專利名稱：：中國倉鼠凋亡相關基因的制作方法中國倉鼠凋亡相關基因領域本發(fā)明涉及生物技術(shù)和分子生物學領域。本發(fā)明特別涉及來自中國倉鼠(Chinesehamster)(CWce/w/wsgn'se船)的新的基因，所述基因涉及凋亡過程的介導。背景隨著人類基因組計劃的完成，每天都發(fā)現(xiàn)更多具有治療潛力的蛋白質(zhì)。許多這些新的生物治療劑常常需要開發(fā)高產(chǎn)的生產(chǎn)過程來滿足全球的需求。用于復雜的治療性生物產(chǎn)品生產(chǎn)的最常用的細胞系之一是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其最初來源于中國倉鼠。然而，中國倉鼠的基因組很少被表征，特別是，缺少對該有才幾體中控制生理學上重要的過程的基因的了解。美國專利號6,562,797描述了稱為FADD的純化的哺乳動物蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合Fas受體的細胞質(zhì)區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的能力。這個文件還描述了調(diào)節(jié)FAS相關的凋亡的方法。然而，所公開的唯一的序列是人類來源的。美國專利號6,683，168和美國專利申請公開號US2004/0121389描述了許多形式的FAIM序列的序列短的、長的、超長的和肺癌相關的。所述序列是人類和小鼠序列。美國專利號6,544,523列出了編碼Fas配體的DNA的序列。美國專利號6,451,759描述了這種配體的非可裂解形式。概述我們首次描述了中國倉鼠(CWce化/wsgr/化iw)FAIM、FADD、PDCD6和Requiem的序歹'J。根據(jù)本發(fā)明的第l方面，我們提供了包含選自以下的序列的分離的多肽，所述分離的多肽能夠介導細胞的凋亡(a)與SEQIDNO:1所示序列具有至少97%的序列同一性的cgFAIM序列；(b)與SEQIDNO:2所示序列具有至少69%序列同一性的cgFADD序列；(c)與SEQIDNO:3所示序列具有至少89%序列同一性的cgPDCD6序列；(d)與SEQIDNO:4所示序列具有至少90%序列同一性的cgRequiem序列;(e)以上(a)到(d)的任一項的至少15個連續(xù)殘基的片段的序列。根據(jù)本發(fā)明的第2方面，提供了包含能夠介導細胞凋亡的中國倉鼠序列的分離的多肽，所述序列選自SEQIDNO:1所示的cgFAIM序列；SEQIDNO:2所示的cgFADD序列；SEQIDNO:3所示的cgPDCD6序列；和SEQIDNO:4所示的cgRequiem序列。根據(jù)本發(fā)明的第1方面，我們提供了包含能夠介導細胞的凋亡的中國倉鼠序列的分離的多肽，所述序列選自SEQIDNO:1所示的cgFAIM序列；SEQIDNO:2所示的cgFADD序列；SEQIDNO:3所示的cgPDCD6序列;和SEQIDNO:4所示的cgRequiem序列。根據(jù)本發(fā)明的第2方面，提供了包含選自以下的序列的分離的多肽(a)與SEQIDNO:1所示序列具有至少97%序列同一性的egFAIM序列；(b)與SEQIDNO:2所示序列具有至少69%序列同一性的cgFADD序列；(c)與SEQIDNO:3所示序列具有至少89%序列同一性的cgPDCD6序列；(d)與SEQIDNO:4所示序列具有至少90%序列同一性的cgRequiem序列；(e)以上(a)到(d)的任一項的至少15個連續(xù)殘基的片段的序列。根據(jù)本發(fā)明的第3方面，我們提供了包含序列的分離的多核苷酸，所述序列編碼所列出的多肽，其中所述序列優(yōu)選的選自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8組成的組。作為本發(fā)明的第4方面，提供了包含選自以下的序列的分離的多核苷酸，或與其互補的序列，其能夠在嚴謹條件下與其雜交，或作為遺傳密碼結(jié)果的其簡并序列(a)與SEQIDNO:5所示序列具有90%或更高序列同一性的cgFAIM序列；(b)與SEQIDNO:6所示序列具有90%或更高序列同一性的cgFADD序列；(c)與SEQIDNO:7所示序列具有93%或更高序列同一性的cgPDCD6序列；(d)與SEQIDNO:8所示序列具有89%或更高序列同一性的cgRequiem序列；(e)以上(a)到(d)的任一項的至少15個連續(xù)殘基的片段的序列。根據(jù)本發(fā)明的第5方面，我們提供了表達序列，其包含與調(diào)控序列可操作連接的如上列出的多核苷酸或其部分，所述調(diào)控序列能夠指導所述多核苷酸的表達。優(yōu)選的，這種表達序列是表達載體。在第6方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)如上列出的多核苦酸的載體，當暴露于細胞時，所述載體能夠調(diào)節(jié)細胞的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6或cgRequiem的表達。優(yōu)選的，所述載體包含中國倉鼠FAIM序列或其部分，所述載體能夠?qū)е录毎衏gFAIM，優(yōu)選pcDNA3.1(+)FAIM(SEQIDNO:37)的增量調(diào)節(jié)。優(yōu)選的，所述載體包含中國倉鼠FADD序列或其部分，所述載體能夠?qū)е录毎衏gFADD,優(yōu)選pcDNA3.1(+)FADDDN(SEQIDNO:38)的減量調(diào)節(jié)。優(yōu)選的，所述載體包含中國倉鼠PDCD6序列或其部分，所述載體能夠?qū)е录毎衏gPDCD6，優(yōu)選pSUPER.neo.PDCD6siRNA(SEQIDNO:39)的減量調(diào)節(jié)。優(yōu)選的，所述載體包含中國倉鼠Requiem序列或其部分，并能夠?qū)е录毎鹀gRequiem,優(yōu)選pSUPER.neo.R叫uiemsiRNA(SEQIDNO:40)的減量調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的第7方面，提供了包含所描述的表達序列或所描述的載體的細胞，其中所述表達序列優(yōu)選已被轉(zhuǎn)化到所述細胞中。根據(jù)本發(fā)明的第8方面，我們提供了包含如所列的多肽、如所列的多核香酸、如所列的表達序列、如所列的載體或如所列的細胞，連同藥學上可接受的運載體(carrier)或稀釋劑的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的第9方面，我們提供了生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)提供包含如所列的多核苷酸序列和調(diào)控序列的表達序列，其中所述調(diào)控序列能夠指導所述多肽從所述多核苷酸序列的表達，(b)容許在所述調(diào)控序列的控制下從所述表達序列表達所述多肽，以及(c)任選的純化所述多肽。優(yōu)選的，所述表達序列包含轉(zhuǎn)染到細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞中的表達載體，以容許所述多肽-波所述細胞表達。根據(jù)本發(fā)明的第10方面，提供了一種方法，包括在細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞中調(diào)節(jié)，優(yōu)選增量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:l所示序列的cgFAIM多肽或具有SEQIDNO:5所示序列的cgFAIM多核苷酸的表達。作為本發(fā)明的第11方面，我們提供了一種方法，包括在細胞中，伊C選的中國倉鼠細胞中，調(diào)節(jié)，優(yōu)選的減量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:2所示序列的cgFADD多肽、具有SEQIDNO:3所示序列的cgPDCD6多肽或具有SEQIDNO:4所示序列的cgR叫uiem多肽，或者具有SEQIDNO:6所示序列的cgFAIM多核苷酸、具有SEQIDNO:7所示序列的cgPDCD6多核苷酸或具有SEQIDNO:8所示序列的cgRequiem多核苷酸的表達。優(yōu)選的，所述方法包括使如所列的載體暴露于細胞，優(yōu)選的用所述載體轉(zhuǎn)染所述細胞。根據(jù)本發(fā)明的第12方面，我們提供了一種細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞，其已被修飾，優(yōu)選的被遺傳工程化，以與沒有被如此修飾的細胞相比，增量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:1所示序列的多肽或具有SEQIDNO:5所示序列的多核苷酸的表達。根據(jù)本發(fā)明的第13方面，我們提供了一種細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞，其已被修飾，優(yōu)選的被遺傳工程化，以與沒有被如此修飾的細月包相比，減量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列的多肽或具有SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示序列的多核苷酸的表達。根據(jù)本發(fā)明的第14方面，提供了一種細胞系，其包含所描述的細胞，或其后代，優(yōu)選的中國倉鼠細胞系。根據(jù)本發(fā)明的第15方面，我們提供了一種細胞培養(yǎng)物，其包含所描述的細胞，或其后代，或所描述的細胞系。根據(jù)本發(fā)明的第16方面，我們提供了包含所描述的細胞，或其后代的轉(zhuǎn)基因非人類動物，優(yōu)選的中國倉鼠。優(yōu)選的，與其中所述多肽的表達不被如此調(diào)節(jié)的細胞相比，(i)細胞的細胞生存力被提高或增強，優(yōu)選其中細胞的凋亡被降低；(ii)細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，優(yōu)選的重組表達的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量被提高或增強；和/或(iii)細胞表達的蛋白的糖基化、優(yōu)選的唾液酸化作用被提高或增強。根據(jù)本發(fā)明的第17方面，我們提供了如所列方法、如所列細胞、如所列細胞系、如所列細胞培養(yǎng)物、或如所列轉(zhuǎn)基因非人動物的用途，用于蛋白質(zhì)、優(yōu)選的異源蛋白質(zhì)、更優(yōu)選的從外源導入的序列，最優(yōu)選的重纟且蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的第18方面，我們提供了生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括提供如所列的細胞，用能夠表達所述重組蛋白質(zhì)的表達載體轉(zhuǎn)染所述細胞，并引起所述細胞中的重組蛋白表達。根據(jù)本發(fā)明的第19方面，我們提供了包含具有SEQIDNO:9的cgFADD顯性陰性序列的多肽，或能夠編碼這種多肽的多核苷酸，優(yōu)選的SEQIDNO:10,或其片段、同源物、變體或衍生物。作為本發(fā)明的第20方面，我們提供了多肽，優(yōu)選的重組蛋白質(zhì)，更優(yōu)選的干擾素Y,可通過根據(jù)本發(fā)明的第17或第18方面的方法產(chǎn)生，與可從不被如此修飾的細胞產(chǎn)生的多肽相比，所述多肽具有提高的唾液酸化作用。優(yōu)選的，所述唾液酸化作用大于2.9mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽，優(yōu)選的約3.5mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的進一步特別的和優(yōu)選的方面在附隨的獨立和從屬權(quán)利要求中列出。從屬權(quán)利要求的特征可以酌情與獨立權(quán)利要求的特征組合，并且與未在權(quán)利要求中明確列出的特征組合。除非另有陳述，本發(fā)明的實踐將采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，所有這些都處在本領域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)已經(jīng)在文獻中說明了。參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989，Afo/ecw/a/"C7om'"g:j丄a6orato/^Afawwa/,SecondEdition,Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CM^rewf/Votoco/sz."她/ecw/arB/o/ogy，ch.9,13，and16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996，Z)福Zso/加'o"S^we腦Vzg.,j&se"""/rec/7m々wM，JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJamesO'D.McGee,1990,/"幼w砂6廠W2:a"0":尸〃'腦》fes朋dPrac"ce;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor)，1984，0//go"wc/eo"'(iejS聲/ze57's..7Vac"ca/j，raac/2,IrlPress;D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992,Afe//zo<is0/五w27mo/ogy:Z)iV/4Sfrwc/^re戶aW爿Sy/^/zew's尸/;戸'ca/Jw"/，、q/"￡WJMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855,Lars-IngeLarsson"/wwimoqy/oc/^m/Wry77^or_yawt/尸rac"ce"，CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1，JohnD.Pound(ed);"T/wmwwoc/zew/ca//Votoco/s，vo/SO",intheseries:"MethodsinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998，ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Femandes(2001，NewYork,NY，MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3;和TheMerckManualofDiagnosisandTherapy(17thEdition,Beers,M.H.,andBerkow,R,Eds，ISBN:0911910107，JohnWiley&Sons)。這些普通的教科書的每一個通過參考在此引入。附圖的簡要說明僅通過舉例的方式，參考在附圖中舉例說明的其優(yōu)選的實施方式，將進一步描述本發(fā)明，其中附圖1是顯示在用相關的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞中FADD顯性陰性(DominantNegative)和FAIM的過量表達、以及Requiem和PDCD6表達的抑制的圖表。附圖2A、2B、2C和2D是顯示過量表達FAIM的CHOIFN，細胞的生長動力學的圖表。附圖2A顯示了相對于時間的活細胞密度(細胞/ml),附圖2B顯示了相對于時間的總細胞密度，附圖2C顯示了相對于時間的生存力，附圖2D顯示了相對于時間的凋亡細胞。由于凋亡細胞的顯著減少(附圖2D),與對照細胞相比，F(xiàn)AIM過量表達顯著降低了細胞培養(yǎng)物生存力的喪失(附圖2C)。附圖3A、3B、3C和3D是顯示過量表達FADD顯性陰性的CHOIFN-y細胞的生長動力學的圖表。附圖3A顯示了相對于時間的活細胞密度(細胞/ml),附圖3B顯示了相對于時間的總細胞密度，附圖3C顯示了相對于時間的生存力，附圖3D顯示了相對于時間的凋亡細胞。由于凋亡細胞顯著減少(附圖3D)，與對照細胞相比，過量表達FADD顯性陰性顯著降低了細胞培養(yǎng)物生存力的喪失(附圖3C)。附圖4A、4B、4C和4D是顯示具有PDCD6抑制的CHOIFN-y細月包的生長動力學的圖表。附圖4A顯示了相對于時間的活細胞密度(細胞/ml),附圖4B顯示了相對于時間的總細胞密度，附圖4C顯示了相對于時間的生存力，附圖4D顯示了相對于時間的凋亡細胞。由于凋亡細胞的顯著減少(附圖4D)，與對照細胞相比，當PDCD6被抑制時，顯著降低了細胞培養(yǎng)物生存力的喪失(附圖4C)。附圖5A、5B、5C和5D是顯示具有Requiem抑制的CHOIFN-y細胞的生長動力學的圖表。附圖5A顯示了相對于時間的活細胞密度(細月包/ml),附圖5B顯示了相對于時間的總細胞密度，附圖5C顯示了相對于時間的生存力，附圖5D顯示了相對于時間的凋亡細胞。由于凋亡細胞的顯著減少(附圖5D)，與對照細胞相比，當Requiem被抑制時，顯著降低了細胞培養(yǎng)物生存力的喪失(附圖5C)。附圖6A、6B、6C、6D和6E是顯示CHO細胞培養(yǎng)物中胱天蛋白酶2、3、8和9的活性的圖表。附圖6A顯示了用對照轉(zhuǎn)染的細胞中胱天蛋白酶活性，附圖6B顯示了在過量表達FAIM的細胞中的胱天蛋白酶活性，附圖6C顯示了在過量表達FADD顯性陰性的細胞中的胱天蛋白酶活性，附圖6D顯示了具有PDCD6抑制的細胞中胱天蛋白酶活性，附圖6E顯示了具有Requiem抑制的細胞中胱天蛋白酶活性。靶向FAIM、FADD顯性陰性、PDCD6或REQU正M的基因能夠抑制和/或延遲培養(yǎng)物中的胱天蛋白酶活性。附圖7A、7B、7C和7D是顯示了轉(zhuǎn)染的CHOIFN-y細胞的干擾素-y產(chǎn)量的圖表。附圖7A顯示了在過量表達FAIM的細胞中的干擾素-Y活性，附圖7B顯示了在過量表達FADD顯性陰性的細胞中的干擾素-Y活性，附圖7C顯示了在具有PDCD6抑制的細胞中的干擾素-Y活性，附圖7D顯示了在具有REQUIEM抑制的細胞中的干擾素-Y活性。通過基因靶向方法可實現(xiàn)干擾素y產(chǎn)量顯著改善高達300%。附圖8A顯示了具有Requiem或PDCD6抑制或者FADDDN或FAIM*過量表達的穩(wěn)定CHOIFN-y克隆在補料分批培養(yǎng)中的活細胞密度。(呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是兩個一式兩份實驗的平均值)。附圖8B顯示了具有Requiem或PDCD6抑制或者FADDDN或FAIM*過量表達的穩(wěn)定CHOIFN-y克隆在補料分批培養(yǎng)中的活細胞密度。附圖9A顯示了具有Requiem或PDCD6抑制或者FADDDN*或FAIM*過量表達的穩(wěn)定CHOIFN-y克隆在補料分批培養(yǎng)中的干擾素y產(chǎn)量。(呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是兩個一式兩份實驗的平均值)附圖9B顯示了具有Requiem或PDCD6抑制或者FADDDN*或FAIM*過量表達的穩(wěn)定CHOIFN-y克隆在補料分批培養(yǎng)中的千擾素y產(chǎn)量。附圖10顯示了在補料分批培養(yǎng)的指數(shù)中期、穩(wěn)定期和死亡期期間具有Requiem或PDCD6抑制或者FADDDN*或FAIM*過量表達的穩(wěn)定CHOIFN-y克隆的重組IFN-y的唾液酸化作用。序列表SEQIDNO:1是中國倉鼠FAIM的氨基酸序列的序列。SEQIDNO:2是中國倉鼠FADD的氨基酸序列。SEQIDNO:3是中國倉鼠PDCD6的氨基酸序列。SEQIDNO:4是中國倉鼠Requiem的氨基酸序列。SEQIDNO:5是中國倉鼠FAIM的核酸序列。SEQIDNO:6是中國倉鼠FADD的核酸序列。SEQIDNO:7是中國倉鼠PDCD6的核酸序列。SEQIDNO:8是中國倉鼠R叫uiem的核酸序列。SEQIDNO:9是中國倉鼠FADD顯性陰性的氨基酸序列。SEQIDNO:IO是中國倉鼠FADD顯性陰性的核酸序列。SEQIDNO:ll是中國倉鼠FADD顯性陰性5，-PCR引物的序列。SEQIDNO:12是中國倉鼠FADD顯性陰性3'-PCR引物的序列。SEQIDNO:13是中國倉鼠PDCD6抑制載體插入物5，的序列。SEQIDNO:14是中國倉鼠PDCD6抑制載體插入物3，的序列。SEQIDNO:15是中國倉鼠R叫uiem抑制載體插入物5，的序列。SEQIDNO:16是中國倉鼠R叫uiem抑制載體插入物3'的序列。SEQIDNO:17是中國倉鼠FAIM5，PCR引物的序列。SEQIDNO:18是中國倉鼠FAIM3，PCR引物的序列。SEQIDNO:19是中國倉鼠FADD5，PCR引物的序列。SEQIDNO:20是中國倉鼠FADD3，PCR引物的序列。SEQIDNO:21是中國倉鼠PDCD65，PCR引物的序列。SEQIDNO:22是中國倉鼠PDCD63，PCR引物的序列。SEQIDNO:23是中國倉鼠PDCD63，-RACE引物的序列。SEQIDNO:24是中國倉鼠R叫uiem5，PCR引物的序列。SEQIDNO:25是中國倉鼠R叫uiem3，PCR引物的序列。SEQIDNO:26是中國倉鼠Requiem3，-RACE引物的序列。SEQIDNO:27是中國倉鼠FAIM定量實時PCR引物5'的序列。SEQIDNO:28是中國倉鼠FAIM定量實時PCR引物3，的序列。SEQIDNO:29是中國倉鼠FADD定量實時PCR引物5'的序列。SEQIDNO:30是中國倉鼠FADD定量實時PCR引物3，的序列。SEQIDNO:31是中國倉鼠PDCD6定量實時PCR引物5'的序列。SEQIDNO:32是中國倉鼠PDCD6定量實時PCR引物3，的序列。SEQIDNO:33是中國倉鼠Requiem定量實時PCR引物5'的序列。SEQIDNO:34是中國倉鼠R叫uiem定量實時PCR引物3，的序列。SEQIDNO:35是卩-肌動蛋白定量實時PCR引物5，的序列。SEQIDNO:36是卩-肌動蛋白定量實時PCR引物3，的序列。SEQIDNO:37是質(zhì)粒pcDNA3.1(+)FAIM的核酸序列。SEQIDNO:38是質(zhì)粒pcDNA3.1(+)FADDDN的核酸序列。SEQIDNO:39是質(zhì)粒pSUPER.neo.PDCD6siRNA的核酸序列。SEQIDNO:40是質(zhì)粒pSUPER,neo.RequeimsiRNA的核酸序列。在此描述的方法和組合物可以適當?shù)夭捎眯蛄斜碇兴拘蛄械娜魏我粋€或多個。詳細i兌明中國倉鼠序列本公開一般地提供了來自中國倉鼠，O/cdw/wgn'ww的某些核酸、多肽以及其片段、同源物、變體和衍生物，其能夠調(diào)節(jié)細胞中的凋亡。特別地，我們提供了如序列表中所列的中國倉鼠FADD、FAIM、PDCD6和Requiem多肽和核酸序列。此外，我們提供了這種基因、片段、同源物的用途。特別優(yōu)選的用途包括，修飾細胞，特別是中國倉鼠卵巢細胞，用于增強的性質(zhì)，例如提高的生存力、提高的表達蛋白質(zhì)(特別是重組蛋白質(zhì))的能力，和這些蛋白質(zhì)的提高的糖基化，優(yōu)選的唾液酸化作用。這樣修飾的細胞和這些的衍生物(例如，菌落、克隆、細胞系等等)以下進一步詳細描述，可以用作用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的凋亡抗性細胞。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽要理解的是，在此公開的多肽序列不局限于序列表中所列的特定序列、或其片段，或從cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem蛋白質(zhì)獲得的序列，還包括獲得自任何來源的同源序列，例如，相關的細^包同源物，來自其他物種的同源物或其變體或衍生物，只要它們視情況具有cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的至少一種生物學活性。本公開進一步包括在序列表中列出的氨基酸序列的變體、同源物或衍生物，以及由在此公開的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的變體、同源物或衍生物。視情況，這些序列通常被稱為"cgFADD序列"、"cgFAIM序列"、"cgPDCD6序列"或"cgR叫uiem序列"。在高度優(yōu)選的實施方式中，所述序列視情況包含cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的至少一種生物學活性。優(yōu)選的，對于cgFAIM來說，生物學活性包括凋亡抑制活性，優(yōu)選的通過胱天蛋白酶活性的減量調(diào)節(jié)來分析。因此，在這個文件中描述的cgFADD序列優(yōu)選的能夠抑制凋亡，具體地能夠在細胞的環(huán)境中減量調(diào)節(jié)胱天蛋白酶活性。在高度優(yōu)選的實施方式中，當使用這種方法來分析時，與沒有用相關的cgFAIM序列如此轉(zhuǎn)染的細胞相比，cgFAIM序列當轉(zhuǎn)染入細胞時能夠抑制凋亡至少10%、優(yōu)選的20%、更優(yōu)選的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。對于cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem來說，所述生物學活性優(yōu)選的包括凋亡刺激活性，優(yōu)選的通過胱天蛋白酶活性的增量調(diào)節(jié)來分析。因》匕，在這個文件中描述的cgFADD、cgPDCD6和cgR叫uiem序列優(yōu)選的能夠增量刺激凋亡，具體地能夠在細胞的環(huán)境中增量調(diào)節(jié)胱天蛋白酶活性。在高度優(yōu)選的實施方式中，當使用這種方法來分析時，與沒有用相關的cgFADD、cgPDCD6或cgRequiem序列如此轉(zhuǎn)染的細胞相比，cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem序列當轉(zhuǎn)染入細胞時能夠刺激凋亡至少10%、4尤選的20%、更優(yōu)選的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在高度優(yōu)選的實施方式中，通過分析胱天蛋白酶活性來分析cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem序列對凋亡的活化或抑制。因此，如上列出的凋亡刺激或抑制百分比在高度優(yōu)選的實施方式中被解讀為胱天蛋白酶活性的刺激或抑制百分比。因此，凋亡活性監(jiān)視方法，例如使用比色或熒光測定法的胱天蛋白酶活性測量分析可以用于確定cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的生物化學活性。這種方法可以在用合適的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染(例如通過本領域已知的手段，或使用實施例中陳述的方案)的細胞中進行，來確定凋亡是否被影響，和/或胱天蛋白酶活性是否被增量或減量調(diào)節(jié)。胱天蛋白酶是介導凋亡的半胱氨酸蛋白酶的大家族(Nicholson&Thornbeny1997;Thornberry&Littlewood1998)。胱天蛋白酶-8是在受體介導的凋亡途徑中最上游起作用的起始胱天蛋白酶。細胞表面受體活化后，胱天蛋白酶-8直接或間接地啟動下游效應物胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-3的蛋白水解活性(Srinivasula"1996和Cohen1997)。胱天蛋白酶-9(其為另一種上游胱天蛋白酶)經(jīng)由細胞色素C向胞質(zhì)溶膠的線粒體釋放一皮活化。釋放的細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子(apoptoticproteaseactivatingfactor)APAF-1結(jié)合，形成活化胱天蛋白酶-9原(procaspase-9)的復合物(Zouefa/1999和Hu"g/1999)。活性的胱天蛋白酶-9啟動蛋白酶級聯(lián)，該蛋白酶級聯(lián)也激活胱天蛋白酶-3和其他下游胱天蛋白酶級聯(lián)。在優(yōu)選的實施方式中，被分析來確定凋亡活性的增量或減量調(diào)節(jié)的胱天蛋白酶活性包括胱天蛋白酶-8或胱天蛋白酶-9。分析胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9活性的方法是本領域已知的，在例如NicholsonDWandThornberryNA(1997)Caspases:killerproteases,7>ew<iy5/oc/ew5"c/.272:2952-2956和ThomberryNAandLittlewoodY(1998)Caspases:Enemieswithin.5We腳281:1312-1316中具體地描述了。先有技術(shù)中列出的任何方案可以被用于分析胱天蛋白酶活性。然而，在優(yōu)選的實施方式中，以下列出的"胱天蛋白酶分析方案"被采用來分析胱天蛋白酶-8和/或胱天蛋白酶-9活性。應乂蛋^^分浙才黃可以通過利用特異于固定在反應孔中的不同胱天蛋白酶的熒光底物來分析胱天蛋白酶活性。將含有活性胱天蛋白酶的細胞溶胞產(chǎn)物添加到孔中將裂解底物，并釋放可以使用標準熒光平板讀數(shù)器檢測的熒光產(chǎn)物。具體地，BDApoAlert胱天蛋白酶分析平板(目錄號K2033-1，BDBiosciencesClontech,PaloAlto,California,USAM吏用了由4皮它們的各自活4匕的胱天蛋白酶識別的短肽組成的不同胱天蛋白酶底物。肽被共價連接到熒光染料7-氨基-4-曱基香豆素(AMC)。結(jié)合肽的AMC在UV范圍(Xmax=380nm)發(fā)射，而未結(jié)合的AMC在綠色范圍中發(fā)射(Xmax=460nm)。這使得將460nm處焚光強度的增加與測試樣品中相應的胱天蛋白酶的活性增加加以關聯(lián)成為可能。為了分析胱天蛋白酶-8活性，使用的底物是VDVAD-AMC,而對于胱天蛋白酶-9分析，使用LEHD-AMC作為它的底物。為了使用BDApoAlert胱天蛋白酶分析平板分析胱天蛋白酶活性，通過離心使來自樣品的細胞沉淀，然后重懸浮在lx細胞裂解緩沖液(BDBiosciencesClontech)中，并在冰上孵育10分鐘。然后通過在4。C離心5分鐘除去細胞碎屑。然后將50|iL2x反應緩沖液/DTT混合物添加到將要使用的96孔平板的每個孔。平板在37-C預孵育5分鐘。然后將50|iL的合適的細胞溶胞產(chǎn)物添加到孔中并在37。C孵育2小時。然后使用熒光平板讀數(shù)器來測量釋放的AMC的數(shù)量(在380nm激發(fā)，在460nm發(fā)射)。胱天蛋白酶活性被定義為減去參考樣品460nm處的絕對發(fā)射之后，樣品460nm處的絕對發(fā)射。參考樣品是在零參考時間收集的樣品。用cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem表達載體轉(zhuǎn)染的細胞的胱天蛋白酶活性可以與用空載體轉(zhuǎn)染的(或未轉(zhuǎn)染)的細胞相比較來確定凋亡視情況被刺激或抑制的百分比。["胱天蛋白酶分析方案"結(jié)束]中，當使用這種方法來分析時，與沒有用相關的cgFAIM序列如此轉(zhuǎn)染的細胞相比，cgFAIM序列當轉(zhuǎn)染入細胞時能夠抑制胱天蛋白酶-8、或胱天蛋白酶-9、或兩者的表達至少10%、優(yōu)選的20%、更優(yōu)選的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在高度優(yōu)選的實施方式中，當使用這種方法來分析時，與沒有用相關的cgFADD、cgPDCD6或cgRequiem序列如此轉(zhuǎn)染的纟田胞相比，cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem序列當轉(zhuǎn)染入細胞時能夠刺激胱天蛋白酶-8、或胱天蛋白酶-9、或兩者的表達至少10%、優(yōu)選的20%、更優(yōu)選的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。也可以使用檢測凋亡相關事件，例如膜改變、DNA片段化和凋亡的其他生物化學標志的其他分析，來代替或補充所描述的分析。公開的多肽包括從任何來源獲得的同源序列，例如，相關的病毒/細菌蛋白質(zhì)，細胞同源物和合成肽，以及其變體或衍生物。因此，多肽還包括來自其他物種包括動物例如哺乳動物(例如，小鼠、大鼠或兔子)特別是嗜齒動物的、編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的同源物的那些。在本文件的上下文中，同源序列或同源物包括視情況與cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem，例如在此的序列表中所示的，在至少30、優(yōu)選的40、50、60、70、80、90或100個氨基酸上，在氨基酸水平上具有至少60、65、70、75、80、85、86、87、88、89或90%的同一性，優(yōu)選的至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。在這個文件的上下文中，同源序列包括與cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列,優(yōu)選的在至少15、25、35、50或100，優(yōu)選的200、300、400或500個氨基酸上在氨基酸水平上具有至少15、20、25、30、40、50、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89或90%的同一性，優(yōu)選的至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。例如，序列可以與cgFADD(優(yōu)選的包含SEQIDNO:1所示的序列)、cgFAIM(優(yōu)選的包含SEQIDNO:2所示的序列)、cgPDCD6(優(yōu)選的包含SEQIDNO:3所示的序列)或cgRequiem(優(yōu)選的包含SEQIDNO:4所示的序列)具有所稱的序列同一性。盡管也可以根據(jù)相似性來考慮同源性(即，具有相似化學性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本文件的上下文中，優(yōu)選的根據(jù)序列同一性來表述同源性。在高度優(yōu)選的實施方式中，序列同一性相對于相關序列的長度的全部來確定，即，例如在相關基因的完整長度或全長序列上?？梢酝ㄟ^目測、或更常見地，借助易獲得的序列比較程序來進行同源性比較。這些商業(yè)上可獲得的計算機程序能計算兩個或多個序列之間的同源性％?？梢栽谶B續(xù)的序列上計算同源性％,即，一個序列與另一個序列比對，一個序列中的每個氨基酸直接與另一個序列中相應氨基酸比較，一次一個殘基。這稱為"無缺口"比對。一般，這種無缺口比對只在相對短的殘基數(shù)上進行(例如低于50個連續(xù)的氨基酸)。盡管這是非常筒單且一致的方法，但是它沒有考慮到，例如，在除此之外相同的序列對中，一個插入或缺失將導致隨后的氨基酸殘基被逐出序列比對，因此當進行整體排列時，將很可能導致％同源性的大幅度下降。因此，多數(shù)序列比較方法被設計成考慮到可能的插入和缺失而不會對整體同源性積分不適當?shù)亓P分，從而產(chǎn)生最佳的序列對比。這通過在序列對比中插入"缺口"來試圖最大化局部的同源性而實現(xiàn)。但是，這些更復雜的方法對序列比對中出現(xiàn)的每個缺口指定了"缺口罰分"，這樣，對于相同數(shù)量的相同氨基酸，帶有盡可能少的缺口的序列比對_一反映兩個比較序列之間的更高相關性_將比有較多缺口的序列獲得更高的積分。一般用"遠交缺口計分(Affinegapcosts)"來給缺口的存在扣(charge)較多的計分，給缺口中每個隨后的殘基扣較少罰分。這是最普遍使用的缺口積分系統(tǒng)。高缺口罰分當然將產(chǎn)生具有較少缺口的最優(yōu)化的序列對比。多數(shù)序列比對程序允許修改缺口罰分。但是當使用這種軟件作序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如，當使用GCGWisconsinBestfit包時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是缺口為-12，每個延伸為-4。因此最大％同源性的計算首先需要產(chǎn)生考慮到缺口罰分的最佳序列對比。用于進行這種比對的合適的計算機程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(Devereux等，1984,NucleicAcidsResearch12:387)。可以進行序列比較的其他軟件的例子包括，但不局限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999,ShortProtocolsinMolecularBiology,第四版，第18章),FASTA(Atschul等，1990,J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比較工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脫機和聯(lián)機檢索(參見Ausubd等，1999，ShortProtocolsinMolecularBiology,第7-58到7-60頁)。然而優(yōu)選的是使用GCGBestfit程序。盡管最終同源性％可以根據(jù)同一性而測量，比對過程自身一般不以全或無成對比較為基礎。相反，通常使用按比例繪制的(scaled)相似性評分矩陣將得分分配到每個以化學相似性或進化距離為基礎而進行的成對比較。這種常用矩陣的一個例子是BLOSUM62矩陣，即BLAST程序系列的缺省矩陣。GCGWisconsin程序一般用公共默認值或如果已提供，則使用自定義符號比較表(更詳細內(nèi)容見用戶手冊)。優(yōu)選將公共默認值用于GCG軟件包，或在使用其它軟件的情況下，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。一旦軟件產(chǎn)生最優(yōu)比對，就有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件一般作為序列比較的一部分進行此計算并產(chǎn)生以數(shù)字表示的結(jié)果。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)用于比較的相關序列的完整長度來考慮序列相似性、同一性、同源性或互補性。相對于在此描述的氨基酸序列的術(shù)語"變體，，或"衍生物，，包括從所述序列或?qū)λ鲂蛄械娜魏翁鎿Q、改變、修飾、置換、缺失或添加一個(或多個)氨基酸。優(yōu)選的，產(chǎn)生的氨基酸序列基本上保持了與未修飾的序列相同的活性，優(yōu)選的具有至少與序列表中所示cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽相同的活性。因此，優(yōu)選保持序列的關鍵特征——即它們能夠調(diào)節(jié)一種或多種凋亡過程。具有實施例中所示氨基酸序列的多肽，或其片段或同源物可以被修飾以用于在此描述的方法和組合物。一般地，進行維持序列的生物學活性的修飾。可以進行氨基酸替換，例如從1、2或3個到10、20或30個替換，只要修飾的序列保持了未修飾序列的生物學活性。氨基酸替換可以包括使用非天然發(fā)生的類似物，例如，用來提高治療性施用的多肽的血漿半衰期。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的天然變體很可能包含保守性氨基酸替換。保守性替換可以例如根據(jù)以下的表格定義。第二欄中同一塊中的氨基酸，優(yōu)選第三欄中同一行的氨基酸可以相互替代<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>^遂在此公開并且作為標記物有用的多肽還包括上述全長多肽的片段和其變體，包括在序列表中列出的序列的片段。多肽還包括cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽的任一個的全長序列的片段。優(yōu)選的片段包含至少一個表位。鑒定表位的方法是本領域公知的。片段一般將包含至少6個氨基酸，更優(yōu)選的至少10、20、30、50或100個氨基酸。包括的是片段，其包含，優(yōu)選的由cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem氛基酉交序歹寸的5、6、7、8>9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150個或更多殘基組成。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem蛋白質(zhì)的多肽片段和其等位和物種變體可以含有一個或多個(例如，5、10、15或20個)替換、缺失或插入，包括保守的替換。當替換、缺失和/或插入發(fā)生時，例如在不同的物種中，優(yōu)選序列表中描繪的氨基酸殘基的少于50%、40%或20%被改變。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem,和它們的片段、同源物、變體和衍生物可以通過重組方法來產(chǎn)生。然而，它們也可以使用技術(shù)人員公知的技術(shù)例如固相合成通過合成方法產(chǎn)生。蛋白質(zhì)也可以作為融合蛋白生產(chǎn)，例如，來幫助提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)和(3-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體和目標蛋白質(zhì)序列之間包括蛋白水解裂解位點來容許除去融合蛋白序列也是方便的。優(yōu)選的融合蛋白將不會阻礙目標蛋白質(zhì)序列的功能。還可以通過純化來自'動物細胞的細胞提取物獲得蛋白質(zhì)。在此公開的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6,和cgRequiem多肽，變體、同源物、片段和衍生物可以是基本上分離的形式。要理解的是這種多肽可以與不干擾該蛋白質(zhì)的預定目的的運載體或稀釋劑混合，而仍認為是基本上分離的。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem變體、同源物、片段或衍生物也可以是基本上純化的形式，在這種情況下一般它將包含在制品中的蛋白質(zhì)，其中在制品中超過90%,例如95%、98%或99%的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)。在此公開的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽、變體、同源物、片段和衍生物可以用具有顯示作用的標記來標記。具有顯示作用的標記可以是容許多肽等被檢測的任何適合的標記。適合的標記包括放射性同位素，例如1251，酶，抗體，多核苷酸和接頭例如生物素。標記的多肽可以在診斷過程例如免疫分析中使用來確定樣品中多肽的數(shù)量。多肽或標記的多肽也可以用于血清學或細胞介導的免疫分析，用于使用標準方案檢測動物和人類對所述多肽的免疫反應性。在此公開的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽、變體、同源物、片段和衍生物，任選的被標記的，也可以固定到固相上，例如免疫分析孔或蘸取棍(dipstick)的表面。這種標記的和/或固定的多肽可以在適合的容器中與適合的試劑、對照物、說明書等等一起被包裝在試劑盒中。這種多肽和試劑盒可以用于通過免疫分析來檢測針對所述多肽或它們的等位或物種變體的抗體的方法。免疫分析方法是本領域公知的，一般包括(a)提供包含可由針對所述蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合的表位的多肽；(b)在容許抗體-抗原復合物形成的條件下孵育生物樣品與所述多肽；和(c)確定是否形成包含所述多肽的抗體-抗原復合物。在此7>開的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽、變體、同源物、片段和衍生物可以用于體外或體內(nèi)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來研究它們的相應基因和其同源物在細胞功能中的作用，包括它們在疾病中的功能。舉例來說，截短的或修飾的多肽可以導入細胞來破壞在細胞中存在的正常功能。多肽可以通過多肽從重組表達載體的原位表達來導入細胞中(見下文)。所述表達載體任選的帶有可誘導的啟動子來控制所述多肽的表達。使用合適的宿主細胞，例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞，預計提供了這種翻譯后修飾(例如，肉豆蔻酰化、糖基化、截斷、lapidation以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，這可能是賦予重組表達產(chǎn)物最佳生物學活性所需的。表達在此公開的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽、變體、同源物、片段和衍生物的這種細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)可以在分析系統(tǒng)中使用來鑒定在所述細胞中干擾或增強所述多肽的功能的候選物質(zhì)。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem核酸我們一般地提供了許多cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem核酸，連同其片段、同源物、變體和衍生物。這些核酸序列優(yōu)選的編碼在此公開的多肽序列，特別是序列表中的多肽序列。優(yōu)選的，所述多核芬酸包含cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem核酸，優(yōu)選的分別選自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8組成的組。特別地，我們提供了編碼在此公開的任何中國倉鼠多肽的核酸或多核苷酸。因此，術(shù)語""cgFADD序列"、"cgFAIM序列"、"cgPDCD6序列，，和"cgRequiem序列，，應被相應地解釋。然而，優(yōu)選的，這些核酸或多核苷酸包含SEQIDNO:5-16和SEQIDNO:37、38、39和40所列的Y壬一序列、或編碼任一相應多肽的序列，和這種核酸的片段、同源物、變體或衍生物。因而以上術(shù)語優(yōu)選的應看作是指這些序列。如在本文件中使用，術(shù)語"多核苷酸"、"核苷酸"和核酸意欲互相是同義的。"多核苷酸，，一般是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。"多核苷酸"非限制性地包括單鏈和雙鏈DNA,單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的DNA，單鏈和雙鏈的RNA,和單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA,包含可以是單鏈的或更一般地是雙鏈的DNA和RNA的雜合體分子，或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。此外，"多核苦酸"指包含RNA或DNA或RNA與DNA兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語多核香酸還包括含有一個或多個修飾的堿基的DNA或RNA,以及主干為了穩(wěn)定性或其他理由加以修飾的DNA或RNA。"修飾的，，堿基包括，例如，三苯曱基化的堿基，和不常見的堿基，例如次黃香。已經(jīng)對DNA和RNA進行了各種修飾，因而"多核苷酸"涵蓋如一般在自然中存在的多核苷酸的化學、酶學地或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞特有的DNA和RNA的化學形式。"多核苷酸"還涵蓋相對短的多核普酸，常常稱為寡核苷酸。技術(shù)人員要理解的是，由于遺傳密碼簡并性的結(jié)果，許多不同的多核芬酸和核酸可以編碼相同的多肽。此外，要理解的是，技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)，產(chǎn)生不影響由在此描述的多核苷酸編碼的多肽序列的核苷酸替換，來反映所述多肽將要被表達的任何特定宿主有機體的密碼子利用率。f》力i教^^源^在此描述的多核苷酸可以包括DNA或RNA。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們也可以是其中包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。對寡核苷酸的許多不同類型的修飾是本領域已知的。這些包括曱基膦酸酯和硫代磷酸酯主干，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本文件的目的而言，要理解的是在此描述的多核苷酸可以通過本領域可用的任何方法來修飾。可以進行這種修飾來提供多核苷酸的體內(nèi)活性或壽命期。當多核苷酸是雙鏈時，雙鏈體的兩條鏈獨立地或組合地包括在此描述的方法和組合物中。當多核苷酸是單鏈時，要理解的是也包括該多核苷酸的互4卜序列。相對于核苷S吏序列，術(shù)語"變體"、"同源物"或"衍生物"包括從所述序列或?qū)λ鲂蛄械娜魏翁鎿Q、改變、修飾、置換、缺失或添加一個(或多個)核苷酸。優(yōu)選的，產(chǎn)生的序列能夠編碼具有凋亡介導物活性的多肽。如上所述，對于序列同一性，"同源物"優(yōu)選的與序列表中所示相關序列具有至少5%同一性、至少10°/。同一性、至少15%同一性、至少20%同一性、至少25%同一性、至少30%同一性、至少35%同一性、至少40%同一性、至少45%同一性、至少50%同一性、至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性。更優(yōu)選的，存在至少95%同一性，更優(yōu)選的至少96%同一性、更優(yōu)選的至少97%同一性、更優(yōu)選的至少98%同一性、更優(yōu)選的至少99%同一性。核苷酸同源性比較可以如上所述進行。優(yōu)選的序列比較程序是如上所述的GCGWisconsinBestfit程序。默認的計分矩陣對每個相同的核脊酸有10的匹配值，對每個錯配為-9。默認的缺口生成罰分是-50，默認的缺口延伸罰分每個核苷酸是-3。在優(yōu)選的實施方式中，cgFAIM多核苷酸具有與SEQIDNO:5所示序列至少卯％或更高的序列同一性。優(yōu)選的，cgFAIM多核苷酸具有與SEQIDNO:5所示序列至少91%或更高、優(yōu)選的92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高或99.5%或更高的序列同一性。類似地，在優(yōu)選的實施方式中，cgFADD序列具有與SEQIDNO:6所示序列的至少90%的序列同一性。優(yōu)選的，cgFADD多核苷酸具有與SEQIDNO:6所示序列至少91%或更高、優(yōu)選的92%或更高、93%或更高、94%或更高、96%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高或99.5%或更高的序列同一性。在優(yōu)選的實施方式中，cgPDCD6序列具有與SEQIDNO:7所示序列至少93%或更高的序列同一性。優(yōu)選的，cgPDCD6多核苷酸具有與SEQIDNO:7所示序列94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高或99.5%或更高的序列同一性。在優(yōu)選的實施方式中，cgRequiem多核苷酸具有與SEQIDNO:8所示序列的至少90%或更高的序列同一性。優(yōu)選的，cgRequiem多核苷酸具有與SEQIDNO:8所示序列90%或更高、優(yōu)選的91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、99%或更高或99.5%或更高的序列同一性。染Jt我們進一步描述了能與在此呈現(xiàn)的任何序列選擇性雜交的cgFAIM，cgFADD,cgPDCD6andcgRequiem核苷酸序列，或其任何變體、片段或衍生物，或上述任何的互補物。核苦酸序列優(yōu)選的是長度至少15個核苷酸，更優(yōu)選的長度至少20、30、40或50個核苷酸。在此使用的術(shù)語"雜交"應當包括"核酸的鏈通過堿基配對與互補鏈連接的過程"，以及如在聚合酶鏈式反應技術(shù)中進行的擴增的過程。能夠與在此呈現(xiàn)的核苷酸序列或它們的互補物選擇性雜交的多核香酸，一般地在至少20個、優(yōu)選的至少25或30個，例如至少40、60或100或更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)域上與在此呈現(xiàn)的相應核苷酸序列至少70%、優(yōu)選的至少80或90%，更優(yōu)選的至少95%或98%同源。術(shù)語"選擇性雜交"是指用作探針的多核苷酸在目標多核苷酸被發(fā)現(xiàn)以顯著高于背景的水平與探針雜交的一定條件下使用。背景雜交可以由于其他多核香酸存在而發(fā)生，例如，在被篩選的cDNA或基因組DNA文庫中。在這種情況下，背景指由探針和文庫的非特異性DNA成員之間的相互作用產(chǎn)生的信號水平，其強度低于用目標DNA觀察到的特異性相互作用IO倍、優(yōu)選的低于100倍?？梢酝ㄟ^例如，用32P對探針進行放射性標記，來測量相互作用的強度。雜交條件基于核酸結(jié)合復合物的熔融溫度(Tm),如BergerandKimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology，Vol152,AcademicPress,SanDiegoCA)中所教導的，并如以下說明被賦予定義的"嚴謹度"。最大嚴謹度一般在約Tm-5°C(低于探針的Tm5°C)發(fā)生；高嚴謹度在低于Tm5。C到10°C;中度嚴謹度在低于Tm約10T到20°C;低嚴謹度在低于Tm約20。C到25°C。本領域技術(shù)人員將理解的是，最大嚴謹度雜交可以用于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而中度(或低度)嚴謹度雜交可以用于鑒定或4企測相似的或相關的多核苷酸序列。在優(yōu)選的方面，我們公開了能夠與cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem核酸、或其片段、同源物、變體或衍生物在嚴謹條件(例如，65。C和O.lxSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})下雜交的核香酸序列。當多核苷酸是雙鏈時，雙鏈體的兩條鏈獨立地或組合地被本/>開涵蓋。當多核苷酸是單鏈時，要理解的是該多核苷酸的互補序列也被公開和涵蓋?？梢砸远喾N方式獲得與在此公開的序列不是100°/。同源、但落入本公開之內(nèi)的多核香酸。在此描述的序列的其他變體可以例如通過探查從一系列個體，例如來自不同群體的個體制成的DNA文庫來獲得。此外，可以獲得在其他病毒/細菌，或細胞同源物，特別是在哺乳動物細胞(例如，大鼠、小鼠、牛和靈長類細胞)中發(fā)現(xiàn)的細胞同源物，而且這種同源物和其片段一般將能夠選沖奪性地與此處的序列表中所示序列雜交。這種序列可以通過如下方法來獲得探查從其他動物物種制成的cDNA庫或來自其他動物物種的基因組DNA庫，在中度至高度嚴謹?shù)臈l件下用包含SEQIDNO:1到40的全部或部分的纟果針來^^查這些文庫。相似的考慮適用于獲得cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的物種同源物和等位變體。在此描述的多核苷酸可以用于產(chǎn)生引物，例如PCR引物，用于選擇性的擴增反應的引物；產(chǎn)生探針，例如使用放射性或非放射性標記通過傳統(tǒng)方法用具有顯示作用的標記標記的探針，或者所述多核苷酸可以被克隆到載體中。這些引物、探針和其他片段長度將是至少15、優(yōu)選的至少20、例如至少25、30或40個核苷酸，并且也被在此使用的術(shù)語多核苷酸涵蓋。優(yōu)選的片段長度低于500、200、100、50或20個核苷酸。多核苷酸例如DNA多核苷酸和探針可以重組地、合成地或通過本領域技術(shù)人員可獲得的任何方法來產(chǎn)生。它們也可以通過標準技術(shù)克隆。一般地，引物將通過合成方式來生產(chǎn)，包括一次一個核苷酸地分步式生產(chǎn)期望的核酸序列。使用自動化技術(shù)實現(xiàn)這個的技術(shù)是本領域中容易獲得的。更長的多核苷酸一般將使用重組方式產(chǎn)生，例如，使用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術(shù)。這將包括制備側(cè)翼于希望被克隆的序列區(qū)域的引物對(例如，約15到30個核苷酸)，使引物與從動物或人類細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在引起希望的區(qū)域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應，分離擴增的片段(例如，通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)并回收擴增的DNA。引物可以被設計以含有適合的限制性內(nèi)切酶識別位點，使得擴增的DNA可以被克隆入適合的克隆載體。CG序列的用途如實施例所示，我們確定了這四個基因涉及細胞中凋亡的介導。降低，并由此改善了細胞生存力。因而基因和多肽和其產(chǎn)物在許多領域，例如在細胞培養(yǎng)中具有實用性。因此，美國專利號6,586,206描述了凋亡抑制物在使用培養(yǎng)的宿主細胞生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)中的用途，具有改善期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的效果。相應地，因而中國倉鼠FAIM、FADD、PDCD6和Requiem序列的公開允許在細胞培養(yǎng)中靶向這些基因來增強細胞生存力并促進重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)量增強。具體地，我們在此描述的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem修飾的細胞、優(yōu)選的中國倉鼠細胞、更優(yōu)選的中國倉鼠卵巢細胞，可以適當?shù)乇徊捎糜糜谝愿纳频漠a(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem修飾的細胞根據(jù)在此描述的方法和組合物，在細胞中調(diào)節(jié)cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的任何一種或多種改善了群體的細胞生存力，優(yōu)選的中國倉鼠群體。特別地，我們在實施例中顯示了降低cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的表達，以及提高cgFAIM的表達，導致細胞生存力改善。然而，要理解的是，除了調(diào)節(jié)多肽表達，或作為調(diào)節(jié)多肽表達的替代，可以采用調(diào)節(jié)任何這些基因的方法，包括調(diào)節(jié)物實體例如激動劑和拮抗劑的使用。為了方便起見，將調(diào)節(jié)這些基因的任何一個或多個的表達的細胞稱為"修飾的細胞"，雖然要理解的是，這些細胞可能本身不是被物理修飾的，但可以是被修飾的細胞的后代。具體地我們提供了其中cgFAIM表達被增量調(diào)節(jié)的細胞，以及其中cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem,或其任意組合的表達被減量調(diào)節(jié)的細胞。因而，要理解的是，cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的一個、兩個、三個或全部四個的表達可以在修飾的細胞中被調(diào)節(jié)。修飾可以是短暫的，或可以是永久或長期的，取決于修飾的方式。^修飾的細胞可以包括哺乳動物細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞，最優(yōu)選的CHO細胞。它們可以包括嚙齒動物細胞，優(yōu)選的小鼠或大鼠細胞。優(yōu)選的，這種修飾的細胞包括中國倉鼠細胞，最優(yōu)選的CHO細胞。然而，它們可以包括靈長類細胞，例如猴細胞或人細胞。相關的細胞可以通過本領域已知的任何手段靶向相關的基因來修飾。一種可能的方法是表達4十對cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的反義構(gòu)建體，來抑制基因功能并防止相關多肽的表達。另一種方法是使用cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽的無功能的變體，其與內(nèi)源的基因產(chǎn)物竟爭細胞死亡機制的細胞成分，產(chǎn)生對功能的抑制。做為選擇，可以向細胞施用通過如上述分析鑒定為與cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽結(jié)合的化合物，來阻止多肽的功能。例如，這可以通過重組DNA技術(shù)，或通過直接施用化合物來進行。針對cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的適合的抗體也可以用作試劑。做為選擇，雙鏈的RNA(dsRNA)是在廣泛的有機體中干擾基因表達的強大的方法，其近來已經(jīng)顯示在哺乳動物中是成功的(WiannyandZernicka-Goetz，2000，NatCellBiol2000，2,70-75)。相應于cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem多核苷酸的序列的雙鏈RNA可以被導入或在細胞或細胞系中表達來增強細胞生存力。特別地，我們描述了當期望表達降低時通過使用小干擾RNA(singleinterferingRNA)(siRNA)以及使用顯性陰性突變體的修飾。我們進一步描述了使用載體，其允許用于提高相關基因的表達的相關序列的過量表達。修飾可以是短暫的，或可以是永久的。因而，我們提供了細胞系，其包含在cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem中具有基因組的和可遺傳的修飾的細胞。建立這種細胞系的詳細方案在實施例中列出。修飾的細胞可以做單細胞、細胞組、克隆、克隆系、菌落、細胞系或組織來提供。我們進一步提供了轉(zhuǎn)基因動物，其細胞包含cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的減量調(diào)節(jié)的表達，或cgFADD的增量調(diào)節(jié)的表達，或這兩者。優(yōu)選的，顯性突變體包括cgFADD顯性突變，cgFADD顯性突變包含SEQIDNO:9中列出的序列。做為選擇，或此外，所述序列可以包含F(xiàn)DIVCDNVGRDWKRLARQLKVSEAKIDGIEERYPRSLSEQVREALRVWKIAEREKATVAGLVKALRACRLNLVADLVE顯性突變體可以由SEQIDNO:10中所列的序列編碼，或作為選擇，提高的細胞生存力當與同源的未修飾細胞、或野生型細胞、或衍生它們的親本細胞相比時，修飾的細胞具有幾個有益的性質(zhì)。它們可能具有改善的細胞生存力的性質(zhì)。因此，對于世代的時間或數(shù)量而言，它們可以在培養(yǎng)中存活更久。優(yōu)選的，通過測定已經(jīng)被修飾，即通過耙向cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem修飾的細胞群體的存活細胞密度，來度量細胞生存力。優(yōu)選的，與沒有^L修飾的細胞(例如，對照群體)相比，》務飾的細月包維持了更高的細胞生存力。細胞生存力優(yōu)選的以相關的細胞群體中存活細胞的百分比來測量。在優(yōu)選的實施方式中，細胞生存力通過"臺盼藍生存力排阻分析"來測定。這種分析一般用于在細胞培養(yǎng)領域中的細胞生存力測定。在實施例中列出了詳細的方案，簡言之細胞懸液與磷酸鹽緩沖溶液中的0.4%臺盼藍混合，并使用血球計計數(shù)?；罴毎尸F(xiàn)圓形并且可折射，沒有任何藍色染料著色，而死細胞吸收染料并呈現(xiàn)藍色。然后將生存力表示為相對于被計數(shù)的總細胞數(shù)的活細胞百分比。活細胞被定義為其膜完整性仍然能夠在臺盼藍排阻生存力分析中阻止臺盼藍吸收的細胞。優(yōu)選的，修飾的細胞與對照群體相比具有至少5%、優(yōu)選的10%或更多、更優(yōu)選的15%、更優(yōu)選的15%、20%、30%、40%、50%或更多存活細胞。做為選擇，或此外，修飾的細胞與未被修飾的細胞相比細胞生存力維持了更長時間。例如，修飾的細胞與對照細胞相比能夠維持一定百分比的細胞生存力(例如，95%)更長時間。優(yōu)選的，修飾的細胞與對照細胞相比細胞生存力延長至少1小時，更優(yōu)選的至少6小時，最優(yōu)選的至少12小時或更久，例如，至少24小時，至少36小時或至少48小時。在高度優(yōu)選的實施方式中，與對照細胞相比，在生存力開始降至低于95%之前，修飾的細胞生存力延長至少24小時。與未修改對照細胞相比，修飾的細胞優(yōu)選能有更高的存活培養(yǎng)物密度。優(yōu)選的，與對照細胞相比，修飾的細胞能有高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更高的活細胞密度。例如，修飾的細胞可以達到高達9.6xl(^個細胞/ml的密度。修飾的細胞優(yōu)選的顯示凋亡標記物表達的延遲發(fā)作，優(yōu)選的是胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3或胱天蛋白酶8。就單個細胞更長時間的存活或顯示了凋亡的細胞數(shù)目而言，修飾的細胞也具有顯示降低的凋亡的性質(zhì)。優(yōu)選的，它們具有對凋亡有抗性的性質(zhì)(參見下文)。炎葛的蛋^量方便地，如實施例21中所證明的，與未修改的對照細胞相比，修飾的細胞能有提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，優(yōu)選的提高的重組表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。優(yōu)選的，修飾的細胞與對照細胞相比能有高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更高的產(chǎn)量。更優(yōu)選的，修飾的細胞與對照細胞相比能有高2.5x、3x、5x、10x或更高的產(chǎn)量。優(yōu)選的，重組表達的蛋白質(zhì)包含干擾素y。因而我們提供了在所描述的修飾的細胞中表達重組蛋白質(zhì)、優(yōu)選的生物治療分子的方法。優(yōu)選的，所述修飾的細胞在分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)或兩者中顯示了它們的性質(zhì)中的任何一種或多種。提葛的潛差/a與對照的未修飾細胞相比，所述修飾的細胞優(yōu)選的還能提高表達的蛋白質(zhì)的糖基化。實施例顯示了修飾的細胞能夠在延長的細胞培養(yǎng)時間上維持蛋白質(zhì)糖基化，不管細胞培養(yǎng)物生存力的損失是否發(fā)生。在高度優(yōu)選的實施方式中，糖基化包括唾液酸化作用。修飾的細胞系的這種特征在生物治療劑的制備中特別有益，因為較低程度的唾液酸化作用會降低基于蛋白質(zhì)的藥物的體內(nèi)半衰期(Varki，1993，BiotechnolBioeng43:423-428;Grameretal.，1995，Glycobiology3:97-130)。在優(yōu)選的實施方式中，在細胞培養(yǎng)物的一個或多個生長階段、優(yōu)選在指數(shù)生長期的至少部分中(優(yōu)選的至少在指數(shù)中期中)，但更優(yōu)選的還在發(fā)生最大存活細胞密度之時，更優(yōu)選的還在親本或未修改細胞中將出現(xiàn)細胞死亡之時，維持表達的蛋白質(zhì)的糖基化。在這種情況下，糖基化的水平優(yōu)選的被維持在一個水平，而親本或未修改的細胞中該水平將會降低。在優(yōu)選的實施方式中，糖基化被維持在至少2.7、優(yōu)選的至少2.9mole糖/mole表達的蛋白質(zhì)的水平。在優(yōu)選的實施方式中，與親本或未修飾的細胞相比，在生長期中相同的時間點，修飾細胞對表達的蛋白質(zhì)的糖基化提高。在這種優(yōu)選的實施方式中，糖基化可以達到至少2.9、優(yōu)選的至少3、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5mole糖/mole表達的蛋白質(zhì)的水平。我們進一步提供了具有提高的糖基化、優(yōu)選的提高的唾液酸化作用的重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)使用所描述的修飾的細胞制備。與可從不被如此修飾的細胞產(chǎn)生的多肽相比，這種多肽具有^C高的唾液酸化作用。優(yōu)選的，所述糖基化或唾液酸化作用大于2.9mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽，優(yōu)選的約3.5mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽。在高度優(yōu)選的實施方式中，表達的蛋白質(zhì)包含干擾素y。我們進一步提供了通過調(diào)節(jié)細胞的cgFAIM、gFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem表達、修飾細胞來展示上述任何一種或多種性質(zhì)的方法。凋亡才艮據(jù)本發(fā)明，cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem修飾的細胞的細胞生存力的提高源于修飾的細胞群體中凋亡的降低。這種修飾的細胞可以顯示降低的凋亡，或?qū)Φ蛲鲇锌剐?。與對照細胞相比，所述修飾的細胞優(yōu)選的能夠維持更高的存活細胞密度，優(yōu)選的持續(xù)更久的時間。優(yōu)選的，與未修飾的對照群體相比，在修飾的群體中存活細胞數(shù)目更高，例如高10%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或更多。優(yōu)選的，與對照細胞相比，修飾的細胞顯示生存力延長至少6小時、至少12小時、優(yōu)選的至少18小時，最優(yōu)選的至少24小時。在高度優(yōu)選的實施方式中，與對照細胞相比，胱天蛋白酶2和/或胱天蛋白酶3和/或胱天蛋白酶8表達被延遲這么長時間。因而，優(yōu)選的，與對照群體相比，^修飾細胞的群體中的凋亡降低至少10%、優(yōu)選的25%或更多、更優(yōu)選的40%、50%、75%、95%或更多。在優(yōu)選的實施方式中，修飾細胞的群體中凋亡細胞的百分比降低這么些數(shù)量。在高度優(yōu)選的實施方式中，修飾的細胞對凋亡有抗性，即，顯示了很少的凋亡或沒有顯著的凋亡。分析凋亡的方法是本領域已知的，在下文和實施例中詳細描述了。在實施例14:凋亡分析中列出了分析凋亡的優(yōu)選的方法。可選擇的凋亡的分析包括定量或測量相關細胞中胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8的任何一種或多種的水平。因此，優(yōu)選的，與沒有被如此修飾的細胞或群體相比，在修飾的細胞或群體中這些胱天蛋白酶的任何一種或多種的水平被降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%或更多。優(yōu)選的，與未被修飾的對照細胞相比，修飾的細胞展現(xiàn)胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8的任何一種或多種的表達延遲優(yōu)選的至少1小時、更優(yōu)選的至少6小時、最優(yōu)選的至少12小時或更多，例如，至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少72小時、至少144小時、至少288小時或更久的一段時間。胱天蛋白酶水平可以通過本領域已知的任何方法來分析，包括RT-PCR、RNAse保護、SDS-PAGE、免疫分析，等等。細胞死亡可以通過兩種不同的機制，壞死或凋亡的任一種來發(fā)生。此外，某些化合物和細胞據(jù)說對于細胞是細胞毒的，即引起細胞死亡的。"細胞毒性"是指化合物(例如，食物、化妝品或藥物)或介導細胞(細胞毒性T細胞)的細胞殺傷性質(zhì)。與壞死和凋亡相反，術(shù)語細胞毒性不必要指特定的細胞死亡機制。舉例來說，細胞介導的細胞毒性(也就是由細胞毒T淋巴細胞[CTL]或天然殺傷[NK]細胞介導的細胞死亡)組合了壞死和凋亡的某些方面。"壞死，，(也稱為"意外的"細胞死亡)是指當細胞暴露于嚴重的物理或化學損害時發(fā)生的病理過程。當細胞暴露于可能引起對質(zhì)膜的損害的生理條件的極端改變(例如，低溫、氧不足)時，發(fā)生壞死。在生理條件下，對質(zhì)膜的直接損害由如補體和裂解病毒的試劑引起。壞死開始于細胞維持穩(wěn)態(tài)的能力的受損，引起水和細胞外離子的流入。細胞內(nèi)的細胞器，最值得注意的是線粒體，以及完整的細胞腫脹并破裂(細胞裂解)。由于質(zhì)膜的最終崩潰，細胞質(zhì)內(nèi)容物包括溶酶體酶被釋放到細胞外液中。因此，在體內(nèi)，壞死性細胞死亡常常與引起強烈的炎癥性反應的廣泛組織損傷相關。"凋亡，，("正常，，或"程序化，，細胞死亡)是指一種生理過程，通過這種過程在發(fā)育和其他正常的生物學過程期間不需要的或無用的細胞被清除。凋亡是在正常的生理條件下發(fā)生的細胞死亡的模式，細胞在其自己的死亡中是主動參與者("細胞自殺")。這最經(jīng)常地在標準的細胞更新和組織穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)生、免疫耐受性的誘導和維持、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和內(nèi)分泌依賴性組織萎縮期間被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)歷凋亡的細胞顯示了特征性形態(tài)學和生物化學特征。這些特征包括染色質(zhì)聚集、核和細胞質(zhì)的濃縮、細胞質(zhì)和核分配到含有核糖體的膜結(jié)合嚢泡(凋亡體)中、線粒體和核材料的形態(tài)上的完整。在體內(nèi)，這些凋亡體^t巨噬細胞或者鄰近的上皮細胞快速地識別和吞噬。由于在體內(nèi)除去凋亡細胞的這種有效的機制，不引發(fā)炎癥性的反應。在體外，凋亡體以及剩余的細胞碎片最終腫脹并最后裂解。體外細胞死亡的這種終末期被稱為"二次壞死"。表1概括了壞死和凋亡之間各種可觀察的差異。優(yōu)選的，修飾的細胞展現(xiàn)出這些特征的一種或多種的降低。任何這些差異，單獨或組合地，可以一皮分才斤以確定細月包死亡是否通過凋亡或通過壞死發(fā)生。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>絲氨酸從細胞質(zhì)到膜的細胞外側(cè)的易位)生理意義影響連續(xù)細胞的群體由非生理性干擾引起(補體攻擊、裂解性病毒、j氐溫、氧不足、缺血、代謝毒物)巨噬細胞的吞噬作用顯著的炎癥性的反應影響單個的細胞由生理學刺激誘導(生長因子的缺乏，激素環(huán)境的改變)鄰近的細胞或巨噬細胞的吞噬作用沒有炎癥性反應表1:壞死和凋亡的區(qū)別特征和意義參考以下文件，它們詳細地描述了凋亡，以及用于凋亡的測量細月包死亡的各種分析Schwartzman,R.A.andCidlowski，J.A.(1993).EndocrineRev.14,133;Vermes,I,andHaa廳，C.(1994)Adv.Clin.Chem.31,177;Berke,G.(1991).Immunol.Today12,396;Kr能enbUhl,O.andTschopp,J.(1991).Immunol.Todayl2,399;VanFurth，R.andVanZwet，T.L.(1988).J.Immunol;Methods108，45.Cohen,J.J.(1993)Apoptosis.Immunol.Todayl4，126;Savill,LS.etal.(1989).J.Clin.Invest.83,865;Wyllie，A.H.(1980).Nature284，555;Leist，M.etal.(1994)BiochemicaNo.3,18-20;Fraser，A.andEvan,G.(1996)Cell85，781-784;Duke,R.C.(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,6361;Duke，R.C.&Cohen,J.J.(1986).LymphokineRes.5，289;Trauth，B.C.etal.(1994)Eur.J.Cell.Biol.63，32,Suppl40;Matzinger,P.(1991).J.Immunol;Methods145，185;Kaeck，M,R.(1993);Anal.Biochem.208,393;Prigent,P.etal.(1993)J.Immunol;Methods160，139;Huang,P.&Plunkett,W.(1992);Anal.Biochem.207，163Bortner,C.D.etal.(1995)TrendsCellBiol.5,21;Gold,R.etal.(1994);Lab.Invest.71，219。凋亡和細胞介導的細胞毒性的特征是在膜崩解之前基因組DNA裂解成分立的碎片。因而，可以通過測量DNA片段化，例如，通過觀察DNA階梯的存在，來分析凋亡。例如，作為來自細胞群體的"階梯"(180bp的重復作為梯子的"橫檔")，或通過經(jīng)由例如ELISA來定量組蛋白復合的DNA片段，可以分析DNA片段。這種分析依靠一步夾心免疫分析來檢測核小體。步驟包括通過離心使細胞團化，棄去上清液(其含有在孵育期間從膜漏出的、來自壞死的細胞的DNA)。在裂解緩沖液中重懸浮并孵育細胞。裂解之后，通過離心使完整的核團化。將上清液的等分量轉(zhuǎn)移到鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板的反應孔，上清液中的核小體與兩種單克隆抗體結(jié)合抗-組蛋白(生物素標記)的單克隆抗體和抗-DNA(過氧化物酶共軛)的單克隆抗體。抗體-核小體復合物通過鏈霉抗生物素蛋白與微量滴定板結(jié)合。洗滌固定化的抗體-組蛋白復合物三次來除去非免疫反應性的細胞成分，樣品與過氧化物酶底物(ABTS)孵育。然后用分光光度法測定有顏色的產(chǎn)物的數(shù)量(因而，測定固定化的抗體-組蛋白復合物的數(shù)量)。幾種蛋白酶涉及凋亡的早期階段。因而，除分析凋亡所誘導的蛋白酶例如胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶3的活性之外，或者不4全測它們的活性，也可以通過纟企測它們的存在分析凋亡?？梢园床煌姆椒?，例如，通過例如細胞溶胞產(chǎn)物的體外酶分析，通過捕獲胱天蛋白酶并測量適合的底物的蛋白水解裂解，可以分析胱天蛋白酶活化。此外，通過4企測體內(nèi)胱天蛋白酶底物例如PARP(聚-ADP-核糖-聚合酶)的裂解，可以分析胱天蛋白酶。PARP的裂解的碎片可以用適合的抗體例如抗PARP抗體來檢測。蛋白酶分析和DNA片段化分析特別適合于分析細胞群體中的凋亡。研究單個細胞中凋亡的方法也是可用的，例如，ISNT和TUNEL酶促標記分析。如上所述，廣泛的DNA降解是在凋亡的早期階段常常發(fā)生的特征性事件。DNA的裂解在高分子量DNA中產(chǎn)生雙鏈的、低分子量的DNA片段(單和寡核小體)以及的單鏈斷裂("切口")。在TUNEL中，這種DNA鏈斷裂通過用適合的修飾的核苷酸(例如，X-dUTP、乂=生物素、DIG或熒光素)來酶促標記游離的3'-OH末端來檢測。適合的標記酶包括ISNT("原位切口翁3譯")中的DNA聚合酶(缺口翻譯)和TUNEL("TdT-mediatedX-dUTPnickendlabeling";Huang,P.&Plunkett,W.，1992,Anal.Biochem.207,163;Bortner,C.D.etal.，1995,TrendsCellBiol.5,21)中的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端標記)。通過測量膜改變也可以分析凋亡，包括末端唾液酸殘基/人細胞表面糖蛋白的側(cè)鏈喪失，暴露新的糖殘基；出現(xiàn)可以充當巨噬細胞分泌的粘附分子例如血小板反應蛋白的受體的表面糖蛋白；細胞膜磷脂不對稱性的喪失，膜表面疏水性和電荷的改變。特別地，人類抗凝素膜聯(lián)蛋白V是35-36千道爾頓、Ca^依賴性磷脂結(jié)合蛋白，其具有對磷脂酰絲氨酸(PS)的高親合力。在正常的存活細胞中，PS位于細胞膜的胞質(zhì)面。然而，在凋亡的細胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)面易位到外側(cè)面，從而將PS暴露于外部的細胞環(huán)境。膜聯(lián)蛋白V因而可以用于檢測不對稱地暴露在凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸(Homburg,C.H.E,etal.1995，腸od85，532;Verhoven,B.etal.，1995,■/Mec/.182,1597)。此外，DNA染料例如DAPI、溴化乙4走和硤化丙錠等等，可以用于差異染色以辨別存活的和非存活的細胞。也可以使用DNA含量的分布型；因而，通透的凋亡細胞泄漏出低分子量DNA，可以通過例如流式細胞計來檢測"亞-Gl峰"或"A0"細胞(與Gl細胞相比具有更低的DNA染色的細胞)的一企測。也以這種方式4全測凋亡的特征性形態(tài)變化。通過4吏用抗體^r測凋亡相關蛋白例如ced-3，ced-4，ced-9(Ellis,H.M.andHorvitz，H.R.，1986，Cell44,817—829;Yuan,J.Y.andHorvitz，H.R.,1990Dev.Biol.138，33—41;Hentgartner，M.O.，Ellis,R.E.andHorvitz,H.R.，1992,Nature356，494-499.)、Fas(CD95/Apo-l;Enarietal"1996，Nature380,723—726)、Bcl隱2(Baffy,G.etal.,1993，J.Biol.Chem.268,6511—6519;Miyashita,T,andReed,J.C.，1993，Blood81，151—157;Oltvai,Z.N.,Milliman,G.L.andKorsmeyer,S.J.,1993,Cell74，609—619)、p53(Yonish-Rouach,E.etal.，1991,Nature352，345-347)等等也可以用于分析凋亡。核苷酸載體多核香酸可以摻入到重組可復制載體中。載體可以用于在相容的宿主細胞中復制所述核酸。因而在進一步的實施方式中，我們提供了通過將多核苷酸導入可復制的載體、將所述載體導入相容的宿主細胞，并在引起所述載體復制的條件下使所述宿主細胞生長來制備多核苷酸的方法。所述載體可以從宿主細胞中回收。適合的宿主細胞包括細菌例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞系和其他真核細胞系，例如昆蟲Sf9細胞。優(yōu)選的，載體中的多核苷酸與控制序列可操作地連接，所述控制序列能夠使宿主細胞表達編碼序列，即，所述載體是表達載體。術(shù)語"可^t喿作地連接"是指所描述的組件處在允許它們按照它們預期的方式起作用的相互關系中。"可操作地連接"到編碼序列的調(diào)節(jié)序列以在與所述控制序列相容的條件下實現(xiàn)所述編碼序列表達的方式連接。所述控制序列可以被修飾，例如通過添加進一步的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，來使得由所述控制序列指導的轉(zhuǎn)錄的水平對于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物更有反應性。載體可以被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到如下所述適合的宿主細胞中來提供蛋白質(zhì)的表達。這個過程可以包括在使編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的載體得以表達的條件下、培養(yǎng)用如上所述的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，并且任選的回收所述表達的蛋白質(zhì)。所述載體可以是，例如，質(zhì)?；虿《据d體，其具有復制起點，任選的用于所述多核苷酸的表達的啟動子，和任選的所述啟動子的調(diào)節(jié)物。載體可以含有一種或多種選擇性標記基因，例如對于細菌質(zhì)粒來說為氨千青霉素抗性基因，對于哺乳動物載體來說為新霉素抗性基因。載體可以用來，例如，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。與編碼蛋白質(zhì)的序列可操作連接的控制序列包括啟動子/增強子和其他表達調(diào)節(jié)信號?？梢赃x擇這些控制序列來與表達載體被設計來在其中表達的宿主細胞相容。術(shù)語"啟動子"是本領域公知的，涵蓋從最小的啟動子到包括上游元件和增強子的啟動子的在大小和復雜度上不同的核酸區(qū)域。啟動子一般從在哺乳動物細胞中有功能的啟動子中選擇，雖然也可以使用原核啟動子和在其他真核細胞中有功能的啟動子。啟動子一般來源于病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是來自其中將要發(fā)生表達的細胞的基因組。對于真核啟動子，它們可以是以遍在的方式起作用的啟動子(例如，a-肌動蛋白、卩肌動蛋白、微管蛋白啟動子)，或作為選擇，以組織特異性方式起作用的啟動子(例如，丙酮酸激酶的基因的啟動子)。它們也可以是響應特定的刺激的啟動子，例如，結(jié)合甾類激素受體的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠白血病病毒長末端重復序列(MMLVLTR)啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)正啟動子。同樣有益的是啟動子是可誘導的，從而異源基因的表達水平可以在細胞的生命期期間被調(diào)節(jié)。"可誘導的"是指使用啟動子獲得的表達水平可以-陂調(diào)節(jié)。此外，任何這些啟動子可以通過添加進一步的調(diào)節(jié)序列，例如增強子序列而被修飾。也可以使用包含來自如上所述兩個或多個不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽的表達為了表達生物學活性的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽，將中國倉鼠FAIM、FADD、PDCD6或Requiem多核苦酸序列與調(diào)控序列相連以使調(diào)控序列指導所述多核苷酸的表達。然后使得在所述調(diào)控序列的控制下進行多肽的表達。任選的，這樣產(chǎn)生的多肽可以被純化。優(yōu)選的，調(diào)控序列是不與FAIM、FADD、PDCD6或Requiem多核苷酸序列天然相連的調(diào)控序列。因此我們描述了生產(chǎn)多肽的方法，包括提供細胞，優(yōu)選的中國倉鼠細胞，其中中國倉鼠FAIM、FADD、PDCD6或Requiem多核苷酸序列已經(jīng)與調(diào)控序列相連以使得調(diào)控序列指導所述多核苷酸的表達，并在使所述多肽得以表達的條件下培養(yǎng)所述細胞，以及任選的純化所述多肽。我們進一步描述了生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)提供表達序列，其是通過使中國倉鼠FAIM、FADD、PDCD6或Requiem多核苷酸序列與調(diào)控序列相連使得調(diào)控序列指導所述多核苷酸的表達而產(chǎn)生的；(b)使得所述多肽在所述調(diào)控序列的控制下從所述表達序列表達，和(c)任選的純化所述多肽。特別地，編碼相應的核酸或其同源物、變體或衍生物的核苷酸序列可以插入到合適的表達載體中，即，含有對于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體。我們還提供了通過任何上述方法產(chǎn)生的多肽。使cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem多肽得以表達的方法在下文列出。要理解的是，這些方法可能適用于在此描述的方法和組合物的實施方式，在這些實施方式中期望對多肽進行增量調(diào)節(jié)，例如cgFADD的增量調(diào)節(jié)以實現(xiàn)增強的細胞生存力。提供表達的多肽的一種方法是通過表達載體的方式，即，含有可調(diào)控的啟動子，任選的具有其他調(diào)控序列例如增強子的載體(例如，質(zhì)粒)，所述調(diào)控序列與已經(jīng)克隆到表達載體中編碼目的多肽的序列可操作連接。可以用本領域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻i,控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。在Sambrook，J.etal.(1989;MolecularCloning,ALaboratoryManual,ch.4，8,and16-17，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.)和Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)中描述了這樣的技術(shù)?？梢岳酶鞣N表達載體/宿主系統(tǒng)來包含和表達編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列。這些包括，但不限于，微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體感染的昆蟲細胞系統(tǒng)(例如，桿狀病毒)；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))或用細菌表達載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)?？梢葬娪萌魏芜m合的宿主細胞。"控制元件"或"調(diào)控序列"是載體的非翻譯區(qū)域(即，增強子、啟動子和5，和3，非翻譯區(qū))，其與宿主細胞蛋白質(zhì)相互作用來進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件可以在它們的強度和特異性上有所不同。取決于使用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的適合的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和可誘導的啟動子。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用可誘導的啟動子，例如BLUESCRIPT喧菌粒的雜合體lacZ啟動子(Stratagene，LaJolla，Calif.),或PSPORT1質(zhì)粒(GIBCO/BRL)等等。可以在昆蟲細胞中使用桿狀病毒多角體蛋白啟動子。來自植物細胞基因組(例如，熱休克、RUBISCO和貝i藏蛋白基因)的啟動子或增強子或來自植物病毒的啟動子或增強子(例如，病毒啟動子或前導序列)可以克隆到載體中。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子是優(yōu)選的。如果必需產(chǎn)生含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列的多個拷貝的細胞系，可以使用帶有合適的選4奪性標記的基于SV40或EBV的載體。在細菌系統(tǒng)中，取決于cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的預定用途，可以選4奪許多表達載體。例如，當需要大量的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem用于抗體誘導時，可以使用指導易于純化的融合蛋白的高水平表達的載體。這種載體包括，但不限于，多功能的大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT(Stratagene),其中編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列可以與氨基末端Met和隨后的P-半乳糖苷酶的7個殘基按讀碼框連接到載體中，具有從而產(chǎn)生雜合體蛋白，pIN載體(VanHeeke，G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem,264:5503-5509)，等等。pGEX載體(Promega，Madison,Wis.)也可以用于將外源多肽表達為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般地，這種融合蛋白是可溶的，通過吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠上繼之在游離谷胱甘肽存在下洗脫，可以容易地從裂解的細胞純化。在這種系統(tǒng)中制備的蛋白質(zhì)可以被設計以包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶裂解位點，從而克隆的目標多肽可以隨意從GST部分釋放。在酵母Sacc/zaramycwcereWw'ae中，可以使用含有組成型或可誘導啟動子，例如a因子、醇氧化酶和PGH的許多載體。對于綜述，參見Ausubel(同上)和Grantetal.(1987;MethodsEnzymol.153:516-544)。在使用植物表達載體的情況下，編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列的表達可以被許多啟動子的任一種驅(qū)動。例如，病毒啟動子，例如CaMV的35S和19S啟動子可以單獨使用或與來自TMV的Q前導序列組合使用。(Takamatsu，N.(1987)EMBOJ.6:307匿311)做為選纟奪，可以使用植物啟動子例如RUBISCO的小亞基或熱激啟動子。(Coruzzi，G.etal.(1984)EMBOJ.3:1671-1680;Broglie,R.etal.(1984)Science224:838-843;和Winter,J.etal.(1991)ResultsProbl.CellDiffer.17:85-105.)通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導的轉(zhuǎn)染，這些構(gòu)建體可以一皮導入植物細胞。在許多一般可獲得的綜述中描述了這些技術(shù)。(參見，例如Hobbs，S.orMurry,L.E.inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill,NewYork,N.Y.;pp.191-196.)。也可以使用昆蟲系統(tǒng)來表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem。例如，在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿丫纟丈4l蛾(^Wograp/wca/z^brm.ca)核多角體病病毒(nuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)#皮用作在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞或4艮纟文夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因的載體。編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列可以被克隆到病毒的非必需區(qū)域，例如核多角體蛋白基因，并置于核多角體蛋白啟動子的控制下。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的成功插入將使得核多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。然后所述重組病毒可以用于感染，例如草地夜蛾細胞或4艮紋夜蛾幼蟲，在其中cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem可以被表達。(Engelhard,E.K.etal.(1994)Proc.Nat,Acad.Sci.91:3224-3227.)在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基于病毒的表達系統(tǒng)。在腺病毒用作表達載體的情況下，編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的序列可以連接到由晚期啟動子和三聯(lián)(tripartite)前導序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復合物中。在病毒基因組非必需El或E3區(qū)域中的插入，可以用來獲得能在受感染宿主細胞中表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的存活病毒(Logan,J.andT.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659.)。此夕卜，轉(zhuǎn)錄增強子，例如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子，可以用來提高在哺乳動物宿主細胞中的表達。因而，例如，在人胚腎293(HEK293)細胞或貼壁dhfrCHO細胞中表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem蛋白質(zhì)。為了最大化受體表達，一般在插入到pCDN或pCDNA3載體中之前從受體cDNA中除去所有的5，和3'非翻譯區(qū)域(UTR)。通過lipofectin用單個受體cDNA轉(zhuǎn)染細胞，并在400mg/mlG418存在下選擇。在3周的選4奪之后，挑選單個克隆并擴展用于進一步的分析。只用載體轉(zhuǎn)染的HEK293或CHO細胞充當陰性對照。為了分離穩(wěn)定地表達單個受體的細胞系，一般選擇約24個克隆并通過Northern印跡分析來分析。一般在被分析的G418抗性克隆的約50%中可檢測到受體mRNA。也可以采用人的人工染色體(HAC)來遞送比可在質(zhì)粒中包含和表達的DNA更大的DNA片段。構(gòu)建約6kb到10Mb的HAC,并經(jīng)由常規(guī)的遞送方法(脂質(zhì)體、聚陽離子氨基聚合物或嚢泡)來遞送用于治療目的。也可以使用特異性起始信號來實現(xiàn)編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列的更有效的翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。在編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列和它的起始密碼子和上游序列被插入合適的表達載體的情況下，不需要其他的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。然而，在僅插入編碼序列或其片段的情況下，應當提供外源的翻i奪控制信號，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應該處在正確的閱讀框中以確保完整插入物的翻:^奪。外源的翻"^奪元件和起始密碼子可以是各種來源的，天然的和合成的。通過包含適合于所使用的特定細胞系統(tǒng)的增強子，例如在文獻中描述的那些，可以增強表達的效力。(Scharf,D.etal,(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125-162.)此外，可以選擇宿主細胞菌林調(diào)節(jié)插入的序列的表達，或以期望的方式加工表達的蛋白質(zhì)的能力。多肽的這種修飾包括但不限于，乙酰化、羧化作用、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化作用。也可以使用裂解蛋白質(zhì)的"前原"形式的翻譯后加工來促進正確的插入、折疊和/或功能。具有翻譯后活性的特異性細胞系統(tǒng)和特征性機制的不同的宿主細胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)可以從美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC,Bethesda，Md.)獲得，并可以選擇來確保外源蛋白的正確修飾和加工。對于重組蛋白質(zhì)的長期、高產(chǎn)量生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，能穩(wěn)定表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的細胞系可以使用在同一個或分開的載體上含有病毒復制起點和/或內(nèi)源表達元件和選擇性標記基因的表達載體來轉(zhuǎn)化。在導入外源載體之后，可以使細胞在富集培養(yǎng)基中生長約1_2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基。選擇性標記的目的是賦予對選擇的抗性，它的存在使得成功表達導入的序列的細胞得以生長和回收。穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆可以使用適合于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)來增殖?？梢允褂迷S多選擇系統(tǒng)來回收轉(zhuǎn)化的細胞系。這些包括但不限于，單純性皰滲病毒胸苷激酶基因(Wigler，M,etal.(1977)Cell11:223-32)和腺噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy,I.etal.(1980)Cell22:817-23)，其可以分別應用于tk-或apf細胞。同樣，可以使用抗代謝物、抗生素或除草劑抗性作為選"t奪的基礎。例如，dhfr賦予對氨曱蝶呤的抗性(Wigler,M.etal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:3567-70);npt賦予對氨基糖苷類新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin,F.etal(1981)J.Mol.Biol.150:1-14);以及als或pat分別賦予對氯石黃隆(chlorsulfuron)和phosphinotricin轉(zhuǎn)乙酰酶的抗性(Murry，同上)。已經(jīng)描述了其他的可選擇基因，例如，trpB，其使得細胞利用吲味而不是色氨酸，或hisD,其容許細胞利用histinol而不是組氨酸。(Hartman，S.C.andR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047-51.)近來，可見標記的使用變得流行，這種標記物如花色素苷，卩-葡糖醛酸酶和它的底物，和熒光素酶和它的底物螢光素?？梢允褂眠@些標記來不僅是鑒定轉(zhuǎn)化體，還定量可歸因于特定載體系統(tǒng)的短暫的或穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達的數(shù)量。(Rhodes,C.A.etal.(1995)MethodsMol.Biol.55:121-131.)雖然標記基因表達的存在/缺乏表明目標基因也存在，可能需要確認基因的存在和表達。例如，如果編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列被插入到標記基因序列內(nèi)，可以通過標記基因功能的缺乏來鑒定含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列的轉(zhuǎn)化細胞。做為選擇，標記基因可以在單個啟動子的控制下與編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列串聯(lián)。響應于誘導或選4奪的標記基因表達通常表明串聯(lián)的基因也表達。做為選擇，含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的核酸序列并且表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的宿主細胞可以通過本領域技術(shù)人員已知的各種步驟來鑒定。這些步驟包括但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物分析或免疫分析4支術(shù)，其包括基于膜、溶液或芯片的技術(shù)，用于核酸或蛋白質(zhì)序列的檢測和/或定量。編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的多核苷酸序列的存在可以通過使用編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的多核苷酸的片段的探針或片段的DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴增來4全測?；诤怂釘U增的分析包括使用基于編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列的寡核苷酸或寡聚物來檢測含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的DNA或RNA的轉(zhuǎn)化體。使用特異于蛋白質(zhì)的多克隆或單克隆抗體、用于檢測和測量cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的表達的各種方案是本領域已知的。這些技術(shù)的實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和熒光活化的細胞分選(FACS)。優(yōu)選雙位點、基于單克隆的免疫分析，該分片斤利用與cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem上兩個互不干擾的表位反應的單克隆抗體，但也可以采用竟爭性結(jié)合分析。本領域例如在Hampton,R.etal.(1990;SerologicalMethods,aLaboratoryManual,SectionIV，APSPress,StPaul,Minn.)中和Maddox,D.E.etal.(1983;J.Exp.Med.158:1211-1216)中^f艮好地描述了這些和其他的分析。各種標記和偶聯(lián)技術(shù)是本領域技術(shù)人員已知的，可以用于各種核酸和氨基酸分析中。產(chǎn)生標記的雜交物或PCRJ笨針用于檢測與編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的多核苷酸相關的序列的方法包括寡核苦S菱標記(oligolabeling)、切口翻譯、末端標i己或4吏用標記的核苷酸的PCR擴增。估文為選4奪，編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列或其任何片段，可以被克隆到載體中用于mRNA探針的產(chǎn)生。這些載體是本領域已知的，是商業(yè)上可獲得的，可以用于通過添加合適的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和標記的核苷酸來體外合成RNA探針。這些步驟可以使用各種商業(yè)上可獲得的試劑盒來進行，例如由Pharmacia&Upjohn(Kalamazoo,Mich.)、Promega(Madison,Wis.)和U.S.BiochemicalCorp.(Cleveland,Ohio)提供的那些。可以用來易化檢測的適合的報告物分子或標記包括放射性核素、酶、焚光劑、化學發(fā)光劑或顯色劑，以及底物、輔助因子、抑制物、；茲性粒子，等等。用編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的核苷酸序列養(yǎng)。取決于使用的序列和/或載體，通過轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以位于細胞膜中、是分泌的或被包含于細胞內(nèi)。本領域技術(shù)人員將理解的是，含有編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem的多核苷酸的表達載體可以被設計以含有信號序列，其指導cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem穿過原核或真核細胞膜的分泌。其他構(gòu)建體可以用來將編碼cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的序列連接到編碼多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所述多肽結(jié)構(gòu)域?qū)⒈阌诳扇艿鞍踪|(zhì)的純化。這種促進純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于，金屬螯合肽例如組氨酸-色氨酸模塊，其容許在固定化的金屬上純化；蛋白A結(jié)構(gòu)域，其容許在固定化的免疫球蛋白上純化；和在FLAGS延伸/親合純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域(ImmunexCorp.,Seattle,Wash.)。在純化結(jié)構(gòu)域和cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem編碼序列之間包括可裂解接頭序列，例如特異于因子XA或腸激酶(Invitrogen，SanDiego，Calif.)的序列，可以用來便于純化。一種這樣的表達載體提供了融合蛋白的表達，所述融合蛋白含有cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem和在碌u氧還蛋白或腸激酶裂解4立點之前的編碼6個組氨酸殘基的核酸。組氨酸殘基便于在固定化的金屬離子親和層析上純化(IMIAC;describedinPorath，J.etal.(1992)Prot.Exp.Purif,3:263-281)，而腸激酶裂解位點提供了從融合蛋白純化cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的手段。在Kroll,D.J.etal.(1993;DNACellBiol.12:441-453)中提供含有融合蛋白的載體的論述。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的片孚爻，以及全長多肽，不僅可以通過重組生產(chǎn)來產(chǎn)生，還可以通過使用固相技術(shù)的直接的肽合成來產(chǎn)生。(MerrifieldJ.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154.)可以利用手工技術(shù)或通過自動裝置進行蛋白質(zhì)合成。例如，使用AppliedBiosystems431A肽合成儀(PerkinElmer)可以實現(xiàn)自動化的合成。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的各種片段可以分開合成，然后組合來產(chǎn)生全長分子。其他表達方法也是已知的，例如，可以采用稱為"基因活化"的方法來調(diào)節(jié)cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的活性或表達。這種方法在US專利號5,641,670中詳細描述了，通過引用合并在此。大體上，基因活化方法是基于這樣的認識，細胞中目的內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)或活性可以通過在細胞基因組中預定位點通過同源重組插入適合的DNA構(gòu)建體來改變，所述合適的DNA構(gòu)建體包括(a)目標序列；(b)調(diào)控序列；(c)外顯子和(d)不配對的剪接-供體位點，其中所述目標序列指導元件(a)-(d)的整合，從而元件(b)-(d)可操作地連接到內(nèi)源基因。所述DNA構(gòu)建體做為選擇可以包含(a)目標序列，(b)調(diào)控序列，(c)外顯子，(d)剪接-供體位點，(e)內(nèi)含子和(f)剪接-受體位點，其中所述目標序列指導元件(a)-(f)的整合，從而元件(b)-(f)可操作地連接到內(nèi)源基因的第一外顯子。參考其中將要插入DNA的位點來選擇使用的目標序列。在兩種方案中，使用靶向事件來產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄單位，其是由所述靶向DNA構(gòu)建體導入的序列和內(nèi)源細胞基因的融合產(chǎn)物。例如，新的轉(zhuǎn)錄單位的形成容許通過向宿主細胞的基因組中導入所描述的DNA構(gòu)建體來使轉(zhuǎn)錄沉默基因(在轉(zhuǎn)染前在細胞中不表達的基因)被活化。如所獲得的在細胞中被表達的內(nèi)源基因例如cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6或cgRequiem的表達可以祐:改變，即它被提高、降低，包括被消除，或者可以通過使用基因活化方法改變調(diào)控或誘導模式?？贵w可被用來調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的活性的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的特異性拮抗劑可以包括針對一種或多種所述蛋白質(zhì)的抗體。特別地，能夠結(jié)合cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem的抗體，優(yōu)選的能夠抑制其任何生物學活性的抗體，適合用于減量調(diào)節(jié)相關蛋白質(zhì)的表達，以增強細胞生存力。因此我們特別地提供了抗-cgFADD、抗-cgFAIM、抗-cgPDCD6和抗-cgRequiem抗體，以及產(chǎn)生它們的方法。如在此使用的，抗體是指完整的抗體或能夠結(jié)合選擇的目標的抗體片段，包括Fv、ScFv、Fab'和F(ab')2，單克隆和多克隆的抗體，工程化的抗體，包括嵌合的、CDR移植的和人源化的抗體，和使用噬菌體展示或可選擇的技術(shù)產(chǎn)生的人工選擇的抗體。小的片段，例如Fv和ScFv，由于它們尺寸很小和隨之的優(yōu)越的組織分布，具有用于診斷和治療應用的有益性質(zhì)。在此描述的抗-cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem抗體可以用于例如在細胞的環(huán)境中相關蛋白質(zhì)的檢測。因而，它們可以是包含效應物蛋白例如標記的改變的抗體。特別優(yōu)選的是能夠為抗體的體內(nèi)或體外分布成4象的標記。這些標記可以是方文射性標記或不透射線的標記，例如金屬微粒，其在胚或細胞團塊內(nèi)是可以容易地看見的。此外，它們可以是熒光標記或在組織樣品上可見的其他標記。重組DNA技術(shù)可以用于改進在此描述的抗體。因而，可以構(gòu)建嵌合抗體來降低其在診斷或治療應用中的免疫原性。此外，通過CDR移植[參見歐洲專利申請0239400(Winter)]和任選的,骨架修飾[EP0239400]來人源化抗體，可以使免疫原性最小化?？?cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和cgRequiem抗體可以/人動物血清獲得，或?qū)慰寺】贵w或其片段來說，可以在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。DNA重組技術(shù)可以用來根據(jù)規(guī)定程序在細菌或優(yōu)選哺乳動物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生抗體。所選4奪的細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)優(yōu)選地分泌抗體產(chǎn)物。因而，我們公開了用于抗體的生產(chǎn)的過程，包括培養(yǎng)宿主，例如大腸桿菌或哺乳動物細胞，其已經(jīng)用包含表達盒的雜合體載體轉(zhuǎn)化，所述表達盒包含與編碼信號肽的第一DNA序列可操作連接的啟動子，所述第一DNA序列按適當?shù)淖x碼框與編碼所述抗體蛋白質(zhì)的第二DNA序列連接，以及分離所述蛋白質(zhì)。在適合的培養(yǎng)基中進行雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外擴增，所述培養(yǎng)基是慣用的標準培養(yǎng)基，例如Dulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)或RPMI1640培養(yǎng)基，任選的補充有哺乳動物血清，例如胎牛血清，或痕量元素和生長維持添加劑，例如飼養(yǎng)細胞如正常的小鼠腹腔滲出物細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞、2-氨基乙醇、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸，等等。本身是細菌細胞或酵母細胞的宿主細胞增殖同樣地在本領域已知的適合培養(yǎng)基中進行，例如對于細菌，在LB培養(yǎng)基、NZCYM培養(yǎng)基、NZYM培養(yǎng)基、NZM培養(yǎng)基、TerrificBroth、SOB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基、2xYT培養(yǎng)基或M9基本培養(yǎng)基中進行，對于酵母在YPD培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基或CompleteMinimalDropout培養(yǎng)基中進行。體外生產(chǎn)提供了相對純的抗體制備物，并且容許規(guī)模擴大來得到大量的期望抗體。細菌細胞、酵母或哺乳動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)是本領域已知的，包括均勻懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應器中或在連續(xù)攪拌反應器中，或者固定化的或捕集的(entrapped)細胞培養(yǎng)，例如空心纖維、微嚢中，在瓊脂糖微J朱或陶資筒(cartridge)上。也可以通過體內(nèi)擴增哺乳動物細胞來獲得大量的期望抗體。為此，將產(chǎn)生期望的抗體的雜交瘤細胞注射到組織相容的哺乳動物中來引起生產(chǎn)抗體的腫瘤生長。任選的，在注射之前，動物用烴、特別是礦物油例如姥鮫烷(四曱基-十五烷)預處理(prime)。在一到三周后，將抗體從這些哺乳動物的體液中分離。例如，向任選的用異十八烷預處理的BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射雜交瘤細胞或轉(zhuǎn)染的細胞，一到兩周后，從動物采集腹水；其中所述雜交瘤細胞通過融合適合的骨髓瘤細胞和來自Balb/c小鼠的生產(chǎn)抗體的脾細胞獲得，所述轉(zhuǎn)染的細胞來自產(chǎn)生期望抗體的雜交瘤細胞系Sp2/0。在例如KohlerandMilstein，(1975)Nature256:495-497;US4,376,110;HarlowandLane,Antibodies:aLaboratoryManual,(1988)ColdSpringHarbor中討論了上述的和其他的技術(shù)，通過參考在此引用。制備重組抗體分子的技術(shù)在上述參考文獻中描述了，并且也在例如EP0623679;EP0368684和EP0436597中描述了，通過參考將它們在此引用。例如，通過免疫印跡、通過酶免疫分析，例如夾心分析或斑點分析，或放射免疫分析，來篩選細胞培養(yǎng)物上清液中期望的抗體。為了分離抗體，可以濃縮培養(yǎng)物上清液或腹水中的免疫球蛋白，例如，通過用硫酸銨沉淀、相對吸濕性材料例如聚乙二醇透析、通過選擇性膜過濾，等等。如果必要和/或希望，通過常規(guī)的層析方法來純化抗體，例如凝膠過濾、離子交換層析、在DEAE-纖維素上層析和/或(免疫)親和層析，例如使用cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem或其片段或使用蛋白-A的親和層析。還提供了分泌單克隆抗體的雜交瘤。優(yōu)選的雜交瘤細胞是遺傳上穩(wěn)定的，分泌具有期望的特異性的單克隆抗體，并可以通過解凍和重克隆從深度冷凍的培養(yǎng)物中激活。還包括制備分泌針對cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，其特征在于，用一種或多種cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽、或其抗原性片羊爻免疫適合的哺乳動物，例如BALB/c小鼠；將被免疫動物的生產(chǎn)抗體的細胞與適合的骨髓瘤細胞系的細胞融合，克隆融合中所獲得的雜交細胞，選擇分泌期望的抗體的細胞克隆。例如，用cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem免疫的BALB/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag14的細胞融合，篩選獲得的雜交細胞的期望抗體的分泌，克隆陽性的雜交瘤細胞。優(yōu)選的是制備雜交瘤細胞系的方法，其特征在于，在幾個月內(nèi)，例如在兩個月和四個月之間，通過皮下和/或腹膜內(nèi)注射10和107和108之間個表達cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的細胞和適合的佐劑凄史次，例如四到六次，在最后一次注射后兩到四天從被免疫小鼠采集脾細胞，并在存在融合啟始物、優(yōu)選的聚乙二醇的情況下與骨髓瘤細胞系PAI的細胞融合。優(yōu)選的，骨髓瘤細胞在含有約30%到約50%、分子量約4000的聚乙二醇的溶液中與三到二十倍過量的來自被免疫小鼠的脾細胞融合。融合之后，細胞如上所迷以一定的間隔在補充有選4奪培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基的適合的培養(yǎng)基中擴展，以防止正常的骨髓瘤細胞生長超過期望的雜交瘤細胞。還公開了包含插入物的重組DNA，所述插入物編碼針對如上所述cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。根據(jù)定義，這種DNA包括編碼單鏈的DNA、由所述編碼DNA和其互補DNA組成雙鏈的DNA，或這些互補(單鏈的)DNA本身。此夕卜，編碼4十對cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的4元體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的DNA可以是酶學或化學合成的DNA,其具有編碼重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的真正(authentic)DNA序列或其突變體。真正DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的DNA，所述抗體中一個或多個氨基酸被缺失或用一種或多種其他氨基酸替換。優(yōu)選的，所述一個或多個修飾在抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的CDR之外。這種突變DNA還意指沉默突變，其中一個或多個核苷酸尋皮具有編碼相同的一個或多個氨基酸的新密碼子的其他核苷酸替換。這種突變序列也是簡并序列。簡并序列在遺傳密碼的意義上是簡并的，其中無限數(shù)量的核普酸被其他核苷酸替換而不引起最初編碼的氨基酸序列的改變。由于它們不同的限制性位點和/或為特定的宿主、特別是大腸桿菌所偏愛的特定密碼子頻率，這種簡并序列可用于獲得重鏈鼠可變區(qū)和/或輕鏈鼠可變區(qū)的最佳的表達。術(shù)語突變體意圖包括通過根據(jù)本領域已知方法對真正DNA體外誘變獲得的DNA突變體。對于完整的四聚免疫球蛋白分子的組裝和嵌合抗體的表達，將編碼重《連和輕《連可變區(qū)的重組DNA插入物與編碼重《連和輕鏈恒定區(qū)的相應DNA融合，然后例如在摻入雜合體載體之后，轉(zhuǎn)移到合適的宿主細胞內(nèi)。還公開的是重組DNA，其包含插入物，所述插入物編碼與人類恒定區(qū)，例3口yl、丫2、或丫4,伊乙選的yl或y4融合的、4十乂于cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的抗體的重鏈鼠可變區(qū)。同樣地還公開了重組DNA,其包含編碼與人類恒定區(qū)k或X,優(yōu)選的k融合的、針對cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem的抗體的輕鏈鼠可變區(qū)的插入物。在另一個實施方式中，我們^^開了編碼重組多肽的重組DNA，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過間隔區(qū)基團的方式連接，任選的包含便于抗體在宿主細胞中加工的信號序列和/或編碼便于抗體純化的肽的DNA和/或裂解位點和/或肽間隔區(qū)和/或效應物分子。編碼效應物分子的DNA意圖是編碼在診斷或治療應用中有用的效應物分子的DNA。因而，特別指明是毒素或酶，特別是能催化前體藥物的活化的酶的效應物分子。編碼這種效應物分子的DNA具有編碼天然發(fā)生的酶或毒素的DNA的序列，或其突變體，并且可以通過本領域公知的方法制備。制劑和施用肽和多肽，例如cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem肽和多肽，核酸和多核苷酸和激動劑和拮抗劑肽或小分子，可以與適合的藥物運載體一同配制。這種制劑包含治療有效量多肽或化合物，和藥學上可接受的運載體或賦形劑。這種運載體包括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合。制劑應當適合于施用方式，并且是本領域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。我們進一步描述了藥物包裝和試劑盒，其包含裝有上述的組合物的一種或多種成分的一個或多個容器。所述多肽和其他化合物可以單獨使用，或與其他化合物例如治療化合物一同4吏用。藥物組合物的全身性施用的優(yōu)選的形式包括注射，一般為靜脈內(nèi)注射?？梢允褂闷渌⑸渫緩?，例如皮下的、肌肉內(nèi)的或腹膜內(nèi)的。全身性施用的可選擇的方法包括經(jīng)粘膜和經(jīng)表皮施用，使用滲透劑例如膽汁鹽或羧鏈孢酸或其他洗滌劑。此外，如果適當?shù)嘏渲圃谀c的或膠嚢的制劑中，口服施用也是可能的。這些化合物的施用也可以是局部的和/或局部化的，以藥膏、膏劑、凝膠劑等等的形式。所需的劑量范圍取決于肽的選擇、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、受試者病癥的性質(zhì)和主治醫(yī)師的判斷。然而，適合的劑量在0.1-100嗎/kg受試者的范圍內(nèi)。然而，考慮到可用化合物的種類和各種給藥途徑的不同效率，預料所需劑量存在很大變化。例如，預計口服施用比靜脈內(nèi)注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可以使用本領域充分了解的經(jīng)驗性規(guī)則來調(diào)整以優(yōu)化。用于治療的肽也可以在以如上所述的常稱為"基因治療，，的治療模式中在受試者中內(nèi)源地產(chǎn)生。因而，例如，受試者的細胞可以用多核苷酸，例如DNA或RNA,加以工程化，來先體外后體內(nèi)(exvivo)編碼多肽，并且例如，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體。然后將細胞導入受試者中。藥物組合物我們還提供了藥物組合物，包括施用治療有效量的多肽、多核苷酸、肽、載體或抗體(例如cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem多肽，等等)和任選的藥學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。所述藥物組合物可以在人和獸醫(yī)學中用于人類或動物使用，一般將包括任何一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、運載體或賦形劑。用于治療用途的可接受的運載體或稀釋劑是藥物領域公知的，在例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述了。藥物運載體、賦形劑或稀釋劑的選擇也可以根據(jù)預定的施用途徑和標準的藥物實踐來選擇。藥物組合物可以包含作為運載體、賦形劑或稀釋劑的，或除運載體、賦形劑或稀釋劑之外的任何適合的一種或多種粘合劑、一種或多種潤滑劑、一種或多種懸浮劑、一種或多種包被劑、一種或多種增溶劑。可以在藥物組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味劑。防腐劑的實例包括苯曱酸鈉、山梨酸和對羥基苯曱酸酯。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。取決于不同的遞送系統(tǒng)存在著不同的組合物/制劑需求。舉例來說，在作為用于吸入或可攝取溶液的鼻噴霧或氣霧劑，或胃腸外地遞送，其中組合物以可注射的形式配制，用于通過例如靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或皮下的途徑來遞送。做為選擇，可以對制劑進行設計來通過兩種途徑遞送。當試劑要通過胃腸粘膜來經(jīng)粘膜遞送時，在通過胃腸道轉(zhuǎn)運期間它應當能保持穩(wěn)定；例如，它應當對蛋白水解降解有抗性、在酸性pH下穩(wěn)定并且對膽汁的去污劑作用有抗性。在合適時，可以通過吸入施用、以栓劑或陰道栓的形式施用、以洗液、溶液、乳膏劑、軟膏劑或樸粉形式的局部施用、通過使用皮膚貼片施用、以含有賦形劑例如淀粉或乳糖的片劑形式口服施用、單獨的或與賦形劑混合在膠嚢或嚢泡(ovule)中、或以含有增味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液的形式、或它們可以胃腸外注射，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)內(nèi)或皮下注射。對于腸胃外施用，組合物可以最好以無菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖來使溶液與血液等滲。對于頰或舌下的施用，組合物可以以可按照常規(guī)的方式配制的片劑或錠劑的形式施用。疫苗另一個實施方式涉及在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，其包括用cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽或其片段接種所述哺乳動物，其足以產(chǎn)生抗體和/或T細胞免疫反應來保護所述動物免于cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem相關的疾病。又一個實施方式涉及在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，其包括經(jīng)由指導cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多核苦酸的體內(nèi)表達的載體來遞送cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem多肽，以誘導這種免疫反應來產(chǎn)生抗體以保護所述動物免于疾病。進一步的實施方式涉及免疫的/疫苗制劑(組合物)，當被導入哺乳動物宿主時，其在該哺乳動物中誘導針對cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽的免疫學反應，其中所述組合物包含cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽或cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem基因。疫苗制劑可以進一步包含適合的運載體。由于cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgR叫uiem多肽可以在胃中被降解，優(yōu)選的是胃腸外施用(包括皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的注射等等)。適合于腸胃外施用的制劑包括含水和無水的無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得制劑與接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及含水和無水的無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑或增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿瓶和小瓶，并可以保存在凍干的條件中，僅需要在使用前即時添加無菌的液體運載體。疫苗制劑還可以包括用于增強制劑的免疫原性的佐劑系統(tǒng)，例如水包油系統(tǒng)或本領域已知的其他系統(tǒng)。劑量將取決于疫苗的比活性，可以通過常規(guī)實驗容易地確定。疫苗可以^v在此描述的一種或多種多肽或肽來制備。制備含有免疫原性的一種或多種多肽或肽作為一種或多種活性成分的疫苗是本領域技術(shù)人員已知的。一般地，這種疫苗被制備為作為液體溶液或懸浮液的注射劑；也可以制備適合于在注射之前溶解于或懸浮于液體的固體形式。制品也可以是乳化的，或是封裝入脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)?；钚悦庖咴猿煞殖３Ｅc藥學上可接受的并且與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，和其組合。此外，如果希望，疫苗可以含有微量的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH值緩沖劑和/或增強疫苗的有效性的佐劑?？赡苡行У淖魟┑膶嵗ǖ幌抻跉溲趸X、N-乙酰-胞壁?；?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637,稱為nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(r-2，-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)、和RIBI,其含有在2。/。角鯊烯/Tween80乳劑中的從細菌提取的三種成分單磷?；|(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑和其他試劑的進一步的實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、>琉酸鋁鉀(明礬)、硫酸鈹、硅土、高嶺土、碳、油包水乳劑、水包油乳劑、胞壁酰二肽、纟田菌內(nèi)毒素、月旨質(zhì)X、短小才奉狀4干菌(Co^yweZ)acfen'MwparvMm)(4分刺丙酸菌(/Vo//owo6a"en^w))、百日咳牙干菌(5onie/e〃a)、多核糖核苷酸、海藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、鬼角苷、脂質(zhì)體、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其他合成的佐劑。這些佐劑可以從各種來源商業(yè)上獲得例如，MerckAdjuvant65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,N丄)，或弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan)。一般地，使用佐劑例如Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氫氧化鋁)或Amphigen和Alhydrogel的混合物。僅僅氫氧化鋁被批準用于人類。免疫原和佐劑的比例可以在寬的范圍上變化，只要兩者都以有效量存在。例如，氫氧化鋁可以以疫苗混合物的約0.5%的數(shù)量存在(八1203基礎)。方便地，配制疫苗來含有范圍從0.2到200嗎/ml、優(yōu)選的5到50(xg/ml、最優(yōu)選的15嗎/ml的免疫原終濃度。在制劑之后，疫苗可以被摻入無菌容器，其然后被密封并保存在低溫，例如4。C，或它可以被凍干。凍干法允許以穩(wěn)定的形式長期保存。疫苗通過注射，例如皮下地或肌內(nèi)地，常規(guī)胃腸外施用。適合于其他施用方式的另外的制劑包括栓劑，和在某些情況下，口服制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和運載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；這些栓劑可以由含有范圍為0.5%到10%、優(yōu)選的1%到2%的活性成分的混合物形成?？诜苿┛梢园ㄍǔａ娪玫馁x形劑，例如藥物級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠嚢、緩釋制劑或粉未的形式，并含有10%到95%、優(yōu)選25%到70%的活性成分。當疫苗組合物是凍干的時，可以例如作為懸浮液在施用之前重構(gòu)凍干的材料。重構(gòu)優(yōu)選的在緩沖液中進行。用于給患者口服施用的膠嚢、片劑和丸劑可以具有腸溶包衣，其包含，例如，Eudragit"S"、Eudragit"L"、醋酸纖維素、苯二曱酸醋酸纖維素或羥基丙基曱基纖維素。在此描述的多肽可以以中性或鹽形式被配制為疫苗。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(由肽的游離氨基形成)，其由無機酸例如鹽酸或磷酸，或這樣的有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸和馬來酸形成。與游離羧基形成的鹽也可以來自無機堿，例如，鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧物，和這樣的有機堿如異丙胺、三曱胺、2-乙胺乙醇、組氨酸和普魯卡因。施用一般地，醫(yī)師將決定最適合于個體受試者的實際劑量，它將隨特定患者的年齡、體重和反應變化。以下的劑量是平均情況的示范。當然，也可以有單獨的例子，其中更高的或更低的劑量范圍是有益的。在此公開的藥物和疫苗組合物可以通過直接注射施用。組合物可以配制用于胃腸外、粘膜、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)或經(jīng)表皮施用。一般地，每種蛋白質(zhì)可以以0.01到30mg/kg體重、優(yōu)選的0.1到10mg/kg、最優(yōu)選的0.1到1mg/kg體重的劑量施用。術(shù)語"施用"包括通過病毒或非病毒技術(shù)的遞送。病毒遞送機制包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰滲病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和桿狀病毒載體。非病毒的遞送機制包括脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、lipofectin、陽離子表面的兩親化合物(cationicfacialamphiphile)(CFA)和其組合。這種給藥機制的途徑包括但不限于粘膜的、鼻的、口服、胃腸外的、胃腸的、局部的或舌下的途徑。術(shù)語"施用的"包括但不限于通過粘膜途徑的遞送，例如，作為用于吸入的鼻部噴霧或氣霧劑，或作為可攝取的溶液；胃腸外的途徑，其中遞送通過可注射的形式，例如，靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或皮下的途徑。術(shù)語"共施用"是指每種例如多肽和其他的實體如佐劑的能實現(xiàn)免疫系統(tǒng)的必要的調(diào)節(jié)的施用部位和時間。因此，雖然多肽和佐劑可以乂人時間上在同一時刻并在相同部位施用，在與佐劑不同的時間和不同的部位使用多肽也可能是有益的。多肽和佐劑甚至可以在相同的運載工具中遞送，多肽和抗原可以是偶聯(lián)的和/或不偶聯(lián)的和/或遺傳上偶聯(lián)的和/或不偶聯(lián)的。cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6和/或cgRequiem多肽、多核苷酸、肽、核苦酸、抗體等等和任選的佐劑，可以作為單劑或多劑獨立地施用或共同施用給宿主受試者。在此描述的疫苗組合物和藥物組合物可以通過許多不同的途徑，例如注射(包括胃腸外的、皮下的和肌肉注射)、鼻內(nèi)的、粘膜的、口服的、陰道內(nèi)的、尿道的或眼睛的施用。在此描述的疫苗和藥物組合物可以常規(guī)地胃腸外施用，通過注射，例如皮下或肌內(nèi)注射。適合于其他施用方式的另外的制劑包括栓劑，和在某些情況下，口服制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和運栽體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；這樣的栓劑可以由含有范圍為0.5%到10%、可以是1%到2%的活性成分的混合物形成?？诜苿┛梢园ㄍǔ２捎玫馁x形劑，例如藥物級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠嚢、緩釋制劑或粉末的形式，并含有10%到95%、優(yōu)選25%到70%的活性成分。當疫苗組合物是凍干的時，可以例如，作為懸浮液在施用之前重構(gòu)凍干的材料。重構(gòu)優(yōu)選的在緩沖液中進行。實施例實施例1.細胞系與細胞培養(yǎng)物CHOIFN-y是適應于在懸浮液中生長的中國倉鼠卵巢細胞系。它最初來源于二氫葉酸還原酶陰性(DHFR-)、Dukx細胞(Urlaub&Chasin1980)。CHOIFN-y已用DHFR和人類干擾素-y的基因共轉(zhuǎn)染(ScahillWa/.1983)。CHOIFN-y^皮維持在補充有4mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖和0.25|iM氨曱蝶呤(Sigma,St.Louis,MO)的無葡萄糖/谷氨酰胺的HyQCHOMPS培養(yǎng)基(Hyclone，Logan,UT)中。實施例2.總RNA提取與第一鏈cDNA合成使用Trizol(Invitrogen)從CHOKl細胞提取總RNA。所有逆轉(zhuǎn)錄試劑來自Promega。在含有l(wèi)x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM每種dNTP和25單位的重組RNAsh^核糖核酸酶抑制物的反應混合物中，使用莫洛尼鼠白血病病毒(MoloneyMurineLeukaemiaVirus)逆專爭錄酶以42°C、1小時合成全長cDNA。實施例3.基因特異性PCR從CHOKl總RNA制備的cDNA用作基因特異性PCR的模板。所有PCR試劑來自Promega。實施例4.中國倉鼠FAIM的基因特異性克隆使用5TCR引物5'陽GCCGCGAGAGCTGCTGACTACGTCGTGG-3，和3'PCR引物5'-GTTACTGTG-GTGAGATATGAATGGGTTTGG-3，擴增FAIM的編碼區(qū)。PCR反應混合物含有l(wèi)|iLcDNA模板，lx反應緩沖液，200pM每種dNTP、2.0mMMgCl2、lpM每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行31個94。C1分鐘、58°C1分鐘和72。C2分鐘的循環(huán)，最終在72。C延伸10分鐘。然后將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR-TOPO(Invitrogen,GrandIsland,NY)中用于測序。cgFAIM的序列在SEQIDNO:1和SEQIDNO:5中列出。中國倉鼠序列編碼179個氨基酸的蛋白質(zhì)。也稱為CD95或APO-l的Fas是來自在受體介導的凋亡途徑中起重要作用的肺瘤壞死因子(TNF)受體家族的受體。TNF受體家族的細胞外區(qū)域具有2-6個富含半胱氨酸的亞結(jié)構(gòu)域的重復。Fas活化通過胱天蛋白酶8的寡聚反應啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)。胱天蛋白酶8已經(jīng)顯示是負責效應物胱天蛋白酶的級聯(lián)樣活化的起始胱天蛋白酶之一(Srinivasula"a/.1996)。Fas還顯示促使線粒體細胞色素C釋放，其引起胱天蛋白酶9和其他效應物胱天蛋白酶的活化(Li"a/.1997)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Fas凋亡抑制分子(FasapoptosisinhibitorymoleculeXFAIM)是可以賦予對Fas誘導的凋亡的抗性的可誘導蛋白質(zhì)(Schneideretal.1999;Rothsteinetal.2000)。已經(jīng)顯示FAIM在B細胞中的表達與slg信號一起能夠阻斷Fas殺傷，并且這是通過阻斷Fas信號轉(zhuǎn)導途徑中胱天蛋白酶3活化之前的步驟來完成的(Schneideretal.1999)。已經(jīng)顯示了FAIM存在兩種可選擇的剪接形式，其中FAIM-S廣泛地表達，而FAIM-L是腦組織特異性的(Zhong"a/，2001)。FAIM序列看來在不同物種中也是高度保守的，表明了重要的系統(tǒng)發(fā)育作用。實施例5.中國倉鼠FADD的基因特異性克隆使用5'PCR引物5'-CCATGGACCCATTCCTGGTGC-3，和3'PCR引物5，-TTCTTCCACCAGGTCAGC-CACC-3，擴增FADD的部分編碼區(qū)。PCR反應混合物含有l(wèi))iLcDNA模板，lx反應緩沖液，200pM每種dNTP、1.5mMMgCl2、l)iM每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行31個94°C1分鐘、55°C1分鐘和72。C2分鐘的循環(huán)，最終在72。C延伸10分鐘。然后將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR-TOPO(Invitrogen，GrandIsland,NY)中用于測序。cgFADD的序列在SEQIDNO:2和SEQIDNO:6中列出。FADD是CD95(Fas/APO-1)和腫瘤壞死因子(TNF)受體誘導的凋亡的共同介導者(Chinnaiyane/a/1996)。含有死亡和死亡效應物結(jié)構(gòu)域的FADD是Fas參加后胱天蛋白酶8活化的重要介導者(Chinnaiyan"a/.1995)。我們描述了通過使用人工工程化的FADD分子——僅含有FADD的凋亡受體結(jié)合死亡結(jié)構(gòu)域、而不含死亡效應物結(jié)構(gòu)域的FADDDN，而對cgFADD表達所進行的調(diào)節(jié)。效應物結(jié)構(gòu)域通過募集胱天蛋白酶到誘導死亡的信號轉(zhuǎn)導復合物來引起更下游的凋亡級聯(lián)的活化。在此描述的方法允許過量表達工程化形式的FADD——即顯性失活，以及這種工程化的分子通過與天然FADD竟爭、并因而中斷凋亡級聯(lián)在防止胱天蛋白酶募集中的用途。實施例6.中國倉鼠PDCD6的基因特異性克隆使用5'PCR引物5，-GCCCATGGCTGCCTACTCCTA-3，和3，PCR引物5，-AATCCAGCCATCCTGAT-CCGT-3，擴增PDCD6的部分編碼區(qū)。PCR反應混合物含有l(wèi)pLcDNA模板，lx反應緩沖液，200^iM每種dNTP、1.5mMMgCl2、1pM每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行31個94°C1分鐘、52°C1分鐘和72。C2分鐘的循環(huán)，最終在72。C延伸IO分鐘。然后將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR-TOPO(Invitrogen,GrandIsland,NY)中用于測序。純化獲得的PCR產(chǎn)物并克隆到pCR2.1-Topo載體中并測序。3，-RACE引物是5，-CAGCGGGTTGATAAAGACAGGAGTGGAGTG-3，。通過在含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中電泳來分離3'-RACEPCR產(chǎn)物，切除相關的條帶并使用Qiagen試劑盒提取凝膠，之后克隆到pCR-TOPO(Invitrogen,GrandIsland,NY)中用于測序。cgPDCD6的序列在SEQIDNO:3和SEQIDNO:7中列出。中國倉鼠序列編碼191個氨基酸的蛋白質(zhì)。PDCD6也稱為凋亡連鎖基因2(apoptosis-linkedgene2)(ALG-2)，其編碼屬于panta-EF-hand蛋白質(zhì)家族的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)。有跡象表明它參與受體、Fas和糖皮質(zhì)激素誘導的凋亡(Vitoo/.1996;Krebs&Klemenz,2000andJungWa/.,2001)。有趣的是，Jangetal.2002證明了ALG-2缺乏不引起TCR、FAS或地塞米松信號轉(zhuǎn)導誘導的凋亡的阻斷。實施例7.中國倉鼠Requiem的基因特異性克隆使用5TCR引物5'陽ATG誦GCGGCTGTGGTGGAGAAT-3，和3'PCR引物5，-GGAGTTCTGGTTCTGGTAG-ATGG-3，擴增Requiem的部分編碼區(qū)。PCR反應混合物含有1(iLcDNA模板，1x反應緩沖液，200pM每種dNTP、2.0mMMgCl2、1每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行60個94°C1分鐘、44°C1分鐘和72。C2分鐘的循環(huán)，最終在72。C延伸IO分鐘。然后將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR⑧-TOPO⑧(Invitrogen,GrandIsland,NY)中用于測序。純化獲得的PCR產(chǎn)物并克隆到pCR2.1-T叩o載體中并測序。3，-RACE引物是5，-GCCTCAGTTACCACTATGCCCATTCCCACC-3，。通過在含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中電泳來分離3'-RACEPCR產(chǎn)物，切除相關的條帶并使用Qiagen試劑盒提取凝膠，之后克隆到pCR-TOPO(Invitrogen,GrandIsland,NY)中用于測序。房含Jtie(^emfcg^e《w/e附jcgRequiem的序列在SEQIDNO:4和SEQIDNO:8中列出。中國倉鼠序列編碼391個氨基酸的蛋白質(zhì)。Requiem也稱為ubi-d4,是髓樣細胞中胱天蛋白酶的活化所必需的鋅指基因(Gabig"a/.1994)。已提示Requiem很可能編碼存活因子(survivalfactor)撤退后凋亡應答所需的轉(zhuǎn)錄因子(Gabigetal.1994)。此外，Gabigetal.(1998)后來在鼠髓樣細胞和人類K562白血病細胞的細胞質(zhì)和核亞細胞部分中檢測到了該蛋白質(zhì)，從而表明該蛋白質(zhì)可能具有不同于轉(zhuǎn)錄因子的功能。實施例8.中國倉鼠FAIM表達載體構(gòu)建概括地說，被克隆到pCR-TOPO(Invitrogen,GrandIsland,NY)中(+)(Invitrogen)中并再次測序。然后4吏用MaxiPlasmidPurificationKit(Qiagen，Hilden,Germany)純化最終的質(zhì)粒pcDNA3,1(+)FAIM,對其濃度進行定量，用于向CHOIFN-y中轉(zhuǎn)染。詳細地，通過使用5，-PCR引物5，陽GAATTCGCC4CCATGACAGATCTTGTAGC-3，和3，-PCR引物5，-GAATTCGTGAACACATTTAATTACCA-3，來創(chuàng)建具有人工kozak序列和接頭區(qū)域的cgFAIM。下劃線的序列由EcoRI限制性位點組成，而斜體的序列由人工kozak組成，以便于FAIM的"讀碼框內(nèi)，，表達。cgFAIM的摻入?yún)^(qū)域是粗體的。PCR反應混合物含有1pCR2.1-TOPOcgFAIM模板，1x反應緩沖液，200|iM每種dNTP、2.0mMMgCl2、l(iM每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行60個94°C1分鐘、44°C1分鐘和72°C2分鐘的循環(huán)，最終在72。C延伸10分鐘。然后在37。C用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化"i正實的PCR產(chǎn)物大約4小時來產(chǎn)生具有用于進一步連接的粘性末端的cgFAIM插入物?？瞻譸cDNA3.1(+)載體(Invitrogen)則在37。C用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化大約4小時。然后通過添加12的插入物到3載體、2|jL無Dnase的水、210xT4DNA連接酶緩沖液(Invitrogen)和1T4DNA連接酶(3U/|liLXInvitrogen)中，將EcoRI消化的cgFAIM插入物連接到EcoRI消化的pcDNA3.1(+)中。然后在室溫下孵育此連接混合物大約16小時。然后將10連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a細菌細胞中用于質(zhì)粒增殖。通過在具有用于選擇的氨千青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，選擇陽性轉(zhuǎn)化體。然后對各個DH5a克隆進行質(zhì)粒提取，用于測序來證實插入到pcDNA3.1(+)表達載體中的cgFAIM序列。然后使用MaxiPlasmidPurificationKit(Qiagen，Hilden，Germany)純化來自證實的克隆的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)cgFAIM,測定它的濃度用于向CHOIFN-y中轉(zhuǎn)染。實施例9.中國倉鼠FADD顯性陰性表達載體構(gòu)建通過使用5，-PCR引物5'-GATATCGGATCCGCC4CC"rGGCCTTTGACATTGTATGCGACAATGTGGGG-3，和3，-PCR引物5-CCCGGG-CTCGAGTGCCTCCC-TTCCACCAGGTCAG-3，來創(chuàng)建具有kozak序列的FADD顯性陰性(FADDdominantnegative)(FADDDN)片段。下劃線的序列分別由BamHI和Xhol限制性位點組成，而斜體序列由人工kozak和起始密碼子組成，以便于cgFADD顯性陰性的"讀碼框內(nèi)，，表達。摻入的cgFADD的編碼區(qū)域是粗體的。PCR反應混合物含有1cDNA模板，1x反應緩沖液，200pM每種dNTP、1.5mMMgCl2、l(aM每種引物和TaqDNA聚合酶混合物(總共5U)。亞克隆到pCI^-TOPO㊣中的部分FADD序列被用作模板。PCR條件是94°C5分鐘，隨后進行31個94°C1分鐘、50°C1分鐘和72°C2分鐘的循環(huán)，最終在72'C延伸10分鐘。然后在37。C用BamHI和Xhol限制性內(nèi)切酶.消化證實的PCR產(chǎn)物大約4小時來產(chǎn)生具有用于進一步連接的粘性末端的cgFADDDN插入物?？瞻譸cDNA3.1(+)載體(Invitrogen)則在37。C用BamHI和Xhol限制性內(nèi)切酶消化大約4小時。然后通過添加12pL的插入物到3fiL載體、2pL無Dnase的水、2|iL10xT4DNA連接酶緩沖液(Invitrogen)和1pLT4DNA連接酶(3U/|iL)(Invitrogen)中，將BamHI/XhoI消化的cgFADDDN插入物連接到BamHI/XhoI消化的pcDNA3.1(+)中。然后在室溫下孵育此連接混合物大約16小時。然后將10連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a細菌細胞中用于質(zhì)粒增殖。通過在具有用于選擇的氨千青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，選擇陽性轉(zhuǎn)化體。然后對各個DH5a克隆進行質(zhì)粒提取，用于測序來證實插入到pcDNA3.1(+)表達載體中的cgFADDDN序列。然后使用MaxiPlasmidPurificationKit(Qiagen，Hilden,Germany)純化來自證實的克隆的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)FADD顯性陰性，測定它的濃度用于向CHOIFN-y中轉(zhuǎn)染。實施例10.中國倉鼠PDCD6抑制載體構(gòu)建根據(jù)獲得的cgPDCD6序列設計寡聚插入物。使用BLAST將寡聚插入物設計與基因組數(shù)據(jù)庫比較來消除與其他基因的任何顯著的同源性。5，寡聚插入物5'-GATCCCGTGAGCTTCAGCAAGCATTATTCAAGAGATAATGCTTGCTGAAGC-TCATTTTTTGGAAA-3'與合成的3，寡聚插入物TGCTTGCTGAAGCTCACG-3'退火，然后連接到Hindlll/Bglll消化的pSUPER.neo載體(OligoEngine，Seattle,WA)中。將4|iL退火的寡聚插入物添加到3(iLHindlll/Bglll消化的pSUPER.neo、13無Dnase的水、2juL10xT4DNA連接酶緩沖液(Invitrogen)和1jiLT4DNA連接酶(3U/(aL)(Invitrogen)中。然后在室溫下孵育此連接混合物大約16小時。然后將10pL連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a細菌細胞中用于質(zhì)粒增殖。通過在具有用于選擇的氨千青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，選擇陽性轉(zhuǎn)化體。然后對各個DH5a克隆進行質(zhì)粒提取，用于測序來證實插入到pSUPER.neo表達載體中的cgPDCD6siRNA序列。然后使用MaxiPlasmidPurificationKit(Qiagen,Hilden，Germany)純化來自證實的克隆的質(zhì)粒pSUPER.neocgPDCD6siRNA，測定它的濃度用于向CHOIFN^中轉(zhuǎn)染。實施例11.中國倉鼠Requiem抑制載體構(gòu)建根據(jù)獲得的cgRequiem序列設計寡聚插入物。5'寡聚插入物5ATCCGC-TTTTTTGGAAA-3'與3，寡聚插入物AGGTTCAAGGATCCGCGG-3'退火，然后連接到HindIII和BglII消化的pSUPER.neo載體(OligoEngine,Seattle,WA)中。將4(iL退火的寡聚插入物添加到3jiLHindlll/Bglll消化的pSUPER.neo、13|iL無Dnase的水、210xT4DNA連接酶緩沖液(Invitrogen)和1T4DNA連接酶(3U/pL)(Invitrogen)中。然后在室溫下孵育此連接混合物大約16小時。然后將10連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5cc細菌細胞中用于質(zhì)粒增殖。通過在具有用于選擇的氨千青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，選擇陽性轉(zhuǎn)化體。然后對各個DH5a克隆進行質(zhì)粒提取，用于測序來證實插入到pSUPER.neo表達載體中的cgRequiemsiRNA序列。然后使用MaxiPlasmidPurificationKit(Qiagen，Hilden，Germany)純化來自證實的克隆的質(zhì)粒pSUPER.neocgRequiemsiRNA，測定它的濃度用于向CHOIFN-y中轉(zhuǎn)染。實施例12.轉(zhuǎn)染與選擇寸吏用Lipofectamine試劑(Invitrogen)進4亍轉(zhuǎn)染。以每孔50萬個細月包在6孔平板中使細胞生長過夜，次日每孔用大約1(ig線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。才艮據(jù)廠家的說明書以Lipofectamine(|iL)與DNA(嗎)的比例為3:1制備Lipofectamine-DNA復合物。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞，使細胞生長24小時，之后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為含有1000嗎/mL遺傳霉素的選擇培養(yǎng)基。將細胞維持在選擇培養(yǎng)基中4周，其中未轉(zhuǎn)染的細胞在選擇培養(yǎng)基中于一周內(nèi)死亡。實施例12A.穩(wěn)定整合的單細胞克隆通過將細胞連續(xù)稀釋到96孔平板中使得在每個孔中僅有一個細胞，獲得穩(wěn)定整合的單細胞克隆。在光學顯微鏡下檢查加樣孔，標出僅含單個細胞的那些孔。然后將單個克隆擴展入24孔板中，隨后是6孔板，之后進入搖瓶培養(yǎng)。實施例12B.分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)在5.0L生物反應器(B.Braim，Melsungen,Germany)中以2.5x105細胞/mL的接種密度來接種4.0L初始工作體積的培養(yǎng)基。使用補充有20mM葡萄糖和4mM谷氨酰胺的無葡萄糖/谷氨酰胺的HyQCHOMPS培養(yǎng)基(Hyclone,Logan，UT)進行分批培養(yǎng)，而補料分批培養(yǎng)補充有4mM葡萄糖和0.5mM谷氨酰胺。溶解的氧氣濃度維持在50%空氣飽和度，通過間歇性將C02添加到氣體混合物中和/或使用7.5%(w/v)NaHC03溶液(Sigma),將培養(yǎng)物pH維持在7.15。使用改良的在線動態(tài)補料策略進行補料分批操作(Leee/a/.，2003)。每1.5小時使用自動化的無菌在線進樣環(huán)管進行相關的受控營養(yǎng)物水平的濃度在線監(jiān)視。用于補料分批培養(yǎng)的基礎進料培養(yǎng)基(basalfeedmedia)用定制的含lx鹽(Hyclone)的10x無鈣、無葡萄糖和無谷氨酰胺的DMEM/F12制備，補充有10g/L大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、Hysoy(QuestInternational,HoffmanEstate,IL)、10mL/L化學限定的脂質(zhì)(chemicallydefinedlipids)(GibcoBRL,GrandIsland,NY)、lmg/Ld-生物素(Sigma)、2mML-天冬氨酸、2mML-天冬酰胺、4mML-半胱氨酸、ImML-谷氨酸、lmML-曱硫氨酸和5mML-絲氨酸(Sigma)?；A進料培養(yǎng)基進一步補充有100mM谷氨酰胺(Sigma)和500mM葡萄糖(Sigma)。每1.5小時，進行殘余谷氨酰胺濃度的自動化在線測量。如果殘余谷氨酰胺濃度低于設定點控制濃度，用進料培養(yǎng)基進行進料注射，來提高培養(yǎng)物谷氨酰胺濃度到0.3mM。實施例13.使用實時PCR的基因表達定量從穩(wěn)定的細胞收集大約IOOO萬個細胞，使用TrizolTM試劑(Invitrogen)提取總RNA。然后使用GeneQuantProRNA/DNACalculator(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)定量RNA樣品。4吏用260nm比280nm的吸光度比值來評定RNA質(zhì)量，比例1.8和以上被認為是足夠純的RNA樣品。使用定量實時PCR來確定轉(zhuǎn)染實驗之后的目標基因相對過量表達或抑制。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物拷貝的標準曲線，連續(xù)稀釋含有FAIM、FADD、PDCD6或Requiem的定量的pCR-TOPO(Invitrogen)質(zhì)粒，并用于定量實時PCR。使用5，引物5，-TGGAGCTGCGAAAACCAAAG-3，和3，引物5'-AAACTCGCCTGCTGTCTCCAT-3，進行FAIM轉(zhuǎn)錄物的定量實時PCR。使用5，引物5'-GATATCGGATCCGCCACCATGG-3，和3，引物5'-TGCCTCCCTTCCACCAG-GTCAG-3，進行FADD顯性陰性轉(zhuǎn)錄物的定量實時PCR。使用5'引物5'-CAGCGGGTTGATAAAGACAGG-3，和3'引物5，-GCCAGCCTTG-TTTTCTCGG-3，進行PDCD6轉(zhuǎn)錄物的定量實時PCR。使用5，引物5'-TGGAGTAGCCCAGAGCAATTG-3，和3，引物5'-TCGACGCTTTTTACGCCAG-3，進行Requiem轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的定量實時PCR。然后針對(3-肌動蛋白轉(zhuǎn)錄物的表達將每個樣品標準化。使用5，引物5，-AGCTGAGAGGGAAATTGTGCG-3'和3'引物5'-GCAACGG-AACCGCTCATT-3，進行|3-肌動蛋白轉(zhuǎn)錄物的定量實時PCR。最后，轉(zhuǎn)染的細胞中標準化的定量基因表達除以空載體轉(zhuǎn)染的細胞中標準化的定量基因表達來得出標準化的相對基因表達。實施例14.凋亡分析使用溴化乙錠/吖啶橙分析將收集的樣品中的細胞分類為凋亡的或非凋亡的群體。在PBS溶液(Sigma)中制備100[ig/mL的溴化乙錠(Sigma)和吖啶橙(Sigma)的貯存液。從樣品中取樣約&106個細胞，在100(iL的1:1溴化乙錠:吖咬橙貯存液中重懸浮，在室溫下孵育5分鐘。然后將樣品加載到玻璃載玻片上，在熒光顯微鏡下檢查大約400個細胞。然后具有核凝縮的凋亡形態(tài)學的細胞被相應地分類。除了形態(tài)學分析之外，才艮據(jù)廠家的方案使用BDApoAlertCaspaseAssayPlates(BDBiosciencesClontech，CA)測量胱天蛋白酶2、3、8和9的活性。胱天蛋白酶的活化被認為是凋亡的生物化學標志。實施例15.IFN-y定量-使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析(HyCultBiotechnology,Uden，Netherlands)來分析連續(xù)稀釋的上清液樣品的IFN-y濃度。在高生存力(>95%)期間和在低生存力(70-80%)期間具有最高IFN-Y濃度的樣品被送去進行免疫親和純化和進一步的N-糖基化表征。實施例16.實時PCR用于基因表達檢測為了確定目標基因在細胞中的表達，進行定量實時PCR。實時PCR被認為是檢測轉(zhuǎn)錄物水平的敏感方法?；虮磉_分析顯示用pcDNA3.1(+)Faim轉(zhuǎn)染的細胞過量表達FAIM比用pcDNA3.1(+)空白轉(zhuǎn)染細胞多三倍(附圖1)。用pcDNA3.1(+)FADD顯性陰性轉(zhuǎn)染的細胞過量表達FADD顯性陰性高達4倍(附圖1)。附圖1中數(shù)據(jù)還顯示可以有效地使用siRNA抑制基因表達。用pSUPERPDCD6siRNA轉(zhuǎn)染引起PDCD6表達被抑制大約60%,而pSUPERR叫uiemsiRNA能夠抑制Requiem表達高達70%(附圖1)。實施例17.扭向中國倉鼠FAIM基因賦予的凋亡抗性用FAIM表達載體(實施例8)和作為對照的空白載體來轉(zhuǎn)染細胞，分析對凋亡的抗性。與僅用空白載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，過量表達FAIM的細胞能夠?qū)⒏叽婊罴毎芏染S持更長時間(附圖2A)。FAIM過量表達的細胞還顯示了生存力在開始降至低于95%之前，被顯著延長至少24小時(附圖2B)。凋亡細胞的百分比也顯著^f氐于沒有FAIM過量表達的對照細胞(附圖2D)。與對照細胞相比，胱天蛋白酶2和3活性的提高也延遲了大約24小時(附圖6B)。這顯示了FAIM過量表達可以在抑制細胞培養(yǎng)過程中的凋亡中非常有效。實施例18.靶向中國倉鼠FADD基因賦予的凋亡抗性用FADD表達載體(實施例9)和作為對照的空白載體來轉(zhuǎn)染細胞，并分析對凋亡的抗性。與僅用空白載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，過量表達FADD顯性陰性的細胞能夠?qū)⒏叽婊罴毎芏染S持更長時間(附圖3A)。FADD顯性陰性過量表達的細胞還顯示在生存力開始降至低于95%之前生存力顯著延長約24小時(附圖3B)。凋亡細胞的百分比也顯著低于沒有FADD過量表達的對照細胞(附圖3D)。胱天蛋白酶2、3和8的活性的提高也顯著地延遲(附圖6C)。數(shù)據(jù)顯示培養(yǎng)物中的胱天蛋白酶2和8活性僅在144小時后提高，而胱天蛋白酶3活性的提高被顯著地抑制。這顯示了輩巴向FADD信號轉(zhuǎn)導有效抑制細胞培養(yǎng)過程中的凋亡。實施例19.革巴向中國倉鼠PDCD6基因賦予的凋亡抗性用PDCD6表達載體(實施例IO)和作為對照的空白載體來轉(zhuǎn)染細胞，并分析對凋亡的抗性。與僅用空白siRNA載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，具有PDCD6抑制的細胞能夠?qū)⒏叽婊罴毎芏染S持更長時間(附圖4A)。具有PDCD6抑制的細胞還顯示生存力喪失率顯著下降(附圖4B)。凋亡細胞的百分比也顯著低于沒有PDCD6抑制的對照細胞(附圖4D)。胱天蛋白酶2、3、8和9活性的提高也顯著地延遲(附圖6D)。數(shù)據(jù)顯示培養(yǎng)物中胱天蛋白酶2、3和8活性僅在144小時后提高，而胱天蛋白酶9活性總是低于參考點。這顯示靶向PDCD6信號轉(zhuǎn)導可以有效抑制細胞培養(yǎng)過程中的凋亡。實施例20.靶向中國倉鼠Requiem基因賦予的凋亡抗性用Requiem表達載體(實施例11)和作為對照的空白載體來轉(zhuǎn)染細胞，并分析對凋亡的抗性。與僅用空白siRNA載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，具有Requiem抑制的細胞能夠?qū)⒏叩拇婊罴毎芏染S持更長時間(附圖5A)。具有Requiem抑制的細胞還顯示了生存力喪失率顯著下降(附圖5B)。凋亡細胞的百分比也顯著低于沒有Requiem抑制的對照細胞(附圖5D)。胱天蛋白酶2、3和9的活性的提高也顯著地延遲(附圖6E)。數(shù)據(jù)顯示了胱天蛋白酶活性顯著地低于對照的活性。這顯示靶向Requiem信號轉(zhuǎn)導可以有效抑制細胞培養(yǎng)過程中的凋亡。實施例21.重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的改善附圖7顯示了基因耙向就最終產(chǎn)物產(chǎn)量而言改善了細胞培養(yǎng)過程。與對照細胞中所見的典型的2.3mg/L產(chǎn)量相比，F(xiàn)AIM過量表達的細胞使得干擾素Y產(chǎn)量高達3.3mg/L(附圖7A)。靶向FADD信號轉(zhuǎn)導甚至使得干擾素Y產(chǎn)量達5.0mg/L，呈現(xiàn)出超過200%的提高(附圖7B)。PDCD6和Requiem的抑制分別使得干擾素y產(chǎn)量改善到4.2和5.8mg/L。工程化的細胞對凋亡誘導的耐性(robustness)提高，伴隨最終重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的有效提高，表明FADD、FAIM、PDCD6和Requiem的基因靶向是用于改善細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生物治療劑產(chǎn)量的有效的新策略。實施例22.在補料分批培養(yǎng)中除生存力增強之外存活培養(yǎng)物密度的提高進行實驗來確定在不同的分批和補料分批應激/營養(yǎng)物環(huán)境下工程化的凋亡抗性細胞系進行補料分批培養(yǎng)的能力。附圖8A顯示了具有Requiem或PDCD6抑制的穩(wěn)定整合的CHOIFN-y細胞系的存活細胞密度。PDCD6和Requiem抑制使得在補料分批培養(yǎng)期間活細胞密度的顯著提高。與在沒有任何凋亡靶向的細胞中一般所見到的5x106個細胞/mL相比，可以達到高達9x106個細胞/mL的存活細胞密度。用顯示FADDDN或FAIM過量表達的穩(wěn)定整合的CHOIFN-y細胞系重復實驗，觀察到相似的結(jié)果。這證明了，通過Requiem或PDCD6抑制或者FAIM和FADDDN過量表達所進行的凋亡抗性工程化不僅使得培養(yǎng)物生存力延長，而且由于它們針對抑制細胞生長的一種或多種因子的耐性，賦予了生長至高得多的存活細胞密度的能力。實施例23.在補料分批培養(yǎng)中提高的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量附圖9A顯示了基因靶向使得干擾素y生產(chǎn)和產(chǎn)量進一步顯著改善。與在標準補料分批培養(yǎng)中所見的一般20昭/mL相比，具有穩(wěn)定抑制的R叫uiem或PDCD6的細胞分別得到高達49和41jig/mL的干擾素y產(chǎn)量。這代表重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的改善大于200%。用過量表達FAIM的細胞重復該實驗，看到了相似的結(jié)果。實施例24.在修飾的CHO細胞系中重組人類IFN-y的唾液酸化作用提高-唾液酸含量分析如上所述從親本CHO細胞系產(chǎn)生表達IFN-y的修飾的CHO細胞系。從指數(shù)生長中期收集的樣品中和在當高生存力(>95%)期間和在低生存力(70-80%)期間檢測到最高IFN-y濃度時收集的樣品中純化重組IFN-y。然后使用如Wong"a/.(2005a),腸/ec/z"。/5/固g89:164-177中描迷的改良的石克代巴比妥酸分析來測定IFN-y的唾液酸含量。實施例25.在修飾的CHO細胞系中重組人類IFN-y的增強的唾液酸化作用一_結(jié)果附圖10顯示了對修飾的CHOIFN-y細胞系和親本CHOIFN-丫細胞系而言，在補料分批培養(yǎng)期間三個時間點，即指數(shù)中期(>95%生存力)、穩(wěn)定期(>95%生存力)和死亡期(70-80%生存力)，收獲的重組人類IFN-y的唾液酸化作用。對于后者，隨著培養(yǎng)物從指數(shù)中期(2.9molSA/molIFN-y)進展到穩(wěn)定期(2.3molSA/molIFN-y)再到死亡期(2.1molSA/molIFN-y),重組人類IFN-y的唾液酸含量降低。相比之下，對于四個修飾的CHOIFN-y細胞系而言，在三個時間點收獲的IFN-y的唾液酸含量被維持，甚至顯示了唾液酸化作用的提高，范圍為2.7-3.5molSA/molIFNj。這些結(jié)果顯示了凋亡抗性CHO細胞的另一種潛在益處是在延長的培養(yǎng)時間中維持/增強蛋白質(zhì)糖基化質(zhì)量，盡管存在培養(yǎng)物生存力損失(70-80%)。對于用來制造生物治療劑的細胞系來說這是明顯的益處，因為較低的唾液酸化作用程度可以降低基于蛋白質(zhì)的藥物的體內(nèi)半衰期(Varki，1993,腸&c/wo/萬/固g43:423-428;Gramerda/"1995，G/戶6油gy3:97-130)。參考文獻AltschulSF,ThomasLM,AlejandroAS,JinghuiZ,ZhengZ，WebbM,andDavidJL(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.vVwc/e/c^c油25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件中引用或提及的任何產(chǎn)品的廠家說明書或目錄，通過引用合并在此。此外，在這個文本中引個文本中引用或提及的任何產(chǎn)品的任何廠家說明書或目錄，在此通過引用合并在此。本發(fā)明的描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變體對于本領域的技術(shù)人員是顯而易見的，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式描述了本發(fā)明，應當理解的是要求權(quán)利的發(fā)明不應過度局限于這種特定的實施方式。實際上，對于分子生物學或相關領域的技術(shù)人員明顯的、用于進行本發(fā)明的描述的模式的各種修改，預計在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的多肽，其包含選自以下的序列，并能夠介導細胞凋亡(a)與SEQIDNO1所示的序列具有至少97％序列同一性的cgFAIM序列；(b)與SEQIDNO2所示的序列具有至少69％序列同一性的cgFADD序列；(c)與SEQIDNO3所示的序列具有至少89％序列同一性的cgPDCD6序列；(d)與SEQIDNO4所示的序列具有至少90％序列同一性的cgRequiem序列；(e)是上述(a)到(d)中任一個的至少15個連續(xù)殘基的片段的序列。2.—種分離的多肽，包含能介導細胞的凋亡的中國倉鼠序列，所述序列選自SEQIDNO:1所示的cgFAIM序列；SEQIDNO:2所示的cgFADD序列；SEQIDNO:3所示的cgPDCD6序列；和SEQIDNO:4所示的cgRequiem序歹寸。3.—種分離的多核苷酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽的序列，其中所述序列優(yōu)選選自下組SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。4.一種分離的多核苷酸，其包含選自以下的序列，或包含與選自以下的序列互補的序列，所述互補序列能夠在嚴謹條件下與選自以下的序列雜交，或者包含作為遺傳密碼的結(jié)果是選自以下的序列的簡并物的序列(a)與SEQIDNO:5所示的序列具有卯％或更高序列同一性的cgFAIM序列；(b)與SEQIDNO:6所示的序列具有90%或更高序列同一性的cgFADD序列；(c)與SEQIDNO:7所示的序列具有93%或更高序列同一性的cgPDCD6序列；(d)與SEQIDNO:8所示的序列具有89%或更高序列同一性的cgRequiem序歹寸；(e)是上述(a)到(d)中任一個的至少15個連續(xù)殘基的片段的序列。5.—種表達序列，包含與調(diào)控序列可操作連接的根據(jù)權(quán)利要求3或4的多核苷酸或其部分，所述調(diào)控序列能夠指導所述多核苷酸的表達。6.根據(jù)權(quán)利要求5的表達序列，其是表達載體。7.—種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求3或4的多核苷酸，當暴露于細胞時所述載體能夠調(diào)節(jié)所述細胞的cgFAIM、cgFADD、cgPDCD6或cgR叫uiem的表達。8.根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其包含中國倉鼠FAIM序列或其部分，所述載體能夠引起細胞中cgFAIM的增量調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是pcDNA3.1(+)FAIM(SEQIDNO:37)。9.根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其包含中國倉鼠FADD序列或其部分，所述載體能夠引起細胞中cgFADD的減量調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是pcDNA3.1(+)FADDDN(SEQIDNO:38)。10.根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其包含中國倉鼠PDCD6序列或其部分，所述載體能夠引起細胞中cgPDCD6的減量調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是pSUPER扁.PDCD6siRNA(SEQIDNO:39)。11.根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其包含中國倉鼠R叫uiem序列或其部分，并且能夠引起細胞中cgRequiem的減量調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是pSUPER.neo.RequiemsiRNA(SEQIDNO:40)。12.—種細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求5或6的表達序列或根據(jù)權(quán)利要求7到11中任一項的載體，其中優(yōu)選將所述表達序列轉(zhuǎn)化到所述細胞中。13.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽、根據(jù)權(quán)利要求3或4的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求5或6的表達序列、根據(jù)權(quán)利要求7到11中任一項的載體或根據(jù)權(quán)利要求12的細胞，連同藥學上可接受的運載體或稀釋劑。14.一種生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)提供包含根據(jù)權(quán)利要求3或4的多核苷酸序列和調(diào)控序列的表達序列，其中所述調(diào)控序列能夠指導從所述多核苷酸序列表達所述多肽，(b)使所述多肽在所述調(diào)控序列的控制下從所述表達序列表達，和(c)任選地純化所述多肽。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述表達序列包含轉(zhuǎn)染到細胞中的表達載體以能夠通過所述細胞表達所述多肽，所述細胞優(yōu)選的是中國倉鼠細胞。16.—種方法，包括在細胞中調(diào)節(jié)，優(yōu)選增量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:1所示序列的cgFAIM多肽或具有SEQIDNO:5所示序列的cgFAIM多核芬酸的表達，所述細胞優(yōu)選中國倉鼠細胞。17.—種方法，包括在細胞中調(diào)節(jié)，優(yōu)選減量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:2所示序列的cgFADD多肽、具有SEQIDNO:3所示序列的cgPDCD6多肽或具有SEQIDNO:4所示序列的cgRequiem多肽，或者具有SEQIDNO:6所示序列的cgFAIM多核香酸、具有SEQIDNO:7所示序列的cgPDCD6多核苷酸或具有SEQIDNO:8所示序列的cgRequiem多核苷酸的表達，所述細胞優(yōu)選的是中國倉鼠細胞。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求7到11的任一項的載體暴露于細胞，優(yōu)選用所述載體轉(zhuǎn)染所述細胞。19.一種細胞，優(yōu)選中國倉鼠細胞，其已經(jīng)被修飾，優(yōu)選被遺傳工程化以與未被如此修飾的細胞相比增量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:1所示序列的多肽或者具有SEQIDNO:5所示序列的多核苷酸的表達。20.—種細胞，優(yōu)選中國倉鼠細胞，其已經(jīng)被修飾，優(yōu)選被遺傳工禾呈化，以與未被如此4務飾的細胞相比減量調(diào)節(jié)具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列的多肽或者具有SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示序列的多核苷酸的表達。21.—種細胞系，包含根據(jù)權(quán)利要求19或20的細胞，或其后代，優(yōu)選為中國倉鼠細胞系。22.—種細胞培養(yǎng)物，包含根據(jù)權(quán)利要求19或20的細胞，或其后代，或根據(jù)權(quán)利要求21的細胞系。23.—種轉(zhuǎn)基因的非人動物，包含根據(jù)權(quán)利要求19或20的細胞，或其后代，優(yōu)選為中國倉鼠。24.根據(jù)權(quán)利要求15到18的任一項的方法，根據(jù)權(quán)利要求12、19或20的細胞，根據(jù)權(quán)利要求21的細胞系，根據(jù)權(quán)利要求22的細胞培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中，與不如此調(diào)節(jié)所述多肽表達的細力包相比(i)細胞的細胞生存力提高或增強，優(yōu)選其中細胞凋亡減少；(ii)細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，優(yōu)選重組表達的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高或增強；和/或(iii)細胞對表達的蛋白質(zhì)的糖基化作用、優(yōu)選唾液酸化作用提高或增強。25.根據(jù)權(quán)利要求15到18的任一項的方法，根據(jù)權(quán)利要求19或20的細胞，根據(jù)權(quán)利要求21的細胞系，根據(jù)權(quán)利要求22的細胞培養(yǎng)物或才艮據(jù)權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因非人動物用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選異源蛋白質(zhì)，更優(yōu)選來自外源引入的序列，最優(yōu)選重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選干擾素-Y。26.生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選干擾素-Y的方法，所述方法包括提供根據(jù)權(quán)利要求19或20的細胞，用能表達所述重組蛋白質(zhì)的表達載體轉(zhuǎn)染所述細胞，并4吏所述重組蛋白質(zhì)在所述細胞中表達。27.包含具有SEQIDNO:9的cgFADD顯性陰性序列的多肽、或能夠編碼這種多肽的多核香酸，優(yōu)選SEQIDNO:10，或其片段、同源物、變體或衍生物。28.可通過權(quán)利要求25或26的方法生產(chǎn)的多肽，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)，更優(yōu)選干擾素-Y，其中與可由未經(jīng)如此修飾的細胞產(chǎn)生的多肽相比，所述多肽具有提高的唾液酸化作用。29.根據(jù)權(quán)利要求28的多肽，其中所述唾液酸化作用大于2.9mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽，優(yōu)選約3.5mol唾液酸/mol產(chǎn)生的多肽。全文摘要本發(fā)明提供能夠介導細胞凋亡的分離的中國倉鼠基因和多肽。所披露的多肽為FAIM、FADD、PDCD6和Requiem。還披露了調(diào)節(jié)所述多肽表達以增強細胞生存力、重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量和蛋白質(zhì)糖基化的方法。文檔編號C07K14/435GK101133156SQ200580048811公開日2008年2月27日申請日期2005年12月28日優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日發(fā)明者米蘭達·G·S·亞普,黃智宏申請人:科學、技術(shù)與研究機構(gòu)