專利名稱：：一種查爾霉素化合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)是一種查爾霉素化合物及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：查耳霉素首次從鏈霉菌5^eptom少ceyZ^/w/m^分離得到，為16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯，其糖苷配基帶有2,3反向雙鍵。查耳霉素具有非常強(qiáng)的抑菌活性，可以抑制多種細(xì)菌如5ya//7j/的生長(zhǎng)(FrohardtRP,PitilloRF,andEhrlichJ.Chalcomycinanditsfermentativeproduction.1962.U.S.patent3,065,137.)。同時(shí)，chalcomycin能夠抑制HeLa細(xì)胞的蛋白合成(GuptaRS，MurrayW，andGuptaR.Crossresistancepatterntowardsanticancerdrugsofahumancarcinomamultidmg-resistantcellline.BrJCancer.1988(58):441-447)。目前已報(bào)道多例査耳霉素同系物，它們?cè)贑-5和C-19各連有一個(gè)中性糖(KimSD，RyooIJ,KimCJ,KimWG，KimJP,KongJY,KoshinoH，UramotoM,andYooID.GERI-155,anewmacrolideantibioticrelatedtochalcomycin.JAntibiot.1996(49):955957;GooYM，LeeYY,andKimBT.Anew16-memberedchalcomycintypemacrolideantibiotic,250-144C.JAntibiot.1997(50):8588;Asolkar脂，MaskeyRP，HelmkeE,andLaatschH.ChalcomycinB，anewmacrolideantibioticfromthemarineisolate5V/'e/to附F^sp.B7064.JAntibiot.2002(55):893898;ChatterjeeS,ReddyGCS，F(xiàn)rancoCMM,RuppRH,GanguliBN,FehlhaberHW，andKoglerRSwalpamycin,anewmacrolideantibioticii.Structureelucidation.JournalofAntibiotics.1987(40):1368-1374)。鑒于查耳霉素類化合物的活性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)的査耳霉素類化合物具有重要意義。同時(shí)，該族化合物的抗腫瘤活性卻未見(jiàn)有專利保護(hù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種查爾霉素化合物及其制備和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的的技術(shù)方案為查爾霉素化合物具有式一、式二或式三的結(jié)構(gòu)式，分別為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式一化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>18式三化合物查爾霉素化合物的制備方法按如下步驟操作1)固體培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M491接種于JT固體培養(yǎng)基，在28-30°C下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出青灰色的孢子；其中鏈霉菌M491保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2446;2)搖床培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的0.5-1.02帶有孢子絲的瓊脂塊接種到200-250ml豆粉液體培養(yǎng)基，在28-30。C溫度以110-130rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行搖床培養(yǎng)4-5天后，待用；3)萃取將上述發(fā)酵液用有機(jī)溶劑浸提3-4次，合并有機(jī)相濃縮得粗提物.純化將粗提物經(jīng)硅膠柱層析，以1-3L二氯甲烷，2-4L二氯甲烷/2%(體積比例)甲醇，1-3L二氯甲烷/5y。(體積比例)甲醇，1-3L二氯甲烷/10%(體積比例)甲醇梯度進(jìn)行洗脫，流速為8-llmL/min,將所得組分3經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯色待含棕黃色的條帶，經(jīng)葡聚糖層析后，在展開(kāi)劑為二氯甲烷/0/。甲醇時(shí)尺/=0.50-0.52分離得到式一化合物；組分4經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯色待含棕黃色的條帶，再將組分4經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷/7%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，待以展開(kāi)劑為二氯甲垸/10%甲醇時(shí)Af=0.22-0.24處，分離得到式二化合物，在Af=0.25-0.27分離得到式三化合物。所述所述M2+瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9-11g,酵母粉3-5g,葡萄糖3-5g，瓊脂粉12-18g,1L天然海水，pH7.5-8.0;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19-21g，甘露醇19-21g，1L天然海水，pH7.5-8.0。所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19-21g，甘露醇19-21g，人工海水450-550ml，自來(lái)水450-550ml,調(diào)整pH為7.6-8.0。查爾霉素化合物的應(yīng)用所述式一化合物、式二化合物或式三化合物可在制備抗腫瘤、抗菌、或抗病毒藥物中。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明所涉及的化合物為新穎結(jié)構(gòu)，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有專利或文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)其查爾霉素尚未有抗腫瘤化合物專利保護(hù)。2.本發(fā)明利用海洋微生物資源，尋找到一種化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的化合物，它具有抗腫瘤活性，對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞有抑制作用；為臨床提供了新型藥物或先導(dǎo)化合物。圖1為本發(fā)明式二化合物的HMBC相關(guān)圖譜。圖2為本發(fā)明式三化合物的糖酐配基的HMBC相關(guān)圖譜。圖3為本發(fā)明式二化合物和式三化合物的糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的HMBC效應(yīng)圖。圖4為本發(fā)明化合物的制備流程圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1查爾霉素化合物具有式一、式二或式三的結(jié)構(gòu)式，分別為式一化合物式一化合物的物理常數(shù)及波譜數(shù)據(jù)white,cryst;OR[a]2D7(-43.5,c=l,EtOH)(-40，EtOH);mp(121-123)(120-121);R產(chǎn)0.55(CHC13/10%MeOH);UV(EtOH)入max(218,319)(240，198);(219,281)(240，170);IR(KBr)v3490,2930，1718,1630,1498,1350,1236，1170,1083，982，8卯，726m1.NMR(CDC13，300MHz):6.66(dd，15.4，10.2Hz,3-H),6.58(m，10，ll-H)，5.82(d,15.4Hz，2-H),5.34(dq，10.9，6.5Hz,15-H),4.58(d,7.5Hz,l"-H),4.22(dd，15.4，10.2Hz，l'陽(yáng)H),4.19(dd，10.2，3.0Hz,19-HA),3.85(brs，H7D20-ex，1H)，3.78(t，3.0Hz，3"-H),3.66(dd,10.2,3.4Hz，19-HB),3.63(s,3"-OMe),3.57(s,2"-OMe),3.51(m,5"畫(huà)H),3.45(m,5'隱H),3.42(s，3'-OMe),3.31(m,2",10-H),3.22(m，3'-H)，3.18(m，4"-H),3.16(dd,9.4,1.8Hz,13-H),3.08(dd,9.9,2.6Hz，2"-H)，2.72(m，4-H),2.05(m，4'-HA)，1.88(m,7-H),1.39(s,18-Me),1.38(m,14-H)，1.35(d,6.4Hz，20-Me)，1.28(d，6.4Hz，6"-Me)，1.26(m，4'，6-H),1.23(d，6.2Hz，6'隱Me)，1.21(d，6.3Hz,16-Me)，1.01(d，6.8Hz,17-Me);'3CNMR(CDC13，75.5MHz):165.3(Cl)，120.7(C2)，151.8(C3),41.7(C4)，87.8(C5),34.0(C6),37.0(C7),78.4(C8),200.2(C9),124.8(CIO)，146.5CC11),59.7(C12)，59.0(C13),49.5(C14)，68.9(C15),18.6(C16)，19.2(C17)，27.8(C18),66.9(C19),18.3(C20)，103.2(Cl')，75.0(C2'),80.5(C3'),36.8(C4')，67.7(C5'),20.9(C6')，100.9(Cl"),81.9(C2")，79.6(C3")，72.9(C4")，70.7(C5")，17.8(C6")，56.7(3'0Me),58.7(2'OMe),61.7(3"OMe)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式二化合物(參見(jiàn)圖1)式三化合物(參見(jiàn)圖2)所述式二化合物和式三化合物的物理常數(shù)、核磁共振氫譜數(shù)據(jù)、核磁共振碳譜數(shù)據(jù)分別參見(jiàn)表1-3。式二化合物和式三化合物的糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)由HMBC確定(圖3)。表l所述二化合物和式三化合物的物理常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2所述式二化合物和式三化合物的'HNMR數(shù)據(jù)(CDC13，600MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3所述式二化合物和式三化合物的"CNMR數(shù)據(jù)(CDC13,150MHz)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2制備式一化合物、式二化合物和式三化合物(參見(jiàn)圖4):1)樣品采集從青島近海釆集海泥樣品，在實(shí)驗(yàn)室中利用高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行梯度10—、10—2，10—3稀釋劃線培養(yǎng)，純化得到一株海洋鏈霉菌M491;其中鏈霉菌M491保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCCNo.2446;所述高氏一號(hào)培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g,硝酸鉀lg，磷酸二氫鉀O.5g，硫酸鎂O.5g，氯化鈉O.5g,硫酸亞鐵O.01g,重鉻酸鉀O.1g,瓊脂粉18g，天然海水500ml，自來(lái)水500ml，調(diào)整pH為7.2。2)固體培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M491接種于NT固體培養(yǎng)基，28。C培養(yǎng)3天，直至長(zhǎng)出青灰色的孢子；所述M2+固體培養(yǎng)基為大麥提取物10g,酵母粉4g,葡萄糖4g,天然海水500ml,自來(lái)水500ml,瓊脂粉14g，調(diào)整pH為7.4。3)搖床培養(yǎng)從所述M2+固體培養(yǎng)基上挑取菌苔接種到100個(gè)1000ml的Erlenmeyer三角瓶中，每個(gè)三角瓶中含有已滅菌的250ml豆粉液體培養(yǎng)基，在28。C下回旋式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110rpm，4天后，收獲發(fā)酵液待用；所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉20g,甘露醇20g，人工海水500ml，自來(lái)水500ml，調(diào)整pH為7.8。4)有機(jī)溶劑萃取將上述發(fā)酵液通過(guò)板式過(guò)濾器分開(kāi)菌液與菌泥，分別用乙酸乙酯浸提4次，合并有機(jī)溶劑相后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干，得到膏狀粗提物10g;(5)分離純化將粗提物經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷/甲醇為梯度洗脫，即2L二氯甲烷，3L二氯甲烷/2%(體積比例)甲醇，2L二氯甲烷/5%(體積比例)甲醇，2L二氯甲烷/10y。(體積比例)甲醇，流速為10ral/min，分別得到組分l，2，.3，4。組分3含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，經(jīng)葡聚糖(甲醇)層析后，在展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇，7/^0.51分離得到式一化合物；組分4也含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，將組分4經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷/7%甲醇為洗脫劑，流速為5ml/min,以展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇時(shí)/^=0.23處，分離得到式二化合物，在玎=0.26分離得到式三化合物。實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于1)固體培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M491接種于!T固體培養(yǎng)基，在29C下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出青灰色的孢子。2)搖床培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的0.5，2帶有孢子絲的瓊脂塊接種到200ml豆粉液體培養(yǎng)基，在28。C溫度以130rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行搖床培養(yǎng)4-5天后，待用；3)萃取將上述發(fā)酵液用有機(jī)溶劑浸提4次，合并有機(jī)相濃縮得粗提'所述所述M2+瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9g，酵母粉3g,葡萄糖3g，瓊脂粉12g，1L天然海水，pH7.5;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19g,甘露醇19g，1L天然海水，pH7.5。所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19g,甘露醇19g,人工海水45Oml,自來(lái)水450ml，調(diào)整pH為7.6。5)分離純化將粗提物經(jīng)硅膠柱層析分別得到組分l,2,3，4。組分3含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，經(jīng)葡聚糖(甲醇)層析后，在展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇，A/=0.50分離得到式一化合物；組分4也含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，將組分4經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷/7%甲醇為洗脫劑，流速為5ral/min,以展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇時(shí)紅=0.22處，分離得到式二化合物，在耵=0.25分離得到式三化合物。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于1)固體培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M491接種于M"固體培養(yǎng)基，在3(TC下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出青灰色的孢子。2)搖床培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的1.0cn帶有孢子絲的瓊脂塊接種到230ml豆粉液體培養(yǎng)基，在30'C溫度以120rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行搖床培養(yǎng)4-5天后，待用；所述所述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物11g，酵母粉5g,葡萄糖5g，瓊脂粉18g,1L天然海水，pH8.0;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉21g,甘露醇21g,1L天然海水，pH8.0。所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉21g,甘露醇21g，人工海水550ml，自來(lái)水550ml，調(diào)整pH為8.0。5)分離純化將粗提物經(jīng)硅膠柱層析分別得到組分l，2,3，4。組分3含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，經(jīng)葡聚糖(甲醇)層析后，在展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇，7/=0.52分離得到式一化合物；組分4也含有一條經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯棕黃色的條帶，將組分4經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷/7%甲醇為洗脫劑，流速為5ml/min，以展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇時(shí)/廠=0.24處，分離得到式二化合物，在Wf=0.27分離得到式三化合物。實(shí)施例4式一化合物、式二化合物和式三化合物的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)由德國(guó)Oncotest生物公司進(jìn)行測(cè)定，選用人體腫瘤細(xì)胞系(H腿anCancerCellLines),包括膀胱癌細(xì)胞1218L,T24;宮頸癌細(xì)胞498NL,SF268;結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT116,HT29;胃癌細(xì)胞251L;頭頸部腫瘤536L;肺癌細(xì)胞1121L，289L，526L，529L，629L，H460;乳腺癌細(xì)胞401NL，MCF7,MDA231;黑瘤細(xì)胞276L,394NL，462NL，514L,520L;卵巢癌細(xì)胞1619L，899L,0VCAR3;胰腺癌細(xì)胞1657L，PANC1;前列腺癌細(xì)胞22RV1，DU145,LNCAP,PC3M;胸膜瘤1752L;腎癌細(xì)胞1781L，393NL,486L，944L;子宮癌細(xì)胞1138L實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:平均IC5。分別為0.015pg/ml(式一化合物)，0.027pg/ml(式二化合物)，0.007pg/ml(式三化合物)，表現(xiàn)出抗腫瘤活性。權(quán)利要求1.一種查爾霉素化合物，其特征在于具有式一、式二或式三的結(jié)構(gòu)式，分別為式一化合物式二化合物式三化合物2.—種按權(quán)利要求1所述的查爾霉素化合物的制備方法，其特征在于按如下步驟操作1)固體培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M491接種于M2+固體培養(yǎng)基，在28-3(TC下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出青灰色的孢子；其中鏈霉菌MM1保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCCNo.2"6;2)搖床培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的Q.5-1.0cm2帶有孢子絲的瓊脂塊接種到200-250ml豆粉液體培養(yǎng)基，在28-35。C溫度以110-130rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行搖床培養(yǎng)4-5天后，待用；3)萃取將上述發(fā)酵液用有機(jī)溶劑浸提3-4次，合并有機(jī)相濃縮得粗提物；4)純化將粗提物經(jīng)硅膠柱層析，以l-3L二氯甲烷，2-4L二氯甲烷/2%甲醇，1-3L二氯甲烷/5^甲醇，1-3L二氯甲烷/10y。甲醇梯度進(jìn)行洗脫，流速為8-11mL/min，將所得組分3經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯色待含棕黃色的條帶，經(jīng)葡聚糖層析后，在展開(kāi)劑為二氯甲烷/10%甲醇時(shí)肛=0.50-0.52分離得到式一化合物；組分4經(jīng)濃硫酸/茴香醛顯色待含棕黃色的條帶，再將組分4經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷/7%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，待以展開(kāi)劑為二氯甲垸/10%甲醇時(shí)玎=0.22-0.24處，分離得到式二化合物，在if-O.25-0.27分離得到式三化合物。3.按權(quán)利要求2所述的查爾霉素化合物的制備方法，其特征在于所述所述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9-11g，酵母粉3-5g,葡萄糖3-5g,瓊脂粉12-18g，1L天然海水，pH7.5-8.0;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19-21g,甘露醇19-21g，1L天然海水，pH7.5-8.0。4.按權(quán)利要求2所述的査爾霉素化合物的制備方法，其特征在于所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉19-21g，甘露醇19-21g,人工海水450-550ml，自來(lái)水450-550ml,調(diào)整pH為7.6-8.0。5.—種按權(quán)利要求1所述的査爾霉素化合物的應(yīng)用，其特征在于所述式一化合物、式二化合物或式三化合物可在制備抗腫瘤、抗菌、或抗病毒藥物中。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)是一種查爾霉素及其制備和應(yīng)用。具體化合物為式一化合物、式二化合物和式三化合物，制備方法為將海洋鏈霉菌M491，經(jīng)發(fā)酵積累粗提物，利用硅膠層析等多種層析方法分離得到式一化合物、式二化合物和式三化合物，同時(shí)所述式一化合物、式二化合物或式三化合物可在制備抗腫瘤、抗菌、或抗病毒藥物中。本發(fā)明利用海洋微生物資源，尋找到一種化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的化合物，它具有抗腫瘤活性，對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞有抑制作用；為臨床提供了新型藥物或先導(dǎo)化合物。文檔編號(hào)C07H17/00GK101624413SQ20081013833公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者玲丁,哈特穆特·拉赤,張偉杰,李富超,松秦申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所