專利名稱：抗人Reg4的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用以及雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人再生基因4 (Regenrating gene 4，簡稱Reg4 )的 單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞抹。(二) 背景技術(shù)結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性肺瘤之一。早期診斷、早期治療 已被公認(rèn)為改善結(jié)直腸癌療效和預(yù)后的關(guān)鍵，其意義遠(yuǎn)大于任何一種治療 方案。絕大部分結(jié)直腸腺癌是由腺瘤癌變而來，如能及時發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤， 很可能會將發(fā)病率不斷攀升的結(jié)直腸癌防范于未然，或使其治愈率得到根 本的改觀。但目前常用的結(jié)直腸腫瘤標(biāo)志物，如CEA、 TP53、 K-RAS、 CD95等，均存在特異性和靈敏度不能兼顧的問題，尤其在結(jié)直腸腺瘤和 早期癌癥患者中更是如此。為了尋找更理想，與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān) 的新的腫瘤標(biāo)志物，為協(xié)助結(jié)直腸癌的臨床診斷，監(jiān)視病情發(fā)展及判斷預(yù) 后提供新的手段，同時加深對結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制的認(rèn)識，本實驗室 自1999年起利用抑制性差減雜交的方法來篩選結(jié)直腸肺瘤發(fā)生的相關(guān)基 因，并利用同一病人的正常粘膜，腺瘤和腺癌建立了三個差減文庫，即腺 瘤相對于正常粘膜的差異片斷文庫(A-N)，腺癌相對于正常粘膜的差異 片斷文庫(T-N)和腺癌相對于腺瘤的差異片斷文庫(T-A)。其中在A-N 文庫中篩選出一個未知基因，通過表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)組裝，BLAST 搜索，發(fā)現(xiàn)該基因即2001年從炎癥性腸病文庫中發(fā)現(xiàn)的Reg4基因。在 此基礎(chǔ)上做了很多工作，積累了不少資料。其中RT-PCR, Northern blot 和原位雜交的結(jié)果均顯示Reg4在結(jié)直腸腺瘤和腺癌中的表達(dá)較配對的正常粘膜高，且在腺瘤癌變時表達(dá)最高，提示Reg4可能是腺瘤癌變的預(yù)警 指標(biāo)，是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期分子標(biāo)志。Reg家族屬于鈣依賴的植物血凝素超家族，它代表一組分泌蛋白，主 要作為急性期反應(yīng)蛋白、促進(jìn)生長、抗凋亡因子參與到損傷，炎癥，糖尿 病以及腫瘤發(fā)生過程中。Reg4是該家族的新成員，人們對其了解不很詳 盡。由于Reg4在Crohn病和潰瘍性結(jié)腸炎中高表達(dá)，因此hartupee認(rèn)為 Reg4可能具有絲裂原和生長因子的作用。近年來隨著研究的深入，Reg4 在腫瘤尤其是消化道腫瘤中的作用日漸被重視。最近來自日本實驗室的一 篇文章報道Reg4在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Reg4具有促進(jìn)細(xì) 胞增殖的作用。同時也有研究表明Reg4在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)。華盛頓 大學(xué)一 實驗室研究發(fā)現(xiàn)Reg4可能是EGF受體/AKT/AP-1信號通路的激活 物。但是作為一種新發(fā)現(xiàn)的基因，對Reg4的功能知之甚少，因此有必要 對Reg4進(jìn)行深入的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種抗人再生基因4的單克隆抗體及其制備與應(yīng) 用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞林。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗人再生基因4的單克隆抗體，所述單克隆抗體對SEQIDNo.l 所示核苷酸序列的第333 743位核苷酸(即SEQIDNo.3所示核苷S臾序列) 編碼的多肽具有特異性。所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC No: C200728的細(xì)胞抹分泌產(chǎn)生。本發(fā)明關(guān)鍵在于免疫抗原的確定，選擇SEQ IDNo.l所示核苷酸序列的第333 743位核香酸編碼的多肽作為抗原，在 已知抗原前提下，抗體可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)方便的獲得。所述單克隆抗體對Reg4-his融合蛋白(分子量為17KD )具有反應(yīng)性， 所述Reg4-his融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述單克隆抗體為IgGl亞型，命名為Reg4-G7。一種產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞抹,保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2007年10月1日，保藏 編號CCTCC No: C200728。所述雜交瘤細(xì)胞林由免疫的BALB/c小鼠脾 細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù) 蘇后獲得的小鼠雜交瘤細(xì)胞系Reg4-G7，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體 Reg4-G7。一種所述單克隆抗體的制備方法，所述方法包括用SEQ ID No.2 所示Reg4-his融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合， 篩選出能夠分泌對SEQ ID No.l所示核苷酸序列的第333~743位核苷酸編 碼的多肽具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中 或從注射雜交瘤細(xì)胞的動物腹水中，獲得所述單克隆抗體。所述Reg4-his融合蛋白由以下方法獲得將含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)下獲得Reg4-his包涵體，對Reg4-his包涵體進(jìn)行純化，得到所述的Reg4-his融合蛋白，本發(fā)明所指的IPTG(Isopropyl-卩-D-thiogalactopyranoside，異丙基-卩-D碌u代半乳糖苦)可以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，能對乳糖操縱子產(chǎn)生極強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng),是強(qiáng)誘導(dǎo)物。具體的，所述單克隆抗體由如下方法制備得到 (1 )免疫原的準(zhǔn)備將SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pReceiver-B01-reg4載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3) pLysS大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下，分子量約17KD的Reg4-his以包涵體的形式存在。在本發(fā)明的 一個優(yōu)選實施方案中，以簡便的方法對上述包涵體進(jìn)行了純化，并以純化過的蛋白作為抗原免疫小鼠；(2) 動物免疫用上述純化過的Reg4融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以 期產(chǎn)生針對Reg4蛋白的特異性單克隆抗體。每只小鼠以100ug的 量進(jìn)行背部皮下注射，每兩周一次共三次，第四次沖擊免疫一次， 3天后待融合，獲得免疫小鼠。(3) 雜交瘤細(xì)胞系的建立取免疫小鼠的脾臟細(xì)胞作為能夠產(chǎn)生抗體的 漿細(xì)胞，與同系動物的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0 )以聚乙二醇(PEG1500 ) 介導(dǎo)進(jìn)行融合。融合后細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接酶 聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔 的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)直至克隆化細(xì)胞抗體陽性率為 100%。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復(fù)凍存、復(fù) 蘇，直到細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。(4) 單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù) 處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用親和層析法獲得純化的 單克隆抗體。本發(fā)明還涉及所述的單克隆抗體在檢測Reg4及其編碼蛋白在人組織 中分布及表達(dá)的應(yīng)用。例如通過免疫組化，免疫印跡，酶4關(guān)免疫吸附試 驗檢測Reg4蛋白；用抗人再生基因4單克隆抗體Reg4-G7，采用免疫組 織化學(xué)染色法檢測人全身各組織Reg4蛋白的表達(dá)及定位情況；用抗人再 生基因4單克隆抗體Reg4-G7，采用免疫印跡法(Western-blot)檢測單 克隆抗體相應(yīng)抗原在消化道正常及腫瘤組織中的表達(dá)。為了進(jìn)一步明確Reg4在結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況，對大樣本的結(jié)直腸正常粘膜、腺瘤以及腺癌配對組織進(jìn)行了 Real-time PCR、 westem-blot及免疫組化檢測，試驗結(jié)果表明Reg4在癌旁粘膜及腺瘤中高表達(dá)。以上結(jié)果均表明，Reg4具有作為一種結(jié)直腸癌早期診斷標(biāo)志物的應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明還涉及所述的單克隆抗體在制備^r測試劑盒中的應(yīng)用，所述檢測試劑盒含有與標(biāo)記物結(jié)合的單克隆抗體，所述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物、i文射性標(biāo)記物或酶標(biāo)記物。所述;f企測試劑盒為結(jié)直腸癌早期一企測試劑盒。例如，用抗人再生基因4單克隆抗體Reg4-G7，結(jié)合該蛋白的多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測大腸癌患者外周血中Reg4的水平。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了及一種抗人再生基因4(Regenrating gene 4 )的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞抹，為進(jìn)一步明確Reg4在結(jié)直腸組織中的表達(dá)提供了 基礎(chǔ)，并可用于結(jié)直腸癌的早期檢測試劑盒的制備，具有重要應(yīng)用前景。

圖1為Reg4融合蛋白i秀導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE (PolyAcrylamide GelElectrophoresis,聚丙烯酰胺凝膠)圖；l為包涵體蛋白；2為菌培養(yǎng)上清；3為菌體總蛋白；4為菌體超聲后上清；5為marker;圖2為純化后Reg4融合蛋白的SDS-PAGE圖；1為marker; 2~4均為Reg4融合蛋白；圖3為Reg4單抗純化后SDS-PAGE圖；圖4為純化后的Reg4-G7單克隆抗體ELISA方法;險測效價結(jié)果； 圖5為Reg4-G7單克隆抗體經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行亞型鑒定； 圖6為免疫印跡雜交檢測Reg4-G7單克隆抗體特異性的結(jié)果； 圖7為免疫組化法^r測不同組織中Reg4的表達(dá)情況；圖8顯示了大腸癌癌前病變腺瘤和潰瘍性結(jié)腸炎中Reg4的表達(dá)情況。 具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一 步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此實施例1: Reg4原核表達(dá)載體含有SEQIDNo.3所示核苷S復(fù)序列的pReceiver-B01/Reg4質(zhì)粒，由廣州復(fù)能基因公司構(gòu)建。實施例2: Reg4-his融合蛋白的表達(dá)及純化(1) 重組蛋白誘導(dǎo)挑取含有pReceiver-B01-reg4質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于100ml含有 氯霉素，氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基，37。C220轉(zhuǎn)震蕩過夜。次日，以1: 100稀釋到1000ml2YT培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至OD600介于0.5~1.0之間， 力口入IPTG,使其終濃度為lmM.。 37。C繼續(xù)培養(yǎng)5小時。4°C, 10000rpm 離心20分鐘，收集沉淀并用PBS (Phosphate Buffer Solution)磷酸緩沖 液洗滌，稱量濕菌體的重量，本發(fā)明所用的IPTG來自德國Merck (Calbiochem)生產(chǎn)商。2YT培養(yǎng)基配方Tryptone 16g, Yeast extract 10g, NaC15g,水1000ml, pH7.0;(2) 鹽酸胍變性提取包涵體1 )按4ml/100ml菌液(該菌液體積為IPTG誘導(dǎo)時的菌液體積)的比例 加入PH8.結(jié)合緩沖液，重懸菌體。2)按照每克濕菌加入40ul 10mMPMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride, 苯甲基磺酰氟)，80ull0mg/ml溶菌酶；3)超聲30分鐘，每超聲5秒，間隔5秒，在冰上操作； 4 ) 4°C離心10000rpm, 20分鐘；5) 去上清，用l%tritonX-100洗滌沉淀，離心10000rpm， IO分鐘；6) 去上清，用2M尿素洗滌沉淀，離心10000rpm， 10分鐘；7) 加入6M鹽酸胍裂解菌體，冰上賻育l小時；8 ) 4 。C離心1 OOOOrpm, 20分鐘，收集上清，-20 。C凍存?zhèn)溆谩?(3 ) Reg4-his融合蛋白純化1 )將2ml Ni-NAT HIS.Binding Resin (購自美國Novagen公司)與6ml 蛋白樣品混合，固定在混合旋轉(zhuǎn)儀上，在4。C條件下使之充分混合接觸2 小時；2 )以上述Ni-NAT HIS.Binding Resin與蛋白樣品的混合液裝柱；3 )用5個柱體積緩沖液1平衡鎳柱，注意控制流速；4 )用5個柱體積50 nM的咪哇洗脫液洗脫；5 )用5個柱體積400 nM的咪唑洗脫液洗脫，并以1ml每管收集洗脫液；6) 用IO個柱體積純水過柱清洗；7) 用20%乙醇過柱，并將其4。C保存。以考馬氏亮藍(lán)法初步判斷所得純化蛋白峰值管所在，并做SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白鑒定。最后考馬氏亮藍(lán)法測定蛋白的準(zhǔn)確濃度值。Reg4融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE圖見圖1; 1為包涵體蛋白；2 為菌培養(yǎng)上清；3為菌體總蛋白；4為菌體超聲后上清；5為marker。該 圖說明pReceiver-B01-reg4在1 mM IPTG誘導(dǎo)5個小時后能穩(wěn)定表達(dá) Reg4-his融合蛋白。融合蛋白以包涵體形式存在，其分子量約為17KD。 純化后Reg4-his融合蛋白的SDS-PAGE圖見圖2; 1為marker; 2 4均為 純化后的Reg4-his融合蛋白。該圖說明通過親和層析純化方法獲得了較純的Reg4-his融合蛋白。實施例3:抗血清的制備用含純化的50mgReg4-his蛋白與等體積完全弗氏佐劑充分混勻，使 其乳化，以形成油包水狀為混合成功的標(biāo)志。取雌性6-8周齡的BALB/c 小鼠，于背部皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行初次免疫。兩周后以等體積的不完全代 替弗氏佐劑與50mgReg4-his蛋白進(jìn)行乳化，加強(qiáng)免疫BALB/c小鼠，此 后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫3次后，小鼠眼眶采血并分離血清， 以間接ELISA法測定效價，當(dāng)達(dá)到10—4后準(zhǔn)備融合。融合前三天加強(qiáng)免 疫一次。實施例4:單克隆抗體的制備1、 飼養(yǎng)細(xì)胞鋪板取一只16周齡的BALB/c小鼠，將其拉頸處死后，75 %酒精浸泡消毒。 打開其腹腔，取飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪板，37。C孵箱培養(yǎng)，備用次日。2、 免疫后的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 無菌條件下取免疫后的BALB/c小鼠脾臟，剝離包膜使細(xì)胞游離，過 100目鋼絲網(wǎng)，收集濾過的脾細(xì)胞。將生長狀態(tài)好，處于對數(shù)生長期 的SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞混合，比例為1: 10,以50。/。的PEG(分子量 為1500)為介導(dǎo)進(jìn)行融合，離心后用HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并用該含 有細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基鋪96孔板，每孔2滴。置于37°C ， 5 % C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第3天用HAT培養(yǎng)基半量換液，第五天、第七天 分別半量換液一次。兩周后換HT培養(yǎng)基。HT培養(yǎng)基的配制方法將100倍濃縮的HT液體(lmL )及100倍濃縮的谷氨酰胺稀(lmL)釋入1640培養(yǎng)基(98mL,美國GIBC0公司) HAT培養(yǎng)基的配制方法將100倍濃縮的HT液體(lmL )、 100倍濃 縮A液體(lmL )及100倍濃縮的谷氨酰胺(lmL )稀釋入1640培養(yǎng) 基(97mL )。100 4咅濃縮的HT液配制方法稱耳又136.1mg次黃。票^令(hypoxanthine, H)， 38.8mg胸腺嘧咬核芬(thymidine, T),逐次溶解在100ml雙蒸水 中。過濾除菌，分裝，儲存于-2(TC。100倍濃縮的A液配制方法稱耳又1.76mg氨基喋呤(aminopterin, A), 加入90ml雙蒸水，滴加lmol/L NaOH溶液，不斷搖動直至氨基喋呤 完全溶解，再滴加等量lmol/L鹽酸溶液，恢復(fù)pH值至7.0左右，雙 蒸水補(bǔ)足溶液至lOOrnl，過濾除菌，分裝，儲存于-20°C。 100倍濃縮的谷氨酰胺的配置方法稱取2.92g L-谷氨酰胺溶于100ml 雙蒸水中，過濾除菌，分裝，儲存于-20。C。所用的次黃嘌呤、氨曱蝶呤、胸腺嘧。定核芬和L-谷氨酰胺均來自sigma 公司。 3、雜交瘤細(xì)胞篩選觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，當(dāng)克隆生長至孔底面積的1/3~1/2時，取 上清lOOul,用間接ELISA方法進(jìn)行4企測，篩選陽性克隆。以有限稀 釋法對陽性孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，四次后克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100%。將陽性克隆細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞 經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上，反復(fù)凍存，復(fù)蘇，定期收集上清，用篩 選抗體的方法測定上清中的抗體，直至細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。實施例5:單克隆抗體的大量生產(chǎn)及純化1、 選用12周齡以上的BALB/c小鼠，腹腔注射lml液體石蠟， 一周后收 集生長狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠腹腔注射&106個雜交瘤 細(xì)胞。7~ IO天后小鼠腹部可見明顯膨隆，收集腹水。3000rpm離心5分 鐘，取上清，分裝，-20。C保存。用飽和硫酸銨沉淀法將腹水進(jìn)行初步提 純，之后用ProteinA親和層析法將其進(jìn)一步純化，Reg4單抗純化后的 SDS-PAGE圖見圖3。該圖顯示了抗體的輕鏈及重鏈聚合體，初步證明前 述步驟收獲了純度較高的抗體。2、 抗人Reg4單克隆抗體Reg4-G7腹水效價及亞型鑒定用間接ELISA方法，檢測純化后單克隆抗體的效價為k 1 (T4 (結(jié)果 見圖4)。收集雜交瘤細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體的亞型(所用試劑盒購買自 Southembiotech公司貨號為Cat5500-01 ),亞型為IgGl型，輕鏈為k型(結(jié) 果見圖5)。圖6為免疫印跡雜交檢測Reg4-G7單克隆抗體特異性的結(jié)果，顯示 19KD下方約17KD處出現(xiàn)條帶，證明該抗體特異性佳。實施例6: Reg4蛋白在人體組織中的分布及表達(dá) Envision加強(qiáng)法免疫組織化學(xué)染色(l)脫蠟水化將烘干的切片依次置于 二曱苯三道 每道15分鐘 5分鐘 5分鐘 5分鐘 5分鐘100 %酒精 90%酒精 75%酒精 50%酒精取出切片，用0.01M, pH7.4PBS (Phosphate Buffer Solution)磷酸緩沖 液洗滌3次，每次IO分鐘。
(2 )阻斷內(nèi)源性過氧化物酶將脫蠟水化后的切片置于3 %的過氧化 氫甲醇中15分鐘。(3 ) PBS洗滌3次，每次5分鐘。(4) 抗原修復(fù)將切片置于盛有0.01M, pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液的 容器中，進(jìn)行微波修復(fù)(80火力8分鐘，60火力6分鐘兩次)。(5) 取出后室溫自然冷卻，PBS洗滌3次，每次5分鐘。 (6 )根據(jù)抗體需要以血清對組織進(jìn)行封閉。(7 )滴加Reg4-G7 ( 1: 800稀釋)，置4。C水箱中過夜。(8) 第二日取出玻片以PBS洗滌3次，每次5分鐘。(9) 滴加抗鼠二抗，室溫下孵育40分鐘。 (10 ) PBS洗滌3次，每次5分鐘。(11 )每張切片滴加新配制的DAB (3， 3，-diaminobenzidine， 二氨基 聯(lián)苯胺)顯色液，光學(xué)顯微鏡下觀察3~5分鐘，以出現(xiàn)特異性的細(xì)胞著 色為顯色成功。DAB顯色液的配置方法為稱取0.003gDAB,溶于5mlPBS 中，加入3.5ul過氧化氬溶液，過濾。本發(fā)明所用的DAB并分劑購買自sigma 公司。(12) 流水沖洗30分鐘終止顯色。(13) 蘇木素復(fù)染胞核將上述沖洗干凈的玻片置于蘇木素液中20-30秒，取出后自來水沖洗藍(lán)化。(14) 切片脫水依次經(jīng)梯度酒精脫水干燥。(15) 二甲苯透明5分鐘。(16)封片每片滴加中性樹膠，覆蓋以蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。(17 )陰性對照以PBS代替一抗。全身組織Reg4免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Reg4在胃腸道中的表達(dá)較特 異，另外在個別甲狀腺癌中也有表達(dá)。圖7為Reg4在正常大腸(A)及 曱狀腺癌(B)中的表達(dá)。該結(jié)果說明Reg4表達(dá)具有胃腸道相對特異性。圖8為大腸癌癌前病變腺瘤和潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 Reg4在結(jié)直腸癌癌前病變中有高表達(dá)趨勢，由此可見，Reg4對于結(jié)直腸 癌早期診斷可能具有重要價值。實施例7:雙抗夾心ELISA法檢測結(jié)直腸癌患者與正常人群外周血中Reg4蛋白水平1. 用稀釋后Reg4多克隆抗體包凈皮酶標(biāo)板，4"C過夜；2. 棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌3次，每次3分鐘；3. 加入待測血清，37°C，濕盒，孵育2小時；4. 棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌3次，每次3分鐘；5. 加入10%小牛血清37。C封閉30分鐘；6. 棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌3次，每次3分鐘；7. 加入稀釋后的Reg4-G7單克隆抗體，37°C，濕盒，孵育2小時；8. 棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌3次，每次3分鐘；9. 加入-束才艮過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗，37°C，濕盒，孵育l小時；10. 分別加入TMB(Tetramethylbenzidine,四曱基聯(lián)苯胺)顯色液A和B 液；11. 避光顯色3 5分鐘后，加入終止液；12. 用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。 包被緩沖液配方 Na2C03 1.59gNaHC03 2.93g ddH20定容至1L, pH調(diào)節(jié)至9.62 ) PBST配方在PBS中加入0.05 % tween20 (購自上海生工)及1 % 小牛血清；3 )顯色液配方A: TMB(TMB.2HC1) 20mg，無水乙醇10ml，溶解后加ddH20定容至 100ml;B: NaAc-HAc緩沖液，1.36g NaAc.3H20, HAc調(diào)pH值5.4 5.6, 0.004% 過氧化尿素(過碳酰胺)用時1:1混合，每孔lOOul; 4)終止液2MH2S04建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測了健康人群及結(jié)直腸癌患者外周血中的Reg4 蛋白，初步結(jié)果顯示，Reg4蛋白在164例結(jié)直腸癌患者的外周血中有80 例為陽性，而在124例健康人群外周血中，僅有5例為陽性，Reg4蛋白 在結(jié)直腸癌患者中的水平明顯增高，因此結(jié)合其他臨床病例資料，以Reg4 作為結(jié)直腸癌早期診斷指標(biāo)具有^^大的潛力。16序列表SEQUENCE LISTING<110>浙江大學(xué)<120>抗人Reg4的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用以及雜交瘤細(xì)胞株<130><160> 3<170> Patentln version 3. 4<210〉 1〈211〉 1285<212> 腿<213> Human astrovirus<400〉 1tatggatggattgtttttcttatcgctttgtgactaaagt60aaagattattaattcctgaggcaagaagatataaaagctccagaaacgttgactgggacc120actggagacacaggggcccttagagtcttggttgccaaacagatttgcag180atcasggagaacccaggagtttcaaagaagcgctagtaaggtctctgagatccttgcact240agctacatcctcagggtaggcttccagaagcatgcggctgctcctattgc300tgagctgcctggcc肪aacaggagtcctgggtgatatcatcatgagacccagctgtgctc360ctggatggttttaccacaagtccaattgctatggttacttcaggaagctgaggaactggt420ctgatgccgagctcgagtgtcagtcttacgg肪acggagcccacctggcatctatcctga480gtttaaaggs兆ccagcaccatsgcagagtacat犯gtggctstcagagaagccagccga540mggattggcctgcacgacccacag犯gaggcagcagtggcagtggattgatggggcca600tgtatctgtacagatcctggtxtggc幼gtccatgggtgggaacaagcactgtgctgaga660tgagctccaataac犯ctttttaacttggagcagcaacgaatgcaac肌gcgccaacact720tcctgtgcaagtaccgaccatagagc幼gaatcaagattctgctaactcctgcacagccc780cgtcctcttcctttctgctagcctggctaaatctgctcattatttcagaggggaaaccta840gcaaactaagagtgataagggccctactacactggcttttttaggcttag3g3cagaaac900tttagcattggcccagtagtggcttctagctctaaatgtttgccccgccatccctttcca960cag"tatccttcttccctcctCCCC"tg"tC"tCtggctgtctcgagcagtctaga卿gtgca1020tctccagcctatgaaacagctgggtcUtggccataagaagtaaagatttgaagscagaa1080ggaagaaactc郎g站taagcttctagaccccttcagcttctacacccttctgccctctc11401200tccattgcctgaaggtttaccagtagaatxcttgctaggttgatgtgggccatacattcc111aataaac1260cattgtgtacat犯gaia^a a犯犯1285<210> 2 <211> 151 <212> PRT<213> Human astrovirus <400> 2Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Glu Gly Val Arg Thr Asp 15 10 15lie lie Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser 20 25 30Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys 35 40Leu Arg AsnTrp Ser Asp Ala Glu 45Leu Glu Cys Gin Ser Tyr Gly Asn 50 55Gly Ala HisLeu Ala Ser lie Leu 60Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr lie 65 ' 70Ala Glu Tyr 75lie Ser Gly Tyr Gin 80Arg Ser Gin Pro lie Trp lie Gly 85Leu His Asp 90Pro Gin Lys Arg Gin 95Gin Trp Gin Trp lie Asp Gly Ala 100Met Tyr Leu 105Tyr Arg Ser Trp Ser 110Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys '115 120His Cys AlaGlu Met Ser Ser Asn 125Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser 130 135Asn Glu CysAsn Lys Arg Gin His 140Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 145 150<210> 3 〈211> 411 <212> 醒 〈213> Human astrovirus<400〉 3 gatatcatca tgagacccag ctgtgctcctggatggttttaccacaagtc caattgctat60ggttacttca gg幼gctgag gaactggtctgatgccgagctcgsgtgtca gtcttacgga120aacggagccc acctggcatc tatcctgagtttaaagg膽gccagcaccat agcagagtac180ataagtggct atcagagaag ccagccgatatggattggcctgcacgaccc acagaagagg240cagcagtggc agtggattga tggggccatgtatctgtacagatcctggtc tggcaagtcc300atgggtggga acaagcactg tgctgagatgagctccaa_taacaacttttt aacttggagc360a_gcaacg^"t gc犯caagcg cc33cacttcctgtgcaagtaccgaccata g41權(quán)利要求
1.一種抗人再生基因4的單克隆抗體，所述單克隆抗體對SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸編碼的多肽具有特異性，所述的單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NoC200728的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體對 Reg4-his融合蛋白具有反應(yīng)性，所述Reg4-his融合蛋白氨基酸序列如 SEQ IDNo.2所示。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體為 IgGl亞型。
4. 一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞抹，保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2007年 10月1日，保藏編號CCTCCNo: C200728。
5. 如權(quán)利要求1所述單克隆抗體的制備方法，所述方法包括用SEQID No.2所示Reg4-his融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 融合，篩選出能夠分泌對SEQ ID No.l所示核苷S吏序列的第333 743 位核苷酸編碼的多肽具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交 瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞的動物腹水中，獲得所述單克隆 抗體。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述Reg4-his融合蛋白由以下 方法獲得將含有SEQIDNo.3所示核苷酸序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌，IPTG誘導(dǎo)下獲得Reg4-his包涵體，對Reg4-his包涵體進(jìn)行純化， 得到所述的Reg4-his融合蛋白。
7. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測Reg4基因及其編碼蛋白在人組 織中分布及表達(dá)的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用，所述才企 測試劑盒含有與標(biāo)記物結(jié)合的單克隆抗體，所述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物、 》文射性標(biāo)i己物或酶標(biāo)i己物。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述才企測試劑盒為結(jié)直腸癌早 期檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人再生基因4(Regenrating gene 4)的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所述單克隆抗體對SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸(即SEQ ID No.3所示核苷酸序列)編碼的多肽具有特異性。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了及一種抗人再生基因4(Regenratinggene 4)的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為進(jìn)一步明確Reg4在結(jié)直腸組織中的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，并可用于結(jié)直腸癌的早期檢測試劑盒的制備，具有重要應(yīng)用前景。
文檔編號C07K16/18GK101270161SQ20081006011
公開日2008年9月24日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者李風(fēng)英, 來茂德, 沈建根 申請人:浙江大學(xué)