn)程序，具有RAP-2蛋白質(zhì)的反義編碼序列的寡聚核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中是可能，這將有效地阻止編碼RAP-2蛋白質(zhì)的mRNAs的轉(zhuǎn)譯并且從而阻止其表達(dá)和導(dǎo)致對(duì)FAS-R配體-或TNF-或RIP或其它蛋白質(zhì)的作用。利用上述重組病毒途徑通過(guò)是寡聚核苷酸序列的病毒攜帶的第二序列可以將這樣的寡聚核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞。
同樣，如上所述，基于RAP-2-RIP相互作用的特性，通過(guò)上述(i)和(ii)的方法，加強(qiáng)或抑制細(xì)胞炎癥和存活的途徑是可能的。
另一個(gè)可能性是用于特異于RAP-2蛋白質(zhì)的抗體以抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)形成活性。
最近研制的核酶方法是另一種抑制RIP介導(dǎo)的作用或RIP獨(dú)立的作用。核酶是特異性地裂解RNAs的催化的RNA分子?？梢詫⒑嗣高M(jìn)行基因工程以裂解選擇的靶RNAs，例如編碼本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的mRNAs。這樣的核酶具有特異性于RAP-2蛋白質(zhì)mRNA的序列和通過(guò)裂解mRNA之后是有能力的或相互作用(互補(bǔ)結(jié)合)，導(dǎo)致RAP-2蛋白質(zhì)的表達(dá)的降低，根據(jù)靶細(xì)胞核酶表達(dá)的水平。為了將核酶導(dǎo)入到選擇的細(xì)胞(例如，攜帶FAS-R或p55-R的那些)，可以使用合適的載體，例如，質(zhì)粒，動(dòng)物病毒(反錄病毒)載體，通常這些載體可用于該目的[也參見(jiàn)上面(i)，其中作為第二序列的病毒具有編碼選擇的核酶序列的cDNA]。(評(píng)論，涉及核酶的方法等參見(jiàn)Chen等人，1992；Zhao和Pick，1993；Shore等人，1993；Joseph和Burke，1993；Shimayama，1993；Cantor等人，1993；Barinaga，1993；Crisell等人，1993和Koizumi等人，1993)。該途徑是合適的，因?yàn)樵揜AP-2-RIP相互作用加強(qiáng)阻止細(xì)胞毒性或當(dāng)RAP-2-RIP相互作用抑制NF-κB活性是令人滿意的情況，在阻止該抑制以增加這樣的NF-κB激活是令人滿意的，即在增加上述(ii)中細(xì)胞存活是令人滿意的相同情況下。
(iii)將RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段或衍生物用于參與胞內(nèi)信號(hào)形成過(guò)程的相同類(lèi)別的其它蛋白質(zhì)的分離，鑒別和克隆，即結(jié)合到RIP或結(jié)合到功能性相關(guān)的受體或蛋白質(zhì)的那些，在可以用于上面所述的酵母兩個(gè)雜交系統(tǒng)的申請(qǐng)中或在PCR克隆之后可用于最近研制的使用非嚴(yán)格的Southern雜交的系統(tǒng)(Wilks等人，1989)。在Wilks等人的公開(kāi)中，描述了基于已知的激酶基序，構(gòu)思的激酶序列之后，通過(guò)PCR克隆之后由非嚴(yán)格的Southern雜交的應(yīng)用鑒別和克隆兩個(gè)推測(cè)的蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶。該途徑可用于根據(jù)本發(fā)明利用RAP-2蛋白質(zhì)的序列用于鑒別和克隆這些相關(guān)的RIP結(jié)合的蛋白質(zhì)。
(iv)將利用RAP-2蛋白質(zhì)，或其類(lèi)似物，片段或衍生物的另一種途徑用于親和層析方法，以分離和鑒別能夠結(jié)合例如其它參與胞內(nèi)信號(hào)形成過(guò)程的蛋白質(zhì)或因子的其它蛋白質(zhì)或因子。在該申請(qǐng)中，可以將本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段或衍生物單個(gè)結(jié)合到親和層析基質(zhì)，然后引起與細(xì)胞提取物的接觸，或分離懷疑參與胞內(nèi)信號(hào)形成過(guò)程的蛋白質(zhì)或因子。在親和層析程序之后，可以洗脫，分離和定性本發(fā)明的結(jié)合到RAP-2蛋白質(zhì)或其類(lèi)似物，片段或衍生物的其它蛋白質(zhì)或因子。
(v)如上所述，也可以將RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物，片段或衍生物用作為免疫原(抗原)以生產(chǎn)特異性蛋白質(zhì)。這些抗體也可用于從細(xì)胞提取物或從轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生RAP-2蛋白質(zhì)，其類(lèi)似物或片段的細(xì)胞系純化RAP-2蛋白質(zhì)(例如RAP-2或任何的異型)。此外，這些抗體可用于診斷以鑒別涉及異常功能的RIP介導(dǎo)的FAS-R配體或TNF系統(tǒng)，或獨(dú)立的RIP活性，例如通過(guò)RIP或RIP自身的特異性細(xì)胞作用介導(dǎo)的過(guò)活或低活的FAS-R配體或TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞作用的紊亂。因此，這樣的紊亂應(yīng)該涉及參與RIP蛋白質(zhì)或各種其它的，如上所述的RIP-結(jié)合蛋白質(zhì)或RAP-2蛋白質(zhì)本身的多功能的胞內(nèi)信號(hào)形成系統(tǒng)，這樣抗體作為重要的診斷工具。
應(yīng)該注意到利用任何熟知的標(biāo)準(zhǔn)篩選程序進(jìn)行本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的分離和鑒別和定性，例如，這些篩選程序之一，酵母兩個(gè)雜交程序，如下文列出的，可用于鑒別RIP蛋白質(zhì)(參見(jiàn)例如Stanger等人，1995)和隨后本發(fā)明的各種RAP-2蛋白質(zhì)(除了上面和下面所述的共擁有的正在審查的專(zhuān)利申請(qǐng)的各種其它的新的蛋白質(zhì))。與如上文和下文所述的類(lèi)似，可以將各種程序用于例如親和層析，DNA雜交程序等如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的以分離、鑒別和定性的本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)或以分離、鑒別和定性其它的蛋白質(zhì)，因子，受體等，它能夠結(jié)合到本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)。
如上所述，可以將RAP-2蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生特異性于RAP-2蛋白質(zhì)的抗體，例如RAP-2和其異型。因此可以使用這些抗體或片段，如下文詳細(xì)列出的，應(yīng)該明白這些申請(qǐng)中其抗體或片段是特異性于RAP-2蛋白質(zhì)的那些。
基于本發(fā)明的分析RAP-2特異性地結(jié)合到RIP并且因此是RIP的介導(dǎo)劑/調(diào)節(jié)劑，因此以RIP獨(dú)立或與其它蛋白質(zhì)共同起作用的方式介導(dǎo)/調(diào)節(jié)在炎癥、細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活途徑中的RIP的活性(例如在細(xì)胞死亡途徑中的FAS-R，p55-R，MORT-1，MACH，Mch4，G1和TRADD或細(xì)胞存活途徑中的TRAF2)，設(shè)計(jì)可以加強(qiáng)或研制RAP-2-RIP的相互作用是重要的，如需要的，并且取決于這些途徑是通過(guò)RAP-2-RIP相互作用加強(qiáng)、抑制的。這樣的藥物對(duì)許多疾病有幫助。對(duì)于其它，對(duì)肝有急性損失的急性肝炎似乎反映FAS-R配體介導(dǎo)的肝細(xì)胞的死亡；自體免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡例如胰腺的βLangerhans細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致糖尿??；移植排斥的細(xì)胞的死亡(例如，腎，心臟和肝臟)；在多種硬化中大腦的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。
RAP-2或一個(gè)或多個(gè)其可能的異型在一個(gè)或多個(gè)的上述途徑用作為RIP的“天然”的抑制劑是可能的，和因此將它們用作為上面所述的RIP的特異性抑制劑。同樣，也可以篩選其它物質(zhì)例如肽，有機(jī)化合物，抗體等等以獲得能夠抑制RAP-2-RIP相互作用的特異性藥物。
一個(gè)非-限制實(shí)施例是基于前人對(duì)ICE或ICE類(lèi)似的蛋白酶的肽抑制劑和ICE的底物特異性和利用肽合成的表位分析，該實(shí)施例對(duì)RAP-2-RIP相互作用的肽抑制劑，是進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選。發(fā)現(xiàn)通過(guò)ICE有效地裂解肽的最基本的要求設(shè)計(jì)四個(gè)氨基酸以留在在P1位置且具有對(duì)氨基酸的強(qiáng)力喜好，在P1位置具有足夠的甲胺的裂解位點(diǎn)(Sleath等人，1990；Howard等人，1991；Thornberry等人，1992)。此外，the fluorogenic反應(yīng)物肽(一種四肽)，乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-coumaryl-7-酰胺)縮寫(xiě)為Ac-DEVD-AMC，相當(dāng)于聚poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)中的序列，發(fā)現(xiàn)在FAS-R刺激之后，以及其它的細(xì)胞死亡過(guò)程之后不久在細(xì)胞被分開(kāi)(Kaufmann，1989；Kaufmann等人，1993；Lazebnik等人，1994)，和被CPP32(許多的CED3/ICE蛋白酶家族)和MACH蛋白酶有效地裂解(和同樣地也可能例如GI蛋白酶，例如共同擁有的在審中的IL 120367)。
因?yàn)樵诘孜锏腜1位置上的Asp似乎是重要的，具有作為第四氨基酸的殘基的Asp和在最初的三個(gè)殘基位置的四肽可以被快速地篩選以結(jié)合到蛋白酶的活性的位置，例如利用Geysen(Geysen，1985；Geysen等人，1987)研制的方法，其中對(duì)許多固體支撐物上的肽進(jìn)行篩選以找到與抗體的特異的相互作用。通過(guò)多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢測(cè)方法，如G1蛋白酶等可以探測(cè)結(jié)合MACH1蛋白酶到特異的肽。顯示該Geysen′s的方法能夠在每個(gè)工作日測(cè)試至少4000個(gè)肽。
以類(lèi)似的方式可以闡明決定RAP-2和RIP之間的相互作用精確的結(jié)合區(qū)域或同源性區(qū)域，然后肽可被篩選以用作阻滯相互作用，例如具有相似于結(jié)合區(qū)域或其互補(bǔ)的區(qū)域的順序的合成肽，所述互補(bǔ)區(qū)域與天然的RAP-2競(jìng)爭(zhēng)與RIP的結(jié)合。
可以將能夠通過(guò)抑制RAP-2-RIP的相互作用而抑制RAP-2的炎癥或細(xì)胞死亡活性的藥物或肽抑制劑與促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的分子結(jié)合或復(fù)合。
美國(guó)專(zhuān)利5,149,782公開(kāi)待運(yùn)輸?shù)姆肿哟┻^(guò)細(xì)胞膜偶合一個(gè)分子到膜混合劑如膜多肽，離子通道形成多肽，其它的膜多肽，長(zhǎng)鏈脂肪的酸，例如棕櫚酸。這些膜混合劑將分子的軛合物插入細(xì)胞的膜脂類(lèi)雙分子層和促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
Low等人，美國(guó)專(zhuān)利5,108,921評(píng)論對(duì)于分子例如但不限于蛋白質(zhì)，核酸通過(guò)受體調(diào)解的胞內(nèi)活性的原理跨膜釋放的有效的方法。這些受體系統(tǒng)包括識(shí)別半乳糖，甘露糖，甘露糖-6-磷酸鹽，轉(zhuǎn)鐵蛋白，鈷胺傳遞蛋白(transcobalamin，維生素B12)，α-2大球蛋白，胰島素和其它的肽生長(zhǎng)因子例如表皮的生長(zhǎng)因子(EGF)。Low等人教導(dǎo)由于在大多數(shù)的細(xì)胞的表面的生物素和葉酸鹽受體的位置和多重性和關(guān)聯(lián)的受體調(diào)解跨膜運(yùn)輸過(guò)程，營(yíng)養(yǎng)的受體，例如生物素和葉酸鹽的受體可有利地用于加強(qiáng)穿過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸。因此在待釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的化合物和配體例如生物素或葉酸鹽之間形成的絡(luò)合物和攜帶生物素或葉酸鹽受體接觸開(kāi)始受體調(diào)解的跨膜運(yùn)輸機(jī)理，從而允許想要的化合物進(jìn)入細(xì)胞。
另外，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知將想要的肽順序與前導(dǎo)/信號(hào)肽序列融合以制備“嵌合肽”使得待運(yùn)輸?shù)摹扒逗想摹贝┻^(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
肽領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的RAP-2-RIP相互作用的肽抑制劑包括模擬肽藥物或也可以快速篩選結(jié)合到RAP-2/RIP蛋白酶以設(shè)計(jì)更穩(wěn)定的抑制劑。
也可以認(rèn)識(shí)到將如上所述的用于有助于或加強(qiáng)肽抑制劑穿過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)輸用于RAP-2或其異型本身以及其它起胞內(nèi)作用的肽和蛋白質(zhì)。
就本文提到的抗體，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指包括多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)，嵌合抗體，抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體，所述的抗體可以是可溶性的或以結(jié)合的方式進(jìn)行標(biāo)記，以及由任何技術(shù)但不限于酶促裂解，肽合成或重組技術(shù)提供的片段。
多克隆抗體是來(lái)源于以免疫原免疫接種的動(dòng)物血清的抗體分子的異源群體。單克隆抗體含有特異性于抗原的抗體的基本上異源的群體，所述的群體基本上含有類(lèi)似的表位結(jié)合位點(diǎn)。采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法抗原獲得mAbs。參見(jiàn)，例如Kohler和Milstain，自然256495-497(1975)；美國(guó)專(zhuān)利4,376,110；Ausubel等人，Harlow和Lane抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)；和Colligan等人，目前的免疫學(xué)方案，Greene出版協(xié)會(huì)和WileyInterscience N.Y.(1992-1996)，其所有內(nèi)容引入本文作為參考。這樣的抗體可以包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD的免疫球蛋白種類(lèi)和其亞種?？梢詫a(chǎn)生本發(fā)明的mAb的雜交瘤在體外，原位或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)或原位高效價(jià)的產(chǎn)生是目前有效的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是不同部分來(lái)源于不同的動(dòng)物種類(lèi)的分子，例如具有來(lái)源于小鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白不變區(qū)域。首先將嵌合抗體用于在應(yīng)用中降低免疫原性和增加產(chǎn)量，例如，當(dāng)鼠的mAbs從雜交瘤有較高產(chǎn)量，但是在人中有較高的免疫原性時(shí)，這樣可以使用人/鼠的嵌合mAbs。用于生產(chǎn)的嵌合抗體和方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813273.3277(1984)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Boulianne等人，自然312643-646(1984)；Cabilly等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)125023(
公開(kāi)日1984.11.14)；Neuberger等人，自然314268-270(1985)；Taniguchi等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)171496(
公開(kāi)日1985.02.19)；Morrison等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)173494(
公開(kāi)日1986.03.05)；Neuberger等人，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO8601533，(
公開(kāi)日1986.03.13)；Kudo等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)184187(
公開(kāi)日1986.06.11)；Sahagan等人，免疫學(xué)雜志1371066-1074(1986)；Robinson等人，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO8702671(
公開(kāi)日1987.05.07)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA843439-3443(1987)；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA84214-218(1987)；Better等人，科學(xué)2401041-1043(1988)；和Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，見(jiàn)上文。這些參考完全引入本文作為參照。
抗-idiotypic(抗-Id)抗體是識(shí)別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的獨(dú)特的決定族的抗體。通過(guò)免疫接種相同的種和遺傳的類(lèi)型的動(dòng)物(例如小鼠株)作為正在制備的抗Id的mAb的來(lái)源制備Id抗體。通過(guò)生產(chǎn)對(duì)這些獨(dú)特型決定族的抗體(抗-Id抗體)接種免疫的動(dòng)物將會(huì)識(shí)別和響應(yīng)免疫接種的抗體的決定族。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,699,880號(hào)，該文獻(xiàn)完全引入本文作為參考。
也將抗-Id抗體用作為“免疫原”以在另一個(gè)動(dòng)物誘導(dǎo)免疫的應(yīng)答，生產(chǎn)所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id其表位完全相同于誘導(dǎo)抗Id的原始的mAb。因此，通過(guò)利用抗mAb的獨(dú)特型表位的抗體，識(shí)別表達(dá)同一的特異性的抗體的其它的克隆是可能的。
因此，產(chǎn)生抗本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)，類(lèi)似物，片段，衍生物的mAbs，可用于在合適的動(dòng)物上，例如BALB/c老鼠中誘導(dǎo)抗-Id-抗體。將來(lái)自于免疫的老鼠的脾臟細(xì)胞用于生產(chǎn)抗雜交瘤分泌的抗-Id mAbs。此外，將抗-Id mAbs偶合到載體例如鍵孔血藍(lán)蛋白(KLH)和用于免疫接種另外的BALB/c老鼠。從這些老鼠獲得的血清含有抗-抗-Id抗體，該抗體有對(duì)上面的RAP-2蛋白質(zhì)，類(lèi)似物，片段，衍生物的表位特異的原始的mAb的結(jié)合屬性。
因此抗-Id mAbs具有其自身的獨(dú)特型表位或結(jié)構(gòu)類(lèi)似于待闡明的“idiotopes”表位，例如GRB蛋白質(zhì)-a。
術(shù)語(yǔ)“抗體”也是指包括完整的分子以及其片段，例如Fab和F(ab′)2，它能夠結(jié)合抗原。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整的抗體的Fc片段，很明顯可更快速地參與循環(huán)，和具有比完整的抗體更低的非特異的組織[Wahl等人，核酸方法雜志24316-325(1983)]。
將會(huì)領(lǐng)會(huì)根據(jù)本文公開(kāi)的用于完整的抗體分子的方法Fab和F(ab′)2和用于本發(fā)明的抗體其它的片段可用于檢測(cè)和定量RAP-2蛋白質(zhì)。使用酶例如木瓜蛋白酶(以生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶[以生產(chǎn)F(ab′)2片段]，通過(guò)蛋白水解作用的分裂典型的生產(chǎn)這樣的片段。
據(jù)說(shuō)抗體是一種“有能力的結(jié)合”的分子，如果有能力的特定地與該分子起反應(yīng)從而結(jié)合該分子到抗體。術(shù)語(yǔ)“表位”是指有能力的與抗體結(jié)合的任何分子部分，該部分也能被那抗體識(shí)別，通常表位或抗原決定族由分子的化學(xué)活性的表面分組，例如氨基酸或糖側(cè)鏈和有特異的三維的結(jié)構(gòu)的特性以及特異的電荷特性。
“抗原”是指有能力的結(jié)合抗體的分子或部分分子，另外，它有能力的誘導(dǎo)動(dòng)物生產(chǎn)有能力的結(jié)合到那個(gè)抗原的表位的抗體?？乖梢杂幸粋€(gè)或更多表位。上述的特異的反應(yīng)是指示抗原將以高度選擇性的方式與對(duì)應(yīng)抗體和不與其它抗體的多數(shù)發(fā)生反應(yīng)，該抗體由其它的抗原引起的。
將用于本發(fā)明的抗體，抗體片段用于在樣品中定量或定性的探測(cè)RAP-2蛋白質(zhì)或探測(cè)表達(dá)本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的細(xì)胞的存在。通過(guò)使用偶合到光顯微鏡的熒光標(biāo)志的抗體免疫熒光技術(shù)，流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器，或熒光計(jì)數(shù)器檢出完成。
將本發(fā)明的抗體(或片段)從組織學(xué)的用作為免疫熒光法或免疫顯微鏡，以原位檢出本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)。通過(guò)從病人移動(dòng)組織學(xué)的樣品完成原位檢出，和將本發(fā)明的標(biāo)記的抗體提供給這樣的樣品。通過(guò)應(yīng)用或通過(guò)將標(biāo)志的抗體(或片段)覆蓋到生物學(xué)的樣品以更好地提供抗體。通過(guò)使用這樣的程序，不僅測(cè)定RAP-2蛋白質(zhì)的存在，而且其可分布在所檢查的組織。本發(fā)明可使，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解普遍的種類(lèi)的組織學(xué)的方法(例如染色程序)可以修飾以便在原位檢測(cè)達(dá)到目的地。
典型的用于本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的測(cè)試包含在有能力的識(shí)別RAP-2蛋白質(zhì)的標(biāo)志的抗體存在下培養(yǎng)生物學(xué)的樣品，例如生物學(xué)的液體，組織提取液，新近收獲的細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞或白血球或已經(jīng)在組織培養(yǎng)物中的培養(yǎng)的細(xì)胞，采用許多本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測(cè)抗體。
用固體相支撐物或載體例如硝酸纖維素，或有能力的固定細(xì)胞，細(xì)胞粒子或可溶解的蛋白質(zhì)的其它的固體支撐物處理生物學(xué)的樣品。然后在用本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體處理之后用合適的緩沖劑洗滌支撐物或載體，如上所述。然后第二期用緩沖劑洗滌固體相支撐物或載體，以除去自由的抗體。然后采用常規(guī)的手段探測(cè)固體支撐物或載體的結(jié)合的標(biāo)志的量。
“固體相支撐物”，“固體相載體”，“固體支撐物”，“固體載體”，“支撐物”或“載體”指有能力的結(jié)合抗原或抗體的支撐物或抗體。熟知的支撐物或載體包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍淀粉酶，天然的和修飾的纖維素，聚丙烯酰胺，輝長(zhǎng)巖，和磁鐵礦。載體的性能可以在少許的程度是可溶解的或?qū)τ诒景l(fā)明的目的是不能溶解的。支撐物材料可以事實(shí)上可具有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要偶合的分子有能力結(jié)合到抗原或抗體上。因此，支撐物或載體構(gòu)型可以是是球形的，如珠子，圓柱形的，如在管子的內(nèi)部表面，或棒的外部表面。非此即彼，表面可以是平坦的例如片狀的測(cè)試條狀等等。首選的支撐物或載體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道其它的合適的載體以結(jié)合抗體或抗原，或利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)同樣能夠確定。
根據(jù)已知的方法可以測(cè)定如上所述的本發(fā)明的授予的許多抗體的結(jié)合活性。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)?zāi)苊鞔_各個(gè)試驗(yàn)和最佳的實(shí)施條件。
其它如洗滌，攪拌，振蕩，過(guò)濾等步驟可以加到分析中，因?yàn)閷?duì)于特定的情況是慣常的或必要的。
可檢測(cè)地標(biāo)記本發(fā)明抗體的方法之一是通過(guò)將其連接到酶和用于酶免疫測(cè)定(ELA)。順次當(dāng)以后暴露于適當(dāng)?shù)拿缸饔梦?，該酶將與反應(yīng)物以這樣的方式起反應(yīng)以生產(chǎn)化學(xué)的一部分，該部分例如通過(guò)分光光度法，熒光法或通過(guò)視覺(jué)的方法探測(cè)的化學(xué)的一部分?？捎糜诳蓹z測(cè)標(biāo)志抗體的酶包括，但不限于蘋(píng)果酸鹽脫氫酶，核酸酶，δ-5-甾族化合物異構(gòu)酶，酵母乙醇脫氫酶，alpha甘油磷酸酯脫氫酶，丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶，辣根過(guò)氧化物酶，堿性的磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，過(guò)氧化氫酶，葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶，葡糖淀粉酶和乙酰膽堿-酯酶。通過(guò)比色法完成檢測(cè)，該方法使用酶的產(chǎn)色的反應(yīng)物。通過(guò)與類(lèi)似制備的標(biāo)準(zhǔn)視力的比較反應(yīng)物酶的反應(yīng)的程度也可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。
使用多種其它的免疫測(cè)定實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。例如，采用放射性的標(biāo)記的抗體或抗體片段，通過(guò)使用放射免疫測(cè)定法(RIA)探測(cè)R-PTPase是可能的。在Work，T.S.等人，North Holland PublishingCompany，NY(1978)分子的生物學(xué)，實(shí)驗(yàn)室工藝方法和生物化學(xué)中創(chuàng)立RIA的有益的描述，特別的參照由Chard，T.，的重要章節(jié)取名為“對(duì)放射性免疫鑒定和相關(guān)的技術(shù)”，引入本文作為參照。采用類(lèi)似使用計(jì)數(shù)器或現(xiàn)象閃爍計(jì)數(shù)字或放射自顯影法的手段探測(cè)放射性的同位素。
用本發(fā)明的螢光的化合物標(biāo)記抗體是可能的。當(dāng)熒光標(biāo)志的抗體與適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)的光接觸時(shí)，然后探測(cè)出現(xiàn)的熒光。最多通常使用的熒光標(biāo)記的化合物是熒光素異硫氰酸鹽，堿性蕊香紅，phycoerythrine，Pycocyanin，別藻藍(lán)蛋白，鄰苯二甲醛和熒光胺。
使用放射熒光的金屬例如152E，其它的鑭系元素也可檢測(cè)地標(biāo)記。使用這樣的金屬螫合劑團(tuán)如二乙烯三胺五乙酸(ETPA)將這些金屬附加到抗體。
通過(guò)偶合到化學(xué)發(fā)光化合物也可以對(duì)抗體可檢測(cè)地標(biāo)記。通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的存在，測(cè)定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。該化學(xué)發(fā)光是在化學(xué)的反應(yīng)過(guò)程出現(xiàn)的。特別可使用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的化合物的例子是luminol，isoluminol，theromatic acridinium酯，咪唑，acridinium鹽和草酸鹽酯。
類(lèi)似地，可將生物性發(fā)光化合物用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是建立在生物學(xué)的系統(tǒng)中的化學(xué)發(fā)光類(lèi)型，其中催化的蛋白質(zhì)增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在測(cè)定生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。重要的生物發(fā)光化合物是熒光素，蟲(chóng)螢光素酶，蟲(chóng)螢光素酶和水母蛋白(aequorin)。
本發(fā)明的抗體分子可適應(yīng)用于免疫計(jì)量鑒定中，也已知“二個(gè)位置”或“夾心”分析。在典型的免疫計(jì)量分析，將定量的未標(biāo)記的抗體(或抗體的片段)結(jié)合到固體支撐物或載體上，定量的可檢測(cè)的標(biāo)記的可溶解的抗體加入以允許固體相抗體，抗原，和標(biāo)記的抗體之間形成的三態(tài)的絡(luò)合物檢測(cè)和/或定量。
典型的和首選的免疫計(jì)量測(cè)定包括“向前的”測(cè)定，其中首先將結(jié)合到固體相的抗體與待經(jīng)驗(yàn)定的樣品接觸，通過(guò)形成二態(tài)的固體相抗體-抗原絡(luò)合物以從樣品提取抗原。在合適的孵育之后，洗滌固體支撐物或載體以除去液體樣品的殘?jiān)?，包括未反?yīng)的抗原，如果需要，然后與含有未知量的標(biāo)記的抗體(功能為“受體分子”)的溶液接觸，在第二孵育期之后，通過(guò)未標(biāo)記的抗體許可標(biāo)記的抗體與結(jié)合到固體支撐物或載體的抗原復(fù)合，將固體支撐物或載體洗滌第二次以除去未反應(yīng)的標(biāo)記的抗體。
使用再一的“夾心”測(cè)定類(lèi)型，可與本發(fā)明的抗原一起使用，所謂的“同時(shí)發(fā)生的”和“逆轉(zhuǎn)”測(cè)定。同時(shí)發(fā)生的測(cè)定包括單一的孵育步驟，例如將結(jié)合到固體支撐物或載體和標(biāo)記的抗體同時(shí)加入到待經(jīng)驗(yàn)定的樣品。在孵育完成之后，將固體支撐物或載體洗滌以除去液體樣品的殘?jiān)臀磸?fù)合的標(biāo)記的抗體。然后測(cè)定標(biāo)記的與固體支撐物或載體關(guān)聯(lián)的抗體的存在，因?yàn)樗窃诔Ｒ?guī)的“向前”夾心測(cè)定。
在“逆轉(zhuǎn)”測(cè)定中，在合適的孵育時(shí)期之后，利用首先逐步將標(biāo)記的抗體的溶液加入到液體樣品，隨后加入結(jié)合到固體支撐物或載體的未標(biāo)記的抗體。在第二孵育之后，以常規(guī)的方式洗滌固體相使樣品的殘基和未反應(yīng)的標(biāo)記的抗體自由。然后入“同時(shí)”和“向前”測(cè)試，測(cè)定與固體支撐物或載體關(guān)聯(lián)的標(biāo)記的抗體。
采用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA程序生產(chǎn)本發(fā)明的(參見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989和Ansabel等人，1987-1995，見(jiàn)上文)，其中通過(guò)適當(dāng)?shù)暮芯幋a蛋白質(zhì)的真核或原核載體轉(zhuǎn)化本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的合適的真核或原核細(xì)胞，因此，本發(fā)明還涉及這樣的表達(dá)載體和用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化宿主。如上所述，這些蛋白質(zhì)也包括生物學(xué)活性的類(lèi)似物，片段和衍生物，因此包括編碼它們的載體，也包括編碼這些蛋白質(zhì)的類(lèi)似物和片段，和轉(zhuǎn)化宿主包括生產(chǎn)這樣的類(lèi)似物和片段的宿主，由轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的這些蛋白質(zhì)的衍生物是采用蛋白質(zhì)或類(lèi)似物或片段的修飾標(biāo)準(zhǔn)本修飾生產(chǎn)的衍生物。
本發(fā)明還涉及包含編碼RAP-2蛋白質(zhì)的重組動(dòng)物病毒載體的藥物組合物，該載體也編碼有能力的結(jié)合到特異的靶細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)表面蛋白質(zhì)以指導(dǎo)RAP-2蛋白質(zhì)序列進(jìn)入細(xì)胞的病毒表面蛋白質(zhì)。此外本發(fā)明的藥物組合物包含(a)作為活性的成份的編碼RAP-2蛋白質(zhì)序列的反義序列寡核苷酸序列，或(b)阻滯RAP-2-RIP相互作用的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物包括足夠量的活性成份以獲得其計(jì)劃的目的。另外，引物組合物可以含有合適的藥物學(xué)可接受的載體，該載體包括賦形劑和助劑，這有助于活性化合物加工成為可在藥物學(xué)上使用的制劑，并且可以使這樣的制劑穩(wěn)定可用于給需要的患者給藥，如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的技術(shù)。
令人懷疑的是RAP-2蛋白質(zhì)和其異型或異型是以表達(dá)參與共同擁有的正在審查的專(zhuān)利申請(qǐng)所述的胞內(nèi)信號(hào)形成途徑的各種其它蛋白質(zhì)的表達(dá)類(lèi)似的方式，以顯著的不同的水平在不同的組織中表達(dá)并且明顯具有不同的異型方式。這些不同可以有助于對(duì)Fas/APO1-配體和TNF應(yīng)答的組織特異性特征。如其它的CED3/ICE同源性的情況(Wang等人，1994；Alnemri等人，1995)，本發(fā)明人以前已經(jīng)證明(在上述國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng))發(fā)現(xiàn)含有不完整的CED3/1CE區(qū)域(例如MACHα3)的MACH異型對(duì)共表達(dá)的具有MACHα1或MACHα2分子具有抑制作用；還發(fā)現(xiàn)它們通過(guò)Fas/APO1和p55-R阻止死亡的誘導(dǎo)。這樣的異型中細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)成了抗Fas/APOI-和TNF-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的細(xì)胞自身保護(hù)作用，還令人懷疑的至少G1異型的類(lèi)似的抑制這樣(G1是最近分離的新的Mch4-和可能的MACH-結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有MORT調(diào)節(jié)劑和蛋白酶區(qū)域-參見(jiàn)共同擁有的正在審查的IL 120367)。MACH異型的各種不均勻性并且同樣令人懷疑G1異型的類(lèi)似的應(yīng)該允許活性MACH異型的功能的特定的精細(xì)協(xié)調(diào)，并且類(lèi)似物也允許活性G1異型，其中不均勻性大大超過(guò)其它CED3/ICE家族所觀察到的結(jié)果。因此，如上所述，就與RIP的相互作用并且從而對(duì)細(xì)胞死亡的激活或細(xì)胞存活途徑之間的平衡的作用，如上所述而言RAP-2蛋白質(zhì)或可能的異型在不同的組織中具有不同的作用。
一些RAP-2異型也可能具有其它的功能。例如，RAP-2或一些RAP-2異型也可能具有分子的位點(diǎn)的作用，所述的分子借助于與RIP的相互作用或單獨(dú)的RIP的作用參與Fas/APOI和TNF受體的非細(xì)胞毒性作用。
由于Fas/APO1和TNF受體引起炎癥，細(xì)胞死亡的獨(dú)特的能力，以及TNF受體激發(fā)其它組織損毀活性的能力，這些受體功能的偏離應(yīng)該對(duì)生物體特別有害。的確，已經(jīng)證明這些受體的過(guò)量的和有效的功能有助于各種疾病的病理學(xué)的表現(xiàn)(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鑒別參與受體的信號(hào)形成活性的分子和發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這些化合物的發(fā)現(xiàn)的方式可以指導(dǎo)新的治療途徑，本發(fā)明的其它方面從下面的實(shí)施例是顯而易見(jiàn)的。
下面的非限制性實(shí)施例和附圖將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
還應(yīng)該注意下面的步驟i)兩個(gè)雜交篩選和兩個(gè)雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)測(cè)試；(ii)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，代謝標(biāo)記和免疫沉淀；(iii)體外結(jié)合；(iv)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性；和(v)Northern序列分析，(參見(jiàn)Boldin等人，1995b)2，3(也參見(jiàn)Boldin等人，1996)和4，下文，就MORT-1和a MORT-1結(jié)合蛋白質(zhì)，(例如MACH)，以及新分離的蛋白質(zhì)G1(參見(jiàn)IL120367)同樣可用于(有一些修改)RAP-2蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)的分離，克隆和定性，和本發(fā)明的克隆的異型。因此這些程序構(gòu)成了用于分離本發(fā)明的RAP-2蛋白質(zhì)的分離，克隆個(gè)定性的相同程序的全部公開(kāi)，如在共同擁有的正在審查的以色列申請(qǐng)第114,615，114,986，115,319，116588，117,932，和120367，以及相應(yīng)的PCT申請(qǐng)US96/10521的相同或等同方式詳細(xì)描述的。從外，就NIK蛋白質(zhì)和其在激活NF-□B和因此細(xì)胞死亡的作用和由TRAF2該細(xì)胞存活途徑中所起的作用例如TRAF2和RIP和其它蛋白質(zhì)之間的相互作用，通過(guò)本發(fā)明人在共同擁有的正在審查的IL117800，IL 119133和Malinin等人，1997詳細(xì)描述的。
實(shí)施例1結(jié)合到RIP蛋白質(zhì)的RAP-2蛋白質(zhì)的分離和克隆兩個(gè)雜交篩選，測(cè)序和初步的分析在B細(xì)胞文庫(kù)這利用以RIP作為餌的兩個(gè)雜交篩選方法(參見(jiàn)例如Fields和Song，1989，WO/96/18641)分離約1.5Kb大小的克隆，該克隆1.5Kb(參見(jiàn)圖1和圖2的箭頭)用于篩選噬菌體cDNA文庫(kù)，產(chǎn)生約2.0Kb克隆，序列顯示于圖1。
通過(guò)使用與1.5Kb克隆序列匹配的EST，獲得EST片段，它構(gòu)成了I.M.A.G.E.consortium克隆#41072的3’末端(研究遺傳院Research Genetics Institute)。僅公開(kāi)了該來(lái)源于胎兒的腦的文庫(kù)的克隆的位于3’和5’末端的兩個(gè)小序列片段。在獲得克隆之后，將其測(cè)序并且得出這些公開(kāi)的序列片段含有錯(cuò)誤。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的克隆在其編碼區(qū)(圖2)等同于圖1的克隆，但是在5’非編碼區(qū)顯示差異。因此推測(cè)cDNA或者是相同基因的拼接的形式。
該序列分析顯示類(lèi)似于RAP，RAP-2蛋白質(zhì)明顯不具有“死亡區(qū)域”，它沒(méi)有MORT調(diào)節(jié)劑，它沒(méi)有類(lèi)似于蛋白酶區(qū)域的ICE家族，它沒(méi)有激酶區(qū)域，也沒(méi)有TRAF區(qū)域(參見(jiàn)上述正在審查的專(zhuān)利申請(qǐng)，和各種的參考，就所有的存在于胞內(nèi)的發(fā)信號(hào)途徑而言尤其是Malinin等人，1997)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)幕虼嬖谟诩s定的序列，不同的是三個(gè)亮氨酸拉鏈(LZ)-類(lèi)似的障礙沿蛋白質(zhì)編碼區(qū)域分布。這里稱為“類(lèi)似”，因?yàn)樗鼈兊亩€(gè)包含亮氨酸到纈氨酸，甲硫氨酸或者異亮氨酸的替換。雖然通常認(rèn)為保守的，但是不清楚是否在亮氨酸拉鏈區(qū)域內(nèi)的這樣的變化允許蛋白質(zhì)保留它的功能的活性即結(jié)合到其它的LZ。結(jié)合研究顯示RAP-2本質(zhì)上結(jié)合到RIP，RAP-2，不能結(jié)合到TRADD，MORT-1，p55-R，p75-R和MACH(至今進(jìn)行的研究中)。這些結(jié)果支持事實(shí)RAP-2明顯去除“死亡區(qū)域”和MORT調(diào)節(jié)劑。
因此，似乎RAP-2是特異性的RIP-結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以非常特異性的方式作用/結(jié)合到RIP。因此，RAP-2似乎是在炎癥和細(xì)胞死亡/細(xì)胞存活率途徑的RIP的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)中具有重要的作用。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)利用全長(zhǎng)RIP作為餌進(jìn)行兩個(gè)雜交篩選的人B-細(xì)胞的cDNA文庫(kù)獲得RAP-2的克隆。RIP序列可以從以前的出版物獲得(參見(jiàn)STANGER等人，1995)和存在于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登記號(hào)為U25994，它是人RIP序列(也存在小鼠RIP序列，登記號(hào)為U25995)。利用該序列信息，合適的PCR-引物用OLIGO4TM軟件設(shè)計(jì)和對(duì)應(yīng)于RIP編碼部分的DNA片段可以通過(guò)利用來(lái)自于總的RNA人成纖維細(xì)胞文庫(kù)(利用標(biāo)準(zhǔn)程序)用作為模板cDNA進(jìn)行PCR獲得。然后將RIP的編碼部分克隆到pGBT-9的載體(Clontech)和如上，在兩個(gè)雜交篩選程序用作為餌。在兩個(gè)雜交篩選方法中，獲得與RIP相互作用的編碼RIP結(jié)合蛋白質(zhì)。
將如上的克隆用于篩選噬菌體cDNA文庫(kù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)。從圖1和圖2可以看出，當(dāng)5’-非編碼序列不同時(shí)，兩個(gè)克隆的編碼序列是相同的。因此，我們可能關(guān)心可選擇大拼接形式。該克隆的具有ORF(開(kāi)放讀框)為1.5Kb的2.0Kb，蛋白質(zhì)本身的分子量為50Kd。推測(cè)的RAP-2的氨基酸序列顯示于圖3。
在“dbest”數(shù)據(jù)庫(kù)，人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)level 1和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)分析上述RAP-2的序列顯示RAP-2序列是獨(dú)特的(新的)序列，因?yàn)闆](méi)有已知的序列顯示與RAP-2重要的同源性。在IL 123758遞交之后，該申請(qǐng)要求的優(yōu)先權(quán)，Yamaoka S.等人(1998)，報(bào)告編碼48kD的蛋白質(zhì)的鼠的cDNA的特性，稱之為NEMO(對(duì)于NF-κB必要的調(diào)節(jié)劑)。(參見(jiàn)背景資料)。
另外的數(shù)據(jù)庫(kù)(in silico)檢索識(shí)別FIP-2-具有未知功能的蛋白質(zhì)，它最初由Li Y.等人克隆(1998，參見(jiàn)背景資料)。
如從RAP-2和FIP-2序列的通用的排列可以看出[圖3(B)]，全部的類(lèi)似的程度是相當(dāng)?shù)氐?因此它沒(méi)有令人驚訝使用基于共用算法進(jìn)行掃描沒(méi)有識(shí)別該序列)。RAP-2和FIP-2之間的同源性增加蛋白質(zhì)的C-末端的，最后有效的標(biāo)識(shí)C-末端的30個(gè)氨基酸。值得注目的是，除了后者的區(qū)域，F(xiàn)IP-2的推定的LZ-基序在RAP-2中是大量地保留的(不同的是亮氨酸/丙氨酸替換)。
另外的大約0.5kb的較短的cDNA也被識(shí)別(ID1469996)和下文將它指定為Human shrt。該變異體包含起源于1.5kb的“全長(zhǎng)的”cDNA的幾個(gè)遙遠(yuǎn)的區(qū)域的編碼序列“區(qū)段”，可能起源相同的基因的不同的剪接。
許多的組織的Northern印跡(Clontech)與0.9kb BglII-片段的RAP-2cDNA，的雜交分析得出復(fù)雜的圖案的RAP-2mRNA。以或多或少的普遍存在的流行的2.5kb和6kb變異體[圖4(A)]探測(cè)大小范圍在<lkb up to>7kb的至少5個(gè)不同的mRNAs。
實(shí)施例2 鼠的RAP-2的鑒別在TIGR建立的鼠EST收集品的相似的研究顯示1.6kb(鼠部分ID761011，圖3)部分的cDNA可能對(duì)應(yīng)小鼠RAP-2，因?yàn)槭聦?shí)上自始至終編碼區(qū)域同等于(95％)其人的相應(yīng)物(參見(jiàn)圖3)。
然而人和鼠的RAP-2和NEMO序列之間的不同延伸更遠(yuǎn)處，這可以明確地歸功于有規(guī)則的種中間的不同。事實(shí)上，與全長(zhǎng)人的變異體相比和與部分的鼠的序列相比來(lái)自鼠的RAP-2和NEMO序列的在20.4的249位置7個(gè)氨基酸的缺少的區(qū)段和在NEMO開(kāi)放的閱讀框的3氨基酸的插入物(在位置111的KLE)僅是最多的顯著的實(shí)施例(圖3)。然而這致使蛋白質(zhì)的活性功能消退。事實(shí)上報(bào)道的NEMO的功能屬性顯示人RAP-2中發(fā)現(xiàn)的情況相反，雖然對(duì)NEMO的分級(jí)分析證實(shí)它定位于signalsome。
實(shí)施例3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RIP結(jié)合到RAP-2在轉(zhuǎn)染的HEK-293T和HeLa細(xì)胞獲得RAP-2-RIP相互作用的生理學(xué)的關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步的證據(jù)。的確，如下面圖4B的各個(gè)泳道指示的來(lái)自轉(zhuǎn)染的HEK-293(ATCC No.CRL 1573)細(xì)胞的溶菌產(chǎn)物輕易地共沉淀和與抗-FLAG mAbs(Kodak)免疫沉淀這二個(gè)蛋白質(zhì)。然后采用常規(guī)的Westen印跡程序，用抗-His6 mAbs(Sigma)分析免疫復(fù)合物中組氨酸-RAP-2的存在[圖4(B)和數(shù)據(jù)未顯示]。然而，這樣的復(fù)合物的形成沒(méi)有致使酶的活性到我們通過(guò)體外復(fù)合物激酶測(cè)定可以判斷的程度，過(guò)量表達(dá)的RIP沒(méi)有磷酸化RAP-2(未顯示)。
進(jìn)行結(jié)合分析測(cè)試以測(cè)定是否RAP-2結(jié)合到任何其它的已知的胞內(nèi)信號(hào)形成蛋白質(zhì)。在這些測(cè)試中對(duì)蛋白質(zhì)TRADD)，MORT-1，p55-R，p75-R，MACH結(jié)合到RAP-2的能力進(jìn)行測(cè)試。但是，發(fā)現(xiàn)RAP-2不能結(jié)合到這些蛋白質(zhì)。RAP-2也沒(méi)有結(jié)合到任何的對(duì)照蛋白質(zhì)例如lamin，cyclin D。
因此所有上述的結(jié)果顯示新的RAP-2蛋白質(zhì)可能以非常特異的方式互相影響和同樣地代表RIP的特異的調(diào)節(jié)劑/調(diào)解劑。
實(shí)施例4 RAP-2與NIK的互相影響和控制NF-κB和c-Jun-依賴性轉(zhuǎn)錄盡管在顯示穩(wěn)定的形成該絡(luò)合物的酵母轉(zhuǎn)染的試驗(yàn)的HEK-293T哺乳動(dòng)物細(xì)胞的二個(gè)雜交測(cè)試中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RAP-2-NIK的相互作用。如實(shí)施例3描述探測(cè)NIK-RAP-2相互作用，只是將抗-FLAG抗體用于Western，接著以抗-His6免疫沉淀[圖4(C)]。酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間的這樣的差異不是令人驚訝的，當(dāng)在酵母中表達(dá)，全長(zhǎng)NIK易于放任結(jié)合屬性。
考慮事實(shí)相信RIP和NIK體內(nèi)是TNF-誘導(dǎo)NF-KB的活化的不可缺少的調(diào)節(jié)劑。我們檢查是否在細(xì)胞培養(yǎng)物中RAP-2的過(guò)量表達(dá)不能干涉特定的發(fā)信號(hào)途徑。在以報(bào)告者質(zhì)粒短暫的轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行開(kāi)始的實(shí)驗(yàn)組，所述的質(zhì)粒包含HIV-LTR基本啟動(dòng)子控制下的螢蟲(chóng)素酶基因。在類(lèi)似的設(shè)置，最初建立RAP-2下調(diào)，幾乎后退到基本的水平，由各種的已知的NF-κB誘導(dǎo)物涉及TNF的發(fā)信號(hào)(NIK，TRAF2，RIP等)的過(guò)量表達(dá)引起的報(bào)告者的活化和外部刺激[TNF和PMA，圖5(A)]對(duì)細(xì)胞的處理。以報(bào)道質(zhì)粒(對(duì)于NF-κB(5A)為HIVLTR-LUC或CMV-LUC，對(duì)于c-Jun(5B)激活實(shí)驗(yàn)為GAL4-LUC)，以對(duì)于所述的誘導(dǎo)劑的表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒(pcDNA3)或編碼全長(zhǎng)RAP-2的質(zhì)粒(pcRAP-2)臨時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。很明顯，事實(shí)是RAP-2能夠發(fā)揮其作用，直到下降信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能暗示該蛋白質(zhì)的部分的作用對(duì)各種，和分散的，信號(hào)形成途徑是共同的(參見(jiàn)上文)。同時(shí)，熒光酶的κB-獨(dú)立轉(zhuǎn)錄(CMA早期啟動(dòng)的啟動(dòng)子)不是矛盾的[圖5(A)]，因此我們相信可以控制由RAP-2的基本的轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)理的可能的重排。這些結(jié)果隨后在HeLa細(xì)胞中被證實(shí)(未顯示)。
但是，如進(jìn)一步的效價(jià)滴定分析顯示的，實(shí)際的現(xiàn)象更復(fù)雜，事實(shí)上，以各種量的pcRAP-2顯示于圖6，TRAF2臨時(shí)在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)，在低濃度(大約20納克/106細(xì)胞)時(shí)RAP-2急劇改變其行為，加強(qiáng)TRAF2 NF-κB誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[參見(jiàn)圖6(A)]。但是，通過(guò)以相反的方向代替原始的插入物，命名為RAP-2反義表達(dá)的載體，以各種不同量的pcRAP-2-a/s(反義)構(gòu)建體TRAF2被臨時(shí)地在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)，分析RAP-2的逐漸缺失的效果，導(dǎo)致做出濃度相關(guān)的圖。斜率的總的趨勢(shì)指示細(xì)胞的應(yīng)答大略與轉(zhuǎn)染的RAP-2DNA的量成反比，不同的是特性區(qū)域落在對(duì)應(yīng)于該蛋白質(zhì)的內(nèi)源性水平的“零”-點(diǎn)(圖6)。應(yīng)該注意到通過(guò)導(dǎo)入反義下調(diào)給定的基因的表達(dá)是更精確的，如與有義的過(guò)量表達(dá)相反。事實(shí)上，反義不參與細(xì)胞內(nèi)外來(lái)蛋白質(zhì)的人工生產(chǎn)，因此，清楚地對(duì)RAP-2抑制的能力的有效性在底下劃線。然而，應(yīng)該注意到上述的急變以低的濃度反映出，非倒轉(zhuǎn)地，圖表的反意的一半(圖6)。
為了估價(jià)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的多樣性，其中涉及RAP-2，我們改變?yōu)檠芯縞-Jun，一種核的因子，證明其在建立和維護(hù)適當(dāng)?shù)木o迫應(yīng)答的作用幾乎與NF-κB同樣重要的。利用商品化的“途徑探測(cè)”系統(tǒng)(Stratgene)的成份，在HEK-293T和HeLa細(xì)胞[參見(jiàn)圖5(B)和圖6(B)]我們證實(shí)與幾個(gè)的認(rèn)可的AP-1的活化劑相關(guān)的相似的二方面行為。
實(shí)施例5 RAP-2加強(qiáng)c-Jun超磷酸化，沒(méi)有改變JNK活性為了研究對(duì)轉(zhuǎn)錄具有深刻的作用的機(jī)理，測(cè)定正常的發(fā)信號(hào)破碎的精確的水平是必要的。公認(rèn)的c-Jun反式活化可能性是通過(guò)其氨基的末端的活化區(qū)域的二個(gè)絲氨酸殘基(63Ser&73Ser)的胞外信號(hào)誘導(dǎo)的磷酸化作用調(diào)節(jié)的。負(fù)責(zé)上面提到的磷酸化作用的JNK/SAPK蛋白質(zhì)激酶構(gòu)成MAP激酶族的遠(yuǎn)的子集，和其本身經(jīng)由進(jìn)一步的向上游雙重的特異性特異性激酶介導(dǎo)的激酶在183Thr和185Tyr磷酸化作用激活。因此，可以將c-Jun和JNKs內(nèi)的適當(dāng)?shù)奈恢玫牧姿峄饔糜米鳛榉瓷涞鞍踪|(zhì)的激活狀態(tài)的標(biāo)記。Western印跡分析以短暫的轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞的溶菌產(chǎn)物顯示，雖然c-Jun-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的削弱，RAP-2顯著地加強(qiáng)內(nèi)源的c-Jun在63Ser由許多刺激物誘導(dǎo)的磷酸化[見(jiàn)圖7(A)]。以指示的表達(dá)構(gòu)成物于與pcDNA3-載體一起轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞的總的細(xì)胞的溶菌產(chǎn)物由圖7表示，由負(fù)號(hào)(-)或在相同的圖中加號(hào)表示pcRAP-2，在SDS-PAGE上分離，轉(zhuǎn)移到ECL-膜和以抗-phospho-63Ser-c-Jun Abs(NEB)探測(cè)。顯示于圖7A的低的名單上的該膜以抗總的-c-Jun Abs作為對(duì)照重調(diào)查(NEB)。
然而，c-Jun總的量保持c-Jun的水平持穩(wěn)的提高作為可能的修飾來(lái)源。特異于JNK1/2的磷酸化形式的抗體，沒(méi)有探測(cè)到以RAP-2過(guò)量表達(dá)的活化的激酶的量有實(shí)質(zhì)上的增加，顯示c-Jun的附加的磷酸化作用沒(méi)有產(chǎn)生于RAP-2-依賴性的提高的JNKs活性[圖7(B)]。由Western印跡的有總的phospho-(183Thr/185Tyr)-JNKAbs(NEB)的溶菌產(chǎn)物如圖7顯示的，探測(cè)來(lái)自以hrTNFα活化JNK1/2處理的pCDNA3或pcRAP-2轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞的活化的JNK1/2細(xì)胞遞增的時(shí)期。
在后一觀念的進(jìn)一步的支持，以免疫沉淀的JNK1和凈化的GST-c-Jun作為反應(yīng)物進(jìn)行體外激酶試驗(yàn)本質(zhì)上產(chǎn)生相同的結(jié)果[圖7(C)]。以空載體，pcRAP-2和pcRIP以各種的與HA-JNK1-表達(dá)質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞經(jīng)由起N-末端HA-tag免疫沉淀和通過(guò)32P-incorporation in an in vitro kinase assay測(cè)定其細(xì)菌磷酸化產(chǎn)生凈化GST-Jun的能力。通過(guò)SDS-PAGE分析反應(yīng)產(chǎn)物，如顯示于圖7。
當(dāng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞免疫沉淀RAP-2-IKK1絡(luò)合物，將該絡(luò)合物在體外磷酸化作用情況下培養(yǎng)，RAP-2變成磷酸化。RAP-2的磷酸化作用的功能的作用的研究顯示在該蛋白質(zhì)(在位置148)家族的特定的絲氨酸的突變?nèi)∠鸍un磷酸化作用的活化。如圖13闡明的，當(dāng)野生的型RAP-2的過(guò)量表達(dá)致使Jun磷酸化作用對(duì)RAP-2過(guò)量表達(dá)的大量的增加，(S148A)這完全沒(méi)有影響Jun的磷酸化作用。可是RAP2對(duì)NF-KB的影響完全沒(méi)有受該突變的影響。這些調(diào)查結(jié)果顯示RAP-2的絲氨酸148的磷酸化作用特定地涉及其對(duì)JUN磷酸化作用的效果。
實(shí)施例6 RAP-2不抑制c-Jun和ReIA結(jié)合到DNA考慮事實(shí)實(shí)施例5報(bào)道的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有顯示NF-κB和AP-1發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)的RAP-2過(guò)量表達(dá)的胞質(zhì)調(diào)節(jié)的目標(biāo)，我們調(diào)查核的過(guò)程的完整性是轉(zhuǎn)錄必需的。用轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞的核的提取液進(jìn)行的電子遷移率變化分析(EMSA)明確的證明RAP-2沒(méi)有干擾c-Jun和RelA結(jié)合到對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)的識(shí)別序列的寡聚核苷酸(圖8)。事實(shí)上，覺(jué)察到RAP-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中DNA/AP-1復(fù)合物形成的效力增加幾倍。此外，在RAP-2和c-Jun/RelA之間沒(méi)有觀察到相互作用導(dǎo)致后者的活化區(qū)域空間障礙。這暗示RAP-2進(jìn)入核的作用在增強(qiáng)子結(jié)合出現(xiàn)的下游的某些位置被靶擊。
實(shí)施例7 RAP-2與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60的體內(nèi)相互作用TIP60(Gene Bank U 74667)屬于最近描述的核蛋白質(zhì)的家族，被稱為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)。這些蛋白質(zhì)的酶的活性與核小體復(fù)合體的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)有關(guān)。HATs經(jīng)常地與轉(zhuǎn)錄裝置的某一個(gè)的元件關(guān)聯(lián)，和有能力調(diào)制轉(zhuǎn)錄的速率。通過(guò)借助于將乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白的賴氨酸殘基在鄰近開(kāi)始時(shí)放松染色質(zhì)HATs作用。從而促進(jìn)各種的有關(guān)的因子進(jìn)入DNA。顯然這些輔助核蛋白質(zhì)之一想要促進(jìn)增強(qiáng)子結(jié)合因子和DNA聚合酶II之間的交叉交談。我們因此調(diào)查是否TIP60與RAP-2復(fù)合。來(lái)自HeLa細(xì)胞的免疫沉淀，隨后進(jìn)行兩個(gè)雜交測(cè)試結(jié)論性顯示RAP-2與TIP60在兩個(gè)系統(tǒng)中激烈地互相影響。然而，根據(jù)在HEK-293T細(xì)胞中的共表達(dá)，我們沒(méi)有能夠看到RAP-2介導(dǎo)的對(duì)NF-κB和c-Jun的影響的相當(dāng)?shù)母淖儭Ｔ诳刂圃囼?yàn)中即刺激TIP60(w/oRAP-2)觀察的同樣地失去變化，產(chǎn)生結(jié)論短的時(shí)間讀出(轉(zhuǎn)染之后20-30小時(shí))或許排除報(bào)道DNA進(jìn)入變成染色質(zhì)化的機(jī)會(huì)，沒(méi)有剩下足夠的時(shí)間以便HAT-相似的酶起作用。
實(shí)施例8 克隆#10-與RAP-2相互制約新的蛋白質(zhì)在B-細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中的兩個(gè)雜交篩選中作為餌的全長(zhǎng)RAP-2蛋白質(zhì)，我們已經(jīng)分離與表示為RAP-2的下文的克隆#10或克隆#10-編碼的蛋白質(zhì)或RAT-結(jié)合的蛋白質(zhì)#10或RBP-10(圖10)。相互制約的新的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)原始的克隆(約2.2kb)編碼表面上的MW為60kDa的假定的多肽。然而，推定的ATG最初的密碼子顯然地從該序列遺失的。盡管其相當(dāng)大的長(zhǎng)度，因此獲得的cDNA進(jìn)一步向5’末端擴(kuò)大以重新構(gòu)成整個(gè)開(kāi)放讀框。
克隆#10的結(jié)合全部技能的二個(gè)雜種測(cè)定顯示除RAP-2之外該蛋白質(zhì)具有與TRAP2的相當(dāng)強(qiáng)烈的親合力?？寺?10沒(méi)有結(jié)合到RIP，TRADD，MORT1，MACH，TNFR-I，TIP60和NIK以及結(jié)合到幾個(gè)對(duì)照蛋白質(zhì)(例如核纖層蛋白(lamin)和細(xì)胞周期蛋白(cyclin))。但是可以排除克隆#10與NIK的結(jié)合可以存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，考慮到行為在酵母中的怪癖。證明克隆#10在后者的C-末端的200各氨基酸內(nèi)結(jié)合到RAP-2，即與RIP，TIP60，NIK和IKKβ結(jié)合不是必要的區(qū)域。
克隆#10與TRAF-2在哺乳動(dòng)物中293T細(xì)胞中的共表達(dá)阻止TRAF2-介導(dǎo)的NF-κB的激活，而克隆#10與NIK的共表達(dá)被后者強(qiáng)有力地提高了NF-κB的活化。這些調(diào)查結(jié)果指示克隆#10的重要的調(diào)節(jié)功能。觀察到的不同的調(diào)節(jié)作用或許暗示細(xì)胞內(nèi)存在不同的非重疊的蛋白質(zhì)作用地點(diǎn)。
對(duì)GenBank的數(shù)個(gè)目標(biāo)在識(shí)別接近的RBP-10-同系物的巡回搜查導(dǎo)致產(chǎn)生識(shí)別F40F12.5(登記入冊(cè)號(hào)S42834)-來(lái)自C.Elegans的hypotetical的蛋白質(zhì)，其中指派沒(méi)有生理學(xué)的作用。有趣的，發(fā)現(xiàn)F40F12.5顯示與廣泛地保受的泛素-指導(dǎo)的蛋白酶家族的幾個(gè)成員有相似性。這些酶平衡了ubiquitination機(jī)器的破壞的作用，已知它指控細(xì)胞中的大半蛋白質(zhì)降解。而泛素連接酶負(fù)責(zé)將聚-泛素樹(shù)狀物結(jié)合到預(yù)定降解的蛋白質(zhì)，泛素蛋白酶阻止成長(zhǎng)的樹(shù)狀物有效的發(fā)枝。然而基于蛋白酶與上面的泛素指導(dǎo)的蛋白酶的類(lèi)似性的F40F12.5的功能的這樣的推測(cè)似乎是可疑的，同樣地還沒(méi)有檢測(cè)是否特定的蛋白質(zhì)具有對(duì)泛素聚合物的酶活性，此外，一對(duì)觀點(diǎn)似乎完全不太可能發(fā)生這樣的巧合a)據(jù)認(rèn)為在泛素蛋白酶的亞綱中構(gòu)成核心催化區(qū)域的殘基在F40F12.5，和在RBP-10中都不是保守的；b)除了起源各種的泛素指導(dǎo)蛋白酶家族的酶的催化的位點(diǎn)(從細(xì)菌到人)事實(shí)上沒(méi)有顯示序列類(lèi)似處，而F40F12.5和克隆#10顯示可靠的程度的同源性。
實(shí)施例9 克隆#84RAP-2的相互制約的蛋白質(zhì)通過(guò)應(yīng)用在B-細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中的兩個(gè)雜交篩選中作為餌的全長(zhǎng)RAP-2蛋白質(zhì)，我們已經(jīng)分離了另外的RAP-2的結(jié)合的蛋白質(zhì)，并稱為克隆#84。
發(fā)現(xiàn)克隆#84特定地結(jié)合到全長(zhǎng)RAP-2，而與其它分析的蛋白質(zhì)TRAF2，MORT1，TRADD，RIP，NIK，TIP60和核纖層蛋白沒(méi)有顯示相互作用。發(fā)現(xiàn)克隆#84的部分5′-序列完全相同于編碼細(xì)胞生長(zhǎng)受控制的蛋白質(zhì)CGR19的先前克隆的cDNA序列，識(shí)別為在攜帶功能的p53蛋白質(zhì)的(Madden S.等人1996，登記入冊(cè)#U66469)細(xì)胞中特定地向上調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物。序列分析的CGR19導(dǎo)致在其-末端區(qū)域識(shí)別了C3HC4-Zink指基序(也稱為RING指)。發(fā)現(xiàn)CGR19的表達(dá)抑制幾個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)。通過(guò)結(jié)合到RAP-2在NF-κB的調(diào)節(jié)中CGR19的蛋白質(zhì)的牽連可能由TNF-R家族的成員調(diào)節(jié)細(xì)胞周期受控制的網(wǎng)絡(luò)。
實(shí)施例10 RAP-2的結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系A(chǔ).結(jié)合區(qū)域通過(guò)使用連續(xù)的缺失分析，對(duì)RAP-2內(nèi)的結(jié)合區(qū)域作圖和識(shí)別了RIP，NIK，TIP60-結(jié)合以及自我關(guān)聯(lián)區(qū)域(圖11)。
已經(jīng)對(duì)結(jié)合到RIP的RAP-2蛋白質(zhì)的區(qū)域作圖，該區(qū)域位于氨基酸177-218之間和在氨基酸264結(jié)束。
至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IKKβ和NIK結(jié)合位置(氨基酸95-264)和(氨基酸1-264)各自地在RAP-2內(nèi)重疊RIP’s結(jié)合位點(diǎn)RAP-2(圖11)。
顯然地結(jié)合到TIP60在橫跨氨基酸95-264的區(qū)域作圖。與橫跨氨基酸95-309的缺失片段相互作用大多數(shù)的有可能是屬于特定的缺失的特異的妨礙物構(gòu)象的結(jié)果。
可以注意到在結(jié)合到缺失片段其結(jié)合到克隆#10和結(jié)合到自我關(guān)聯(lián)的RAP-2的相似的差異。然而與TIP60相反，事實(shí)是全長(zhǎng)RAP-2結(jié)合到含有氨基酸218-416的缺失片段以及包含氨基酸1-264的缺失片段，暗示涉及最高的二聚化的區(qū)域定位于氨基酸217-264之間。
由克隆#10編碼的蛋白質(zhì)，具有上述的例外，顯然地結(jié)合在開(kāi)始于氨基酸218-309區(qū)域和終止在氨基酸416，因此，其結(jié)合位點(diǎn)可以包含具有RIP，NIK，IKKβ和TIP60(圖11)的結(jié)合位點(diǎn)的重疊區(qū)域。
B.功能的區(qū)域我們現(xiàn)在知識(shí)的程度，在同樣的區(qū)域?qū)AP-2的所有的功能作圖(稱為NF-κB抑制和誘導(dǎo)c-Jun的超磷酸化作用)(圖11)。
此外，可能通過(guò)所有的用于實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)物的發(fā)信號(hào)的有效的調(diào)節(jié)的區(qū)域定位于該蛋白質(zhì)片斷的N-末端。
由氨基酸95-416包括的區(qū)域有效果，雖然與由完整的蛋白質(zhì)引起相比明顯更弱，因此由內(nèi)源的RAP-2的聚集產(chǎn)生的。
而且，除了RelA，用于實(shí)驗(yàn)的所有的誘導(dǎo)物的作用由小到約RAP-2的100個(gè)N-末端的氨基酸介導(dǎo)的。事實(shí)上，包括氨基酸1-102個(gè)的片段介導(dǎo)不同的作用，盡管相當(dāng)?shù)剡m度的[圖12(B)]。
另一方面，RelA的成功的誘導(dǎo)需要更長(zhǎng)部分的RAP-2蛋白質(zhì)。至今我們規(guī)定該區(qū)域氨基酸1-264之間的分界線，表面上賦予具有一部分特定的ReIA-關(guān)聯(lián)的結(jié)合屬性的氨基酸157-264之間的區(qū)域。
C.結(jié)合-功能的關(guān)系根據(jù)顯示于圖11和圖12的結(jié)果，它似乎a)除了RelA，對(duì)于該蛋白質(zhì)的功能，結(jié)合到RIP的RAP-2，克隆#10和最大可能結(jié)合到NIK和TIP60不必需的，作為過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)的NF-κB的抑制物。
b)RAP-2對(duì)ReIA過(guò)量表達(dá)的誘導(dǎo)活化的作用明顯地至少部分地由不同的結(jié)合事件介導(dǎo)的。本質(zhì)上，發(fā)現(xiàn)所有的上述的蛋白質(zhì)可以有助于約定的活性，例如從至今進(jìn)行的試驗(yàn)推論的。
RAP-2和RIP之間的相互作用的精確的位置至今有待測(cè)定，但是似乎該位置是特異于RIP和RAP-2，和不與其它的已知的于RIP互相影響的蛋白質(zhì)例如MORT-1，TRADD，F(xiàn)AS-R和可能也TRAF2(見(jiàn)Malinin等人，1997)共享，也出現(xiàn)(根據(jù)序列分析和與上述的不同的數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)RAP-2沒(méi)有‘死亡區(qū)域’，MORTMODULE，一個(gè)蛋白酶區(qū)域(例如ICE/CED3基序)，激酶區(qū)域/基序/沒(méi)有TRAF區(qū)域。在該線路，生物學(xué)的活性分析也顯示RAP-2明顯具有下列的特性(i)當(dāng)過(guò)量表達(dá)，RAP-2由TNF或由TRADD，RIP，TRAF-2，NIK或p65 NF-κB亞單位強(qiáng)有力地抑制NF-κB的活化，(ii)RAP-2加強(qiáng)c-Jun超磷酸化作用，沒(méi)有變更JNK的活性。
(iii)如缺失分析顯示的RAP-2不需要RIP的死亡區(qū)域，也不需要RIP的激酶活性以便結(jié)合到RIP；(iv)基于上述的缺失分析，RAP-2結(jié)合到RIP的區(qū)域被縮減到200個(gè)氨基酸的N-末端區(qū)域；(v)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，而不是在酵母中RAP-2結(jié)合到NIK。
考慮上述的RAP-2似乎是非常特異的RIP結(jié)合蛋白質(zhì)和因此RIP調(diào)節(jié)劑/調(diào)解劑有可能的涉及RIP-介導(dǎo)的胞內(nèi)的發(fā)信號(hào)途徑。
基于上述的結(jié)論，顯示RAP-2參與RIP活性的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)。胞內(nèi)地，這些RIP參與細(xì)胞存活途徑(NF-κB活化，可能經(jīng)由與TRAF2的相互作用)和參與炎癥和細(xì)胞死亡途徑(獨(dú)立地經(jīng)由其‘死亡區(qū)域’或經(jīng)由與其它的蛋白質(zhì)例如MORT-1，TRADD，p55-R，F(xiàn)AS-R和關(guān)聯(lián)的蛋白酶的相互作用和例如MACH，Mch4，G1等)。其中RAP-2可以調(diào)制/介導(dǎo)RIP活性的可能的方法在上文詳細(xì)的描述。例如RAP-2-RIP的相互作用可以導(dǎo)至細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活途徑的增強(qiáng)，或可以引導(dǎo)細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活途徑的抑制，該加強(qiáng)或抑制可能依賴于這些二個(gè)相反的胞內(nèi)的途徑的有關(guān)的其它的成員的活性。RAP-2也可以具有入塢蛋白質(zhì)的作用以提供RIP分子和其它的RIP-或RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)的聚集，基于細(xì)胞中這些途徑的其它的成員的活性量，其聚集體然后在細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活(或甚至兩者)的方向具有功能。
實(shí)施例11 抗RAP-2的多克隆抗體的制備最初以5微克RAP-2的純的制劑皮下注射兔子，該制劑由RAP-2乳化于完全的Freund助劑獲得的。三個(gè)星期以后，以5微克RAP-2的純的制劑皮下又注射兔子，該制劑由RAP-2乳化于不完全的Freund助劑獲得的，以10天的間隔注射另外的二個(gè)溶解于PBS的RAP-2。在最后的免疫之后10天從兔子取血。接著以放射性免疫法顯示抗體水平。將125I-標(biāo)志的RAP-2與兔子血清的各種的稀釋物(1∶50，1∶500，1∶5,000和1∶50,000)混合。在總的體積200微升中添加蛋白質(zhì)-G瓊脂糖珠子(20微升，Pharmacia)的懸浮液。在室溫下將該混合物放置1小時(shí)，然后洗滌珠子3次，計(jì)數(shù)被束縛的放射性。將抗人瘦素(leptin)的兔子抗血清用作為陰性的對(duì)照，與陰性的對(duì)照相比測(cè)定RAP-2的效價(jià)。
實(shí)施例12 抗RAP-2的單克隆抗體的制備首先以2微克的完全的Freund助劑的乳劑的確凈化RAP-2注射雌性動(dòng)物Balb/C老鼠(3個(gè)月大)，和三個(gè)星期以后，以不完全的Freund助劑皮下注射，以10天的間隔以溶解于PBS的另外的三個(gè)皮下注射。在融合到小鼠之前4天和3天腹膜內(nèi)的最后的增加注射，如IRIA測(cè)定的顯示最高的結(jié)合效價(jià)(參見(jiàn)下文)。使用從作為融合伙伴的動(dòng)物的脾臟和淋巴結(jié)準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞系和淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合。將融合的細(xì)胞分布到微培養(yǎng)盤(pán)，和在補(bǔ)充了HAT和15％馬血清的DMEM中挑選雜交瘤，和被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗RAP-2的抗體的雜交瘤經(jīng)過(guò)限制的稀釋方法亞克隆和注射到Balb/C老鼠，該老鼠已經(jīng)以姥鮫烷灌注以便產(chǎn)生腹水。使用商用的ELISA試劑盒規(guī)定抗體的同位型(Amersham，UK)。
如下進(jìn)行對(duì)產(chǎn)生抗RAP-2的單克隆抗體的雜交瘤的篩選經(jīng)過(guò)倒置固體相放射免疫測(cè)定法(IRIA)測(cè)試雜交瘤上層清液中存在的抗RAP-2抗體。以Talon-純化的IL-18BPa-His6(10微克/ml，100微升/well)包被ELISA板(Dynatech Laboratories，Alexandria，VA)。在4度孵育整夜之后，以含有BSA(0.5％)和Tween20(0.05％)的PBS洗滌平板兩次，封閉于洗滌溶液最少2小時(shí)，37度，添加雜交瘤培養(yǎng)物上層清液(100微升/well)和將該平板在37℃培養(yǎng)4小時(shí)。洗滌該平板3次和在室溫下添加山羊-抗-小鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP，Jackson Labs，1∶10,000，100微升/well)的軛合物2小時(shí)。將平板洗滌4次和由ABTS(2，2′-azino-bis(3-ethyibenzthiazoline-6-sulfonicac acid，Sigma)和H2O2作為底物顯色。由自動(dòng)的ELISA閱讀器讀取該平板。比陰性的對(duì)照值至少高5倍的獲得OD的樣品被認(rèn)為陽(yáng)性的。
采用親合層晰將RAP-2抗體用于純化RAP-2。
實(shí)施例13 ELISA測(cè)試在4℃以抗-RAP-2單克隆抗體(沒(méi)有血清的雜交瘤上清液或腹水液體免疫球蛋白)包被微滴板(Dynatech或Maxisorb byNunc)。以含有BSA(0.5％)和Tween20(0.05％)的PBS洗滌平板，封閉于相同的溶液最少2小時(shí)，37度，加入到wells(100微升/well)4小時(shí)，37℃，將該平板以含有Tween20(0.05％)的PB S洗滌3次。在4度添加抗-RAP-2血清(1∶1000，100微升/well)以進(jìn)一步的孵育過(guò)夜，將該平板洗滌3次，在室溫下添加山羊-抗-小鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP，Jackson Labs，1∶10,000，100微升/well)的軛合物2小時(shí)。將平板洗滌4次和由ABTS(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，Sigma)和H2O2作為底物顯色。由自動(dòng)的ELISA閱讀器讀取該平板。
現(xiàn)在全部描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)寬的范圍的等價(jià)物的參數(shù)，濃度和情況同樣可以進(jìn)行，不背離發(fā)明的精神和范圍和沒(méi)有過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明時(shí)，可對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步修飾。通常按照本發(fā)明的原則計(jì)劃將該申請(qǐng)覆蓋本發(fā)明的任何的變化，使用，或適應(yīng)和包括偏離本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，如本領(lǐng)域內(nèi)已知的或習(xí)慣的實(shí)踐，其中涉及本發(fā)明和如可以應(yīng)用到，根據(jù)下文的附加權(quán)利要求的范圍上文提出的必要的特性。
在此處記載的所有的參考，包括雜志文章或摘要，公開(kāi)的或?qū)?yīng)的美國(guó)或由美國(guó)授權(quán)的外國(guó)的專(zhuān)利申請(qǐng)或其它的參考全部引入本文作為參考，包括在記載的參考中的所有的資料，表格，圖形和正文。另外，在記載于本文的參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
參照已知的方法步驟，常規(guī)的方法步驟，已知的方法或常規(guī)的方法不準(zhǔn)許以任何的方法公開(kāi)，教導(dǎo)或建議本發(fā)明的任何的方面，說(shuō)明書(shū)或?qū)嵤├?br> 前面描述的具體實(shí)施例充分地顯示本發(fā)明全面的本性，通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的知識(shí)包括所附的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容易于修飾和/或適應(yīng)各種的應(yīng)用的具體的實(shí)施例，不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)，不背離本發(fā)明的一般概念。因此，計(jì)劃將這樣的適應(yīng)和修飾包括在公開(kāi)的實(shí)施例的意義和范圍的同等物，基于本文描述的教導(dǎo)和指導(dǎo)。將會(huì)理解本文的措辭或術(shù)語(yǔ)是為了描述的目的，不是為了限制發(fā)明，因此本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)或措辭由熟練的技工根據(jù)本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)進(jìn)行解釋。
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<150>IL123758<151>1998-03-19<150>IL126024<151>1998-09-01<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2009<212>DNA<213>人<400>1gaagattcca ttgtgggcct gsgaggccta gcaagggcgg accgcgaaac tgggactttt 60ttcggagcgc cggggcccta ccagcgttca cagtccgccg ctcccaccct tctcacgtct 120gacggactct gctgacagcc cttgccctgt tggatgaata ggcacctctg gaagagccaa 180ctgtgtgaga tggtgcagcc cagtggtggc ccggcagcag atcaggacgt actgggcgaa 240gagtctcctc tggggaagcc agccatgctg cacctgcctt cagaacaggg cgctcctgag 300accctccagc gctgcctgga ggagaatcaa gagctccgag atgccatccg gcagagcaac 360
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1.編碼RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列，所述的RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到RAP-2，所述DNA序列包含圖10所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，編碼能夠調(diào)節(jié)/介導(dǎo)RAP-2功能的蛋白質(zhì)。
3.RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠結(jié)合到RAP-2和/或調(diào)節(jié)/介導(dǎo)RAP-2的功能。
4.分離和鑒別能夠結(jié)合到RAP-2蛋白質(zhì)的方法，包括應(yīng)用酵母兩個(gè)雜交程序，其中編碼所述RAP-2的序列由一個(gè)雜交載體攜帶，來(lái)自于cDNA或基因組DNA文庫(kù)的序列由第二個(gè)雜交載體攜帶，然后將載體用于轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，且陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞被分離，隨后通過(guò)提取所述的第二個(gè)雜交載體以獲得編碼結(jié)合到所述的RAP-2上的蛋白質(zhì)的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)在制備用于調(diào)節(jié)/介導(dǎo)RAP-2的功能的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述RAP-2結(jié)合蛋白質(zhì)由包含圖10所示序列的DNA序列編碼。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的蛋白質(zhì)，能在炎癥、細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡途徑中調(diào)節(jié)/介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的RIP活性。本發(fā)明還提供編碼它的DNA，它的生產(chǎn)方法和用途。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1743456SQ20051008869
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期1999年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月19日
發(fā)明者大衛(wèi)·沃勒克, 安德烈·科瓦連科 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究發(fā)展有限公司