專利名稱：通過(guò)clec-6激活人抗原呈遞細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及抗原呈遞和免疫細(xì)胞激活領(lǐng)域，具體地，涉及通 過(guò)CLEC-6 C型凝集素激活免疫細(xì)胞。
背景技術(shù)：
不限制本發(fā)明的范圍，描述與樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)的發(fā)明背景。 樹(shù)突細(xì)胞通過(guò)提供可溶性細(xì)胞間信號(hào)繼而病原菌識(shí)別而在控制先天性 和獲得性免疫的界面中起著關(guān)鍵作用。樹(shù)突細(xì)胞的這些功能主要依賴于特定 的表面受體，"模式識(shí)別受體(PRR)"，最為典型的例子是toll樣受體(TLR)和 C型凝集素或凝集素樣受體(LLR)(l-3)。在目前的模式中，TLR的主要作用 是提醒DC以產(chǎn)生白細(xì)胞介素12 (IL-12)和其它炎癥細(xì)胞因子以起始免疫應(yīng) 答。C-型LLR作為巨噬細(xì)胞和DC中強(qiáng)大的抗原捕獲和攝取機(jī)制的組成部分 發(fā)揮作用(l)。然而，與TLR相比，LLR可能具有更寬泛的生物功能，包括 細(xì)胞遷移(4)、細(xì)胞間相互作用(5)。 LLR的這些多重功能可以是由于不同于 TLR, LLR能夠識(shí)別自身和非自身的事實(shí)。然而，LLR的復(fù)雜性，包括免疫 細(xì)胞中表達(dá)的眾多LLR的冗余性，是對(duì)各個(gè)LLR的詳細(xì)功能理解的主要障 礙之一。此外，大多數(shù)這些受體的天然配體仍然沒(méi)有被鑒定出來(lái)。雖然如此， 最近研究的證據(jù)表明LLR與TLR協(xié)同在微生物感染過(guò)程中可以對(duì)激活免疫 細(xì)胞起作用(6-14)。
發(fā)明概述
本發(fā)明包括利用抗人CLEC-6單克隆抗體(mAb)以及鑒定它們的生物功 能的組合物和方法，其中這些生物功能是預(yù)期的抗CLEC-6 mAb及其替代物 的治療應(yīng)用的基礎(chǔ)。本發(fā)明包括接觸抗原呈遞細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞(DC),所 述細(xì)胞表達(dá)CLEC-6并在與特定的DC激活相關(guān)的攝取抗原而導(dǎo)致改變的體 液和細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)并鑒定了特異的能夠激 活具有CLEC-6的細(xì)胞的試劑(agent),以及在接受這些信號(hào)的細(xì)胞中導(dǎo)致的 變化對(duì)免疫系統(tǒng)中其它細(xì)胞的影響。這些影響(單獨(dú)，或者與其它信號(hào)協(xié)同(即共激活))高度預(yù)測(cè)對(duì)特定疾病狀態(tài)的治療效果或者在接種免疫中增強(qiáng)的保 護(hù)性效果。
發(fā)現(xiàn)作為L(zhǎng)LR成員之一 的CLEC-6單獨(dú)或與其它細(xì)胞信號(hào)協(xié)作在激活細(xì) 胞(包括DC)方面發(fā)揮功能。CLEC-6介導(dǎo)的細(xì)胞激活受抗CLEC-6 mAb的誘 導(dǎo)，因而抗人CLEC-6 mAb或其替代物在開(kāi)發(fā)針對(duì)疾病的試劑中是有用的。
本發(fā)明包括用于增加表達(dá)CLEC-6的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞效力的組
進(jìn)行，其中抗原呈遞細(xì)胞被激活。所述抗原^it細(xì)胞可以是分離的樹(shù)突細(xì)胞: 外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞、髓樣樹(shù)突細(xì)胞及它們的組合。在一個(gè)具體實(shí)施 方案中，抗原呈遞細(xì)胞是已在體外與GM-CSF和IL-4、干擾素a、抗原及其 組合一起培養(yǎng)的分離的樹(shù)突細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、髓 樣樹(shù)突細(xì)胞及這些細(xì)胞的組合。所述方法還可包括用GM-CSF和IL-4激活 抗原呈遞細(xì)胞的步驟，其中與CLEC-6特異性抗體或其片段的接觸增加抗原 呈遞細(xì)胞上的CD86和HLA-DR的表面表達(dá)。
發(fā)現(xiàn)可以使用本發(fā)明用CLEC-6特異性抗體或片段激活抗原呈遞細(xì)胞， 以增加抗原呈遞細(xì)月包上的CD86、 CD80和HLA-DR的表面表達(dá)。如果抗原 呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞(CD)，用CLEC-6特異性抗體和GM-CSF和IL-4激活 的DC具有圖4的基因表達(dá)譜。用CLEC-6特異性抗體激活的抗原呈遞細(xì)胞 分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa及其組合，而如果APC是樹(shù)突細(xì) 胞，則它們分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa、 IL-12p40、 IL-la、 IL-lb及其組合。當(dāng)激活已與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸的樹(shù)突細(xì)胞時(shí)， CLEC-6特異性抗體或其片段以及CD40配體進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)樹(shù)突細(xì)胞的激活。 當(dāng)與GM-CSF和IL-4或干擾素a以及CLEC-6特異性抗體或其片段4妻觸時(shí)， DC增加其共刺激活性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本發(fā)明的方法通過(guò)經(jīng)TLR9受體和 CLEC-6凝集素共激活抗原呈遞細(xì)胞來(lái)激活抗原呈遞細(xì)胞，其中所述細(xì)胞增 加細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，甚至觸發(fā)B細(xì)胞增殖。還發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞存 在下，用CLEC-6和LOX-l共激活抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫球蛋白 類別轉(zhuǎn)換。TLR9受體可被TLR9配體、抗TLR9抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6雜交抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6配體結(jié)合物所激活。 CLEC-6特異性抗體或其片段的例子可選自克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8 及它們的組合。用CLEC-6特異性抗體或其片段通過(guò)CLEC-6-受體激活的樹(shù) 突細(xì)胞也激活單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、B細(xì)胞及它們的組合。
本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案包括與粘附蛋白(Cohesin) /錨定蛋白 (Dockerin)對(duì)的一半(half)結(jié)合的CLEC-6特異性抗體或其片段。CLEC-6特異性抗體或其片段可以與粘附蛋白/錨定蛋白對(duì)的一半結(jié)合，而互補(bǔ)性一半
(complementaryhalf)可以與抗原結(jié)合。抗原可以是分子、肽、蛋白質(zhì)、核酸、 碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、病毒或其部分、細(xì)菌或其部分、真菌或其部分、 寄生蟲(chóng)或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CLEC-6特異性抗體或其片段與粘 附蛋白/錨定蛋白對(duì)的一半結(jié)合，而該對(duì)的另一半與一種或多種細(xì)胞因子結(jié) 合，所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(FGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，結(jié)締組織活 性肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長(zhǎng)因子的生物活性類似物、片段和衍生 物，B/T細(xì)胞分化因子，B/T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促有絲分裂細(xì)胞因子，趨化細(xì) 胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-卩，IFN-y， IL1, IL2, 113, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8,工9, IL10, ELll， IL12, IL13, IL14, IL15， IL16, IL17, IL18等，瘦素(leptin),肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin)， 巨噬細(xì)胞刺激蛋白，血小板衍生生長(zhǎng)因子，TNF-a， TNF-(3, NGF, CD40L， CD137L/4畫(huà)1BBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF， M陽(yáng)CSF, GM隱CSF， PDGF， IL-la， ILl-卩，IP-10, PF4, GRO, 9E3，促紅細(xì)月包生成素，內(nèi)皮抑素(endostatin)， 血管抑素(angiostatin), VEGF,包括卩轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(例如TGF-(31、 TGF-卩2、 TGF-p3)在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)超基因家族；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如 BMP-1、 BMP隱2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP隱7、 BMP-8、 BMP-9); 肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小 板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、 抑制素B);生長(zhǎng)分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例如活化素A、活化 素B、活化素AB)。
本發(fā)明還包括用于將髓樣樹(shù)突細(xì)胞與漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞分開(kāi)的方法，該 方法通過(guò)利用CLEC-6表達(dá)將表達(dá)CLEC-6的髓樣樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞或單核 細(xì)胞與不表達(dá)CLEC-6的漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞分離來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明包括表達(dá)CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述 CLEC-6特異性抗體或其片^:激活抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)新的表面標(biāo)記物、分泌 一種或多種細(xì)胞因子或者既表達(dá)新的表面標(biāo)記物又分泌一種或多種細(xì)胞因 子，所述雜交瘤例如克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8及其組合?？笴LEC-6 雜交瘤產(chǎn)生的抗體可用于增強(qiáng)B細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法中，通過(guò)觸發(fā)B細(xì)胞 上的CLEC-6受體以增加抗體的產(chǎn)生、分泌細(xì)胞因子、增加B細(xì)胞激活表面 標(biāo)記物的表達(dá)及其組合。B細(xì)胞分泌IL-8、 MIP-la及其組合，和/或增加 IgM、 IgG和IgA的產(chǎn)生。
本發(fā)明還包括用于增強(qiáng)T細(xì)胞活化的方法，通過(guò)用CLEC-6特異性抗體 或其片段觸發(fā)樹(shù)突細(xì)胞上的CLEC-6受體并使T細(xì)胞與CLEC-6活化的樹(shù)突
9細(xì)胞接觸來(lái)進(jìn)行，其中T細(xì)胞的活化被增強(qiáng)。所述T細(xì)胞可以是原初CD8 十T纟田胞，而所述樹(shù)突細(xì)胞可以與GM-CSF和IL-4、干擾素a、抗原及其組 合相接觸。發(fā)現(xiàn)由CLEC-6活化的DC激活的T細(xì)胞增強(qiáng)T細(xì)胞分泌的IL-IO、 IL-15,和4-1BBL的表面表達(dá)，及其組合。T細(xì)胞在暴露于用抗CLEC-6特 異性抗體或其片段激活的樹(shù)突細(xì)胞時(shí)也增殖。
本發(fā)明還包括由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的抗CLEC-6免疫球蛋白或其部分和 與免疫球蛋白結(jié)合的抗原。所述抗CLEC-6抗原特異性結(jié)構(gòu)域可以是全長(zhǎng)抗 體、抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、以及Fv片,炎、 以及Fabc片段和/或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的Fab片段。所述抗CLEC-6抗體 還可用于制備疫苗，所述疫苗包含用CLEC-6特異性抗體或其片段活化的樹(shù) 突細(xì)胞。
本發(fā)明還包括單獨(dú)或與共激活劑 一 起結(jié)合(engage)免疫細(xì)胞上的 CLEC-6受體，組合活化抗原呈遞細(xì)胞的試劑用于治療性目的的應(yīng)用；免疫 細(xì)胞上的CLEC-6結(jié)合劑用于制備疫苗的應(yīng)用，該CLEC-6結(jié)合劑與或不與 激活劑一起與一種或多種抗原連^^;抗CLEC-6劑作為免疫細(xì)胞的共激活劑 用于增強(qiáng)通過(guò)免疫細(xì)胞上表達(dá)的除CLEC-6外的細(xì)胞表面受體引起的免疫應(yīng) 答的用途；能夠通過(guò)CLEC-6受體結(jié)合并活化免疫細(xì)胞的抗CLEC-6抗體V 區(qū)序列的用途；和/或與一種或多種毒性劑連接的DC-CLEC-6結(jié)合劑用于 在已知或懷疑由經(jīng)CLEC-6的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)激活導(dǎo)致的疾病的情況下或 在表達(dá)CLEC-6的病理(pathogenic)細(xì)胞或組織的情況下的治療性目的的用 途。
另外一個(gè)實(shí)施方案包括模塊式rAb載體，其包含CLEC-6特異性抗體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)含有粘附蛋白-錨定蛋白結(jié)合對(duì)的一 半的抗原載體結(jié)構(gòu)域連接。所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含抗體的至少一 部分和/或與粘附蛋白-錨定蛋白結(jié)合對(duì)的一半構(gòu)成融合蛋白的抗體的至少 一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述rAb還可包含與抗原結(jié)合的粘附蛋白-錨 定蛋白結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)性一半，其中所述抗原與模塊式rAb載體形成復(fù)合物， 或者與抗原構(gòu)成融合蛋白的粘附蛋白-錨定蛋白結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)性一半。rAb的 抗原特異性結(jié)構(gòu)域可以是全長(zhǎng)抗體、抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab，片 段、F(ab)2片段、以及Fv片段、以及Fabc片段和/或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的 Fab片段。
附圖簡(jiǎn)述
為了更完全的理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)參考發(fā)明詳細(xì)以及附圖進(jìn)行 說(shuō)明，在附圖中

圖1A和1B顯示體內(nèi)和體外培養(yǎng)的DC表達(dá)CLEC-6。圖1A顯示來(lái)自 正常供體的PBMC用抗CDllc、 CD14、 CD19和CD3以及抗CLEC mAb進(jìn) 行染色。對(duì)各個(gè)抗體染色的細(xì)胞作門(mén)以檢測(cè)CLEC-6的表達(dá)水平。圖1B顯 示來(lái)自正常供體的單核細(xì)胞在GM-CSF存在下用IL-4 (IL-4DC)或IFNa (IFNDC)培養(yǎng)，并用抗CLEC-6 mAb或同型對(duì)照抗體染色。C.髓樣DC (Lin-HLA-DR+CDllc+CD123-)是用FACS分選儀從血中純化得到，并用抗 CLEC-6 mAb染色?？盏暮蛯?shí)的柱狀圖代表分別用同型對(duì)照和抗CLEC-6 mAb染色的細(xì)胞。
圖2顯示抗CLEC-6 mAb活化DC。 IFNDC (lxl()5/200ul/孑L)在用不同 mAb克隆包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)18小時(shí)。用Luminex分析培養(yǎng)物上清液以測(cè) 量細(xì)胞因子和趨化因子。
圖3A和3B顯示抗CLEC-6 mAb活化DC。圖3A顯示IL-4DC (lx105/ 孔/200 ul)用抗CLEC-6刺激18小時(shí)，然后細(xì)胞用抗CD86和HLA-DR染色。 圖3B顯示用FACS分選儀從血中純化得到的髓樣DC。 mDC (lxl05"U200 ul) 用抗CLEC-6刺激18小時(shí)，然后細(xì)胞用抗CD86、 CD80和HLA-DR染色。
圖4顯示用抗CLEC-6或?qū)φ誱Ab刺激12小時(shí)的IL-4DC的基因表達(dá) 譜。用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，并用2100 Bioanalyser (Agilent)進(jìn)行 分#斤。用Illuminatotalprep labeling試劑盒(Ambion)制備生物素標(biāo)記的cRNA 靶標(biāo)，并與Sentrix Human6 BeadChips (46K轉(zhuǎn)錄本)雜交。這些孩i陣列由附 著在裝于硅片表面上蝕刻的微孔內(nèi)的50mer寡聚核苷酸探針組成。用鏈霉抗 生物素-Cy3染色后，微陣列表面用Illumina制造的亞微米分辨掃描儀成像 (Beadstation 500X)。數(shù)據(jù)分析采用基因表達(dá)分析軟件程序-GeneSpring， Version 7.1 (Agilent)進(jìn)4亍。
圖5A和5B顯示用抗CLEC-6激活的DC產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子的 量增加。如圖1圖注所述的體外培養(yǎng)的IL-4DC和純化的mDC(lxl05/200ul) 在用抗CLEC-6 mAb (2 ug/孔)包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)18小時(shí)。用Luminex分 析培養(yǎng)物上清液以測(cè)量細(xì)胞因子和趨化因子。
圖6A和6B顯示CLEC-6和CD40協(xié)同激活DC。 IL-4DC (2xl05/200 u1/ 孔)在可溶性CD40L (20 ng/ml)存在或不存在下在抗CLEC-6包被的96孔板 中培養(yǎng)18小時(shí)。對(duì)照mAb也進(jìn)行測(cè)試。18小時(shí)后，用抗CD83染色細(xì)胞， 并用Luminex分析培養(yǎng)物上清液以測(cè)量細(xì)胞因子和趨化因子。
圖7A至7C顯示DC上表達(dá)的CLEC-6導(dǎo)致增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。6天 的GM/IL-4 DC (5xl()3/孔)在用抗CLEC-6或?qū)φ誱Ab包被的96孔板中培養(yǎng) 16-18小時(shí)，然后與用CFSE染色的lx105自體同源的CD19+B細(xì)胞在20單 位/ml IL-2和50 nM CpG存在下共培養(yǎng)。圖7A:第6天細(xì)胞用熒光標(biāo)記抗
ii體染色。CD3+和7-AAD+細(xì)胞被作門(mén)去除(gated out)。 CD38+和CFSE-細(xì)胞用FACS分選儀純化，并進(jìn)行吉姆薩染色。圖7B顯示對(duì)第13天的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行ELISA，以分析總IgM、 IgG和IgA。圖7C顯示在mAb包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)的6天GM/IL-4 DC，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色測(cè)定APRIL的表達(dá)水平。虛線是用對(duì)照的抗體染色的細(xì)胞。細(xì)線和粗線代表分別在用抗CLEC-6和對(duì)照mAb包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表采用每次來(lái)自三個(gè)不同的正常供體的細(xì)胞所進(jìn)行的兩次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。
圖8A和8B顯示B細(xì)胞上表達(dá)的CLEC-6導(dǎo)致B細(xì)胞的活化和免疫球蛋白的產(chǎn)生。圖8A顯示CD19+ B細(xì)胞(2xl()5/孔/200 ul)在mAb包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)16-18小時(shí)，然后用Luminex分析培養(yǎng)物上清液以測(cè)量細(xì)胞因子和趨化因子。圖8B顯示lx105 CD19+ B細(xì)胞在用mAb包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)13天。用ELISA測(cè)量總Ig水平。數(shù)據(jù)代表采用來(lái)自三個(gè)不同的正常供體的細(xì)胞所進(jìn)行的兩次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。
圖9A至9E顯示DC上表達(dá)的CLEC-6導(dǎo)致增強(qiáng)的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。圖9A顯示5xl03的6天IFNDC在用抗CLEC-6或?qū)φ誱Ab包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)16-18小時(shí)，然后與純化的同種異源T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。在收集前用3[H]-胸腺嘧啶脫氧核香，1 uCi/孔進(jìn)行脈沖細(xì)胞18小時(shí)。"H]-胸腺嘧啶脫氧核苷的攝取用(3計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)量。圖9B顯示IL-4DC (5xl0V孔)在100nM Flu Ml肽(HLA-A2表位)(上部?jī)蓚€(gè)圖形)或重組Flu Ml蛋白(下部?jī)蓚€(gè)圖形)存在下在mAb包被的培養(yǎng)板中溫育16小時(shí)。與2xl0"屯化的自體同源CD8 T細(xì)胞共培養(yǎng)7天。第2天在培養(yǎng)物中添加20單位/ml IL-2和10單位/mlIL-7。用抗CD8和FluMl-四聚體染色細(xì)胞。圖9C顯示，IL-4DC (5xl03/孑L)在20 uM Mart-l肽(HLA-A2表位)(上部?jī)蓚€(gè)圖片)或重組Mart-l蛋白(下部?jī)蓚€(gè)圖片)存在下在用mAb包被的培養(yǎng)板中溫育16小時(shí)。與2xl04屯化的自體同源CD8 T細(xì)胞共培養(yǎng)10天。第2天在培養(yǎng)基中添加20單位/ml IL-2和10單位/ml IL-7。用抗CD8和Mart-l-四聚體染色細(xì)胞。圖9D顯示，IL-4DC用10 nM抗CLEC-6-Mart-l復(fù)合物或?qū)φ誌g-Mart-l復(fù)合物負(fù)載2小時(shí)。與2xl06純化的自體同源CD8 T細(xì)胞共培養(yǎng)10天。用抗CD8和Flu Ml特異性四聚體染色細(xì)胞。下部?jī)蓚€(gè)圖片中的細(xì)胞用來(lái)自大腸桿菌(E. coli)的20ng/mlLPS進(jìn)行刺激。圖9E顯示純化的mDC用10 nM抗CLEC-6-Flu HAl或?qū)φ誌g-Flu HAl復(fù)合物負(fù)載2小時(shí)。與2xl 06用CFSE標(biāo)記的純化自體同源CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)7天。用抗CD4染色細(xì)胞，并通過(guò)分析CFSE稀釋測(cè)量細(xì)胞增殖。下部?jī)蓚€(gè)圖片中的細(xì)胞用來(lái)自大腸桿菌的20 ng/ml LPS進(jìn)行刺激。
圖10顯示來(lái)自非人靈長(zhǎng)類(食蟹猴)的PBMC用抗CLEC-6 mAb和細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體染色，并用FACS分析。
12發(fā)明詳述
盡管以下詳細(xì)討論本發(fā)明的多種實(shí)施方案的制備及使用，但是應(yīng)該理解本發(fā)明提供了許多可以在多種特定情況下具體實(shí)施的可應(yīng)用的發(fā)明構(gòu)思。本文討論的特定實(shí)施方案僅僅是說(shuō)明制備和使用本發(fā)明的特定方法，而不限定本發(fā)明的范圍。
為便于理解本發(fā)明，許多術(shù)語(yǔ)定義如下。本文定義的術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)諸如"一個(gè)"、"一種"、"該"等不意欲僅僅指單數(shù)實(shí)體，而是包括其中特定實(shí)例可以用于例證的總的類別。本文術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是它們的用法并不限制本發(fā)明，除非在權(quán)利要求中概述的。
Dectin-l基因簇包括凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX)-l 、 C型凝集素樣受體(CLEC)-1和2,以及MICL。 CLEC-1當(dāng)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中時(shí)胞內(nèi)表達(dá)，因此預(yù)測(cè)需要一些接頭分子用于其表面表達(dá)(M. Colonna等，Eur JImmunol 30 (2000)，第697-704頁(yè))。然而，在它的跨膜部分不含有陽(yáng)離子氨基酸。相反，在其胞質(zhì)部分存在一個(gè)酪氨酸殘基，但是通過(guò)該酪氨酸的信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)是未知的。CLEC-2的胞質(zhì)區(qū)包含一個(gè)DxYxxL (天冬氨酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)基序，并且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面表達(dá)。該基序已知可激勵(lì)有效的胞吞作用和ASGPR-1的基底外側(cè)表達(dá)，并與dectin-l的第二類酪氨酸為基礎(chǔ)的基序高度同源。事實(shí)上，Syk在其配體蛇毒rhodocytin (aggretin)的誘導(dǎo)下被募集到CLEC-2的磷酸酪氨酸(K. Suzuki-Inoue等，Blood 107(2006),第542-549頁(yè))。該研究確認(rèn)了在C型凝集素受體中獨(dú)特的單個(gè)YxxL序列的存在，其在酪氨酸磷酸化時(shí)提供Syk的停泊位點(diǎn)。MICL (CLEC12A)被確定為與dectin畫(huà)l和LOX-l同源的含ITIM分子(A.S. Marshall等,J BiolChem 279 P004),第14792-14802頁(yè))。它的表達(dá)基本上局限在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和未成熟DC。功能上，MICL在受到刺激時(shí)募集SHP-1和2，并且用含胞質(zhì)MICL的嵌合受體觀察到ITIM依賴性抑制效應(yīng)(A.S. Marshall等，JBiol Chem 279 (2004)，第14792-14802頁(yè))。然而，最近報(bào)道，在MICL連接到未成熟DC上時(shí)，觀察到改變的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化形式，以及p38 MAPK和ERK的絲氨S交磷酸化，而且注意到CCR7的表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生而沒(méi)有成熟標(biāo)記物如CD83、 86和DC-LAMP的上調(diào)(C.H. Chen等,Blood 107(2006)、第1459-1467頁(yè))。確實(shí)，如CCR7+共刺激低半成熟表型(costimulatkmlow semi-mature phenotype)被認(rèn)為代表穩(wěn)定狀態(tài)的遷移DC (L. Ohl等，Imunity21 (2004)，第279-288頁(yè))。雖然還沒(méi)有表征，但是CLEC9A和CLEC12B編碼基因也定位在dectin-l基因蔟中(G.D. Brown, Nat Rev Immunol 6 (2006),第33~43頁(yè))。CLEC12B的胞質(zhì)尾區(qū)含有ITIM，而CLEC9A具有ExYxxL (谷胺酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)序列，其可能起到激活基序的作用。這些分子的功能仍然需要進(jìn)一步研究。
Arce等，Eur. J. Immunol. (2004)鑒定并表征了與小鼠Mcl/Clecsf8相關(guān)的人CLEC-6蛋白。人CLEC-6編碼了有215個(gè)氨基酸的II型膜糖蛋白，其屬于人4丐依賴性凝集素家族(C型凝集素)。CLEC-6的胞外區(qū)具有單個(gè)的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)。對(duì)CLEC-6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生化分析表明30kDa的糖蛋白和所述受體的交聯(lián)導(dǎo)致迅速內(nèi)在化，提示CLEC-6是胞內(nèi)受體(Arce等，2004)。不同于CLEC-1、 -2、隱9A、畫(huà)12A和-12B, CLEC隱6不含有YxxL基序或其它共有的信號(hào)傳導(dǎo)基序。還沒(méi)有進(jìn)行研究以表征CLEC-6的生物功能。
DC 能夠交叉呈遞蛋白抗原(Rock KL Immunol Rev. 2005Oct;207:166-83)。在體內(nèi)，DC通過(guò)許多受體來(lái)攝取抗原，并呈遞I和II類形式的抗原肽。在本文中，DC凝集素作為模式識(shí)別受體有助于抗原的有效攝取以及抗原的交叉呈遞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"模塊式rAb載體"用于描述重組抗體系統(tǒng)，該系統(tǒng)被工程化以提供不同的抗原、活化蛋白質(zhì)或其它抗體以受控的模塊式方式加入單一重組單克隆抗體(mAb),在本案中，抗CLEC-6單克隆抗體。rAb可以是使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)、重組抗體展示、人源化單克隆抗體等制備的單克隆抗體。才莫塊式rAb載體可用于，例如，(通過(guò)一種針對(duì)例如人樹(shù)突細(xì)胞受體的內(nèi)在化受體的原發(fā)重組抗體)耙向多個(gè)抗原和/或抗原與活化的細(xì)胞因子至樹(shù)突細(xì)胞(DC)。；漠塊式rAb載體還可以用于以受控且確定的方式首尾相連地連接兩種不同的重組mAb。
"模塊式rAb載體"的抗原結(jié)合部分可以是一種或多種可變結(jié)構(gòu)域、 一種或多種可變結(jié)構(gòu)域與第一恒定結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab片段、Fab'片段、F(ab)2片段和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的Fab片段，同源的模塊式結(jié)合部分添加到氨基酸序列和/或與其結(jié)合。模塊式rAb載體中使用的抗體可以是任何同型或類別、亞類或者來(lái)自任何來(lái)源(動(dòng)物和/或重組體)。
在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，模塊式rAb載體#:工程化為具有一種或多種模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，用于制備在工程化的重組mAb情況下的特異且明確的蛋白質(zhì)復(fù)合物。mAb是包括一種或多種來(lái)自mAb的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域羧基的融合蛋白的一部分。粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域甚至可以在翻譯后，例如使用化學(xué)交聯(lián)劑和/或二硫鍵連接。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗原"指的是可以在該抗原的接受者中啟動(dòng)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子?？乖梢杂糜诒景l(fā)明的兩種不同情況中作為抗體或
14rAb的其它抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)或者作為分子，該分子通過(guò)模塊式rAb載體的錨定蛋白/粘附蛋白-分子補(bǔ)體的一部分的rAb運(yùn)送到和/或進(jìn)入細(xì)胞或目標(biāo)?？乖ǔＪ且鸺膊〉脑噭?，對(duì)于該疾病，疫苗接種可能是有益的治療。當(dāng)抗原被呈遞在MHC上時(shí)，該肽通常是約8到約25個(gè)氨基酸?？乖ㄈ魏晤愋偷纳锓肿?，包括，例如，簡(jiǎn)單的中間代謝物、糖、脂質(zhì)和激素以及大分子諸如復(fù)合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白質(zhì)?？乖某Ｒ?jiàn)種類包括但不限于病毒抗原，細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動(dòng)物及其他寄生蟲(chóng)抗原，腫瘤抗原，自身免疫性疾病、過(guò)敏癥和移植排斥中涉及的抗原，及其他各種抗原。模塊式rAb載體能夠運(yùn)載許多活化劑，例如抗生素、抗感染藥、抗病毒藥、抗腫瘤藥、解熱藥、鎮(zhèn)痛藥、抗炎藥、骨質(zhì)疏+〉癥的治療劑、酶、細(xì)胞因子、抗凝血藥、多糖、膠原、細(xì)胞及兩種或更多前述活化劑的組合。使用本發(fā)明遞送的抗生素的實(shí)例無(wú)限制地包括四環(huán)素、氨基糖苷類、青霉素、頭孢菌素、磺胺類藥物、氯霉素琥珀酸鈉、紅霉素、萬(wàn)古霉素、林可霉素、克林霉素、制霉菌素、兩性霉素B、金剛烷胺、碘苷、對(duì)氨基水楊酸、異煙肼、利福平、放線菌素D、光輝霉素、道諾霉素、阿霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、曱基芐肼、咪唑曱酰胺等等。
使用本發(fā)明遞送的抗肺瘤藥的實(shí)例無(wú)限制地包括阿霉素、柔紅菌素、紫杉醇、氨曱喋呤等等。解熱藥和鎮(zhèn)痛藥的實(shí)例包括阿司匹林、美林(Motrin⑧)布洛芬(Ibuprofen⑧)、萘普生、醋氨酚等等。
使用本發(fā)明遞送的抗炎藥的實(shí)例無(wú)限制地包括NSAIDS、阿司匹林、甾族化合物、地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、雙氯芬酸鈉等等。
使用本發(fā)明遞送的治療骨質(zhì)疏松癥的治療劑和作用于骨和骨骼的其它因子的實(shí)例無(wú)限制地包括釣，阿侖膦酸鹽，骨GLa肽，曱狀旁腺激素及其活性片段，組蛋白H4相關(guān)骨形成和增殖肽及其突變體、衍生物和類似物。
使用本發(fā)明遞送的酶和酶輔因子的實(shí)例無(wú)限制地包括胰酶(pancrease)、L-天冬酰胺酶、透明質(zhì)酸酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、鏈激酶、尿激酶、胰酶制劑、膠原酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、血纖維蛋白溶酶原、鏈激酶、腺苷酸環(huán)化酶、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)等等。
因子(TGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(F:F)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),表皮生長(zhǎng)因子(EGF),結(jié)締組織活化肽(CTAP)，成骨因子及這些生長(zhǎng)因子的生物活性類似物、片段和衍生物。細(xì)胞因子可以是B/T細(xì)胞分化因子、B/T細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促有絲分裂細(xì)胞因子、趨化細(xì)胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、IFN-a、 IFN-卩、IFN畫(huà)y、 IL1 、 IL2、 IL3、 IL4、 IL5、 IL6、 IL7、 IL8、IL9、 ILIO、 ILll、 IL12、 IL13、 IL14、 IL15、 IL16、 IL17、 IL18等、瘦素、
15肌肉生長(zhǎng)抑制素、巨噬細(xì)胞刺激蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、TNF-a、 TNF-卩、 NGF、 CD40L、 CD137L/4-lBBL、人淋巴毒素-卩、G-CSF、 M隱CSF、 GM誦CSF、 PDGF、 IL-la、 ILl-卩、IP-IO、 PF4、 GRO、 9E3、促紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮抑 素、血管抑素、VEGF或其任何片段或組合。其它細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子(TGF)超基因家族成員，包括卩轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(例如TGF-pi、 TGF-P2、 TGF-卩3);骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(例如，BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(例如成纖維細(xì)月包生 長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣 生長(zhǎng)因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A、抑制素B);生長(zhǎng)分化因子(例如， GDF-1);以及活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。
來(lái)源諸如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離的，或可以合成地制備諸如通過(guò)重組DNA技 術(shù)或通過(guò)多種化學(xué)方法制備的生長(zhǎng)因子。此外，可以使用這些因子的類似物、 片>^殳或;^汙生物，只要它們顯示天然分子的至少一些生物活性。例如，可以通 過(guò)表達(dá)位點(diǎn)特異性突變或其它遺傳工程技術(shù)改變的基因來(lái)制備類似物。
使用本發(fā)明遞送的抗凝血藥的實(shí)例無(wú)限制地包括華法林、肝素、水蛭素 等等。使用本發(fā)明遞送的作用于免疫系統(tǒng)的因子的實(shí)例無(wú)限制地包括控制炎 癥和惡性贅生物的因子以及攻擊感染性微生物的因子，諸如趨化肽和緩激 肽。
病毒抗原的實(shí)例包括但不限于，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原，諸如來(lái)自人免 疫缺陷病毒(HIV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原，諸如gag、 pol和env基因的基因產(chǎn)物， Nef蛋白，逆轉(zhuǎn)錄酶及其他HIV元件；肝炎病毒抗原，諸如乙型肝炎病毒的 S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒和其它肝炎例如曱、乙和丙型肝炎病毒的pre-S 抗原，病毒元件諸如丙型肝炎病毒RNA;流感病毒抗原，諸如血球凝集素 和神經(jīng)氨酸酶及其他流感病毒元件；麻滲病毒抗原，諸如麻滲病毒融合蛋白 及其他麻滲病毒元件；風(fēng)滲病毒抗原，諸如蛋白El和E2及其他風(fēng)滲病毒元 件；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc及其他輪狀病毒元件；巨細(xì)胞病毒抗原，諸 如包膜糖蛋白B及其他巨細(xì)胞病毒抗原元件；呼吸道合胞體病毒抗原，諸如 RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道合胞體病毒抗原元件；單純性皰發(fā)病 毒抗原，諸如立即早期蛋白質(zhì)、糖蛋白D及其他單純性皰滲病毒抗原元件； 水痘帶狀皰滲病毒抗原，諸如gpl、 gpll及其他水痘帶狀皰滲病毒抗原元件； 日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS1、 NS1-NS2A、 80% E及其他日本腦炎病毒抗原元件；狂犬病病毒抗原，諸如狂犬病糖蛋白、狂 犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原元件。關(guān)于病毒抗原的其他實(shí)例，參見(jiàn)
16Fundamental Virology,第二版，編著Fields, B. N.和Knipe， D. M.(Raven Press, New York, 1991)。
可以使用本發(fā)明的rAb-DC/DC-抗原疫苗遞送的抗原目標(biāo)包括編碼抗原 諸如病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生蟲(chóng)抗原的基因。病毒包括微小核 jf唐4t酸病毒、冠^l夫病毒、4皮蓋病毒、黃病毒、才iM犬病毒、副粘病毒、正粘病 毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸^瓜病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小 病毒、皰滲病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海綿狀病毒。其它病毒目標(biāo)包 括流感、單純皰滲病毒1和2、麻滲、登革熱、天花、脊髓灰質(zhì)炎或HIV。 病原體包括錐蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、瘧疾。腫瘤標(biāo)記物諸如胚胎抗原或前 列腺特異性抗原可以以這個(gè)方法靶向。其它實(shí)例包括HIVenv蛋白和乙型 肝炎表面抗原。根據(jù)本發(fā)明用于疫苗接種目的的載體的給予可能要求載體結(jié) 合的抗原是足夠非免疫原性的以使得轉(zhuǎn)基因能夠長(zhǎng)期表達(dá)，對(duì)此可期望強(qiáng)烈 的免疫應(yīng)答。在一些情況下，個(gè)體的疫苗接種可僅是不經(jīng)常地需要，諸如每 年或每?jī)赡暌淮?，并提供?duì)傳染物的長(zhǎng)期免疫保護(hù)。本發(fā)明用于載體中并最 終作為抗原的生物體、過(guò)敏原及核酸和氨基酸序列的特定實(shí)例可以在美國(guó)專 利6,541,011中找到，該專利的相關(guān)部分引入本文作為參考，尤其是可以用 于本發(fā)明的匹配生物體和特定序列的表格。
用于本文公開(kāi)的rAb疫苗的細(xì)菌抗原包括但不限于，例如，細(xì)菌抗原， 諸如百日咳毒素、絲狀血球凝集素、百日咳桿菌粘附素、FIM2、 FIM3、腺 香酸環(huán)化酶及其他百日咳細(xì)菌抗原元件；白喉細(xì)菌抗原，諸如白喉毒素或類 毒素及其他白喉細(xì)菌抗原元件；破傷風(fēng)細(xì)菌抗原，諸如破傷風(fēng)毒素或類毒素 及其他破傷風(fēng)細(xì)菌抗原元件；鏈球菌細(xì)菌抗原，諸如M蛋白及其他鏈球菌 細(xì)菌抗原元件；革蘭氏陰性桿菌細(xì)菌抗原，諸如脂多糖及其他革蘭氏陰性細(xì) 菌抗原元件；結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌抗原，諸如霉菌酸、熱休克蛋白65(HSP65)、 30 kDa主要分泌性蛋白、抗原85A及其他分枝桿菌抗原元件；幽門(mén)螺桿菌 細(xì)菌抗原元件；肺炎球菌細(xì)菌抗原，諸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多 糖及其他肺炎球菌細(xì)菌抗原元件；流感嗜血桿菌細(xì)菌抗原，諸如莢膜多糖及 其他流感嗜血桿菌細(xì)菌抗原元件；炭疽細(xì)菌抗原，諸如炭疽保護(hù)性抗原及其 他炭疽細(xì)菌抗原元件；立克次氏體細(xì)菌抗原，諸如rompA及其他立克次氏 體細(xì)菌抗原元件。本文描述的細(xì)菌抗原還包括任何其它細(xì)菌、分枝桿菌、支 原體、立克次體或衣原體抗原。部分或完整的病原體還可以是流感嗜血桿 菌；鐮狀癥原蟲(chóng)；腦膜炎奈瑟氏球菌；肺炎鏈球菌；淋病奈瑟氏菌；傷寒沙 門(mén)氏菌血清型；志賀氏菌；霍亂弧菌；登革熱；腦炎；日本腦炎；萊姆??； 鼠疫耶爾森氏菌；西尼羅河病毒；黃熱病；兔熱病；肝炎(病毒性；細(xì)菌性)；RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV1和HPIV3;腺病毒；天花；過(guò)敏物和癌癥物 質(zhì)。
用于本發(fā)明的組合物和方法的真菌抗原包括但不限于，例如，念珠菌屬 真菌抗原元件；組織胞漿菌屬真菌抗原，諸如熱休克蛋白60(HSP60)及其他 組織胞漿菌屬真菌抗原元件；隱球菌真菌抗原，諸如莢膜多糖及其他隱球菌 真菌抗原元件；球孢子菌真菌抗原，諸如小球體抗原及其他球孢子菌真菌抗 原元件；以及癬真菌抗原，諸如發(fā)褲菌素及其他球孢子菌真菌抗原元件。
原生動(dòng)物及其他寄生蟲(chóng)抗原的實(shí)例包括但不限于，例如，惡性癡原蟲(chóng)抗 原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環(huán)子孢子抗原、配子母細(xì)胞/ 配子表面抗原、紅內(nèi)期抗原pf 155/RESA及其他痗原蟲(chóng)抗原元件；弓形體屬 抗原，諸如SAG-1、 p30及其他弓形體屬抗原元件；血吸蟲(chóng)屬抗原，諸如谷 胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶、副肌球蛋白及其他血吸蟲(chóng)屬抗原元件；利什曼原蟲(chóng)主要及 其他利什曼原蟲(chóng)抗原，諸如gp63、磷脂聚糖及與其相關(guān)的蛋白質(zhì)及其他利什 曼原蟲(chóng)抗原元件；以及克氏錐蟲(chóng)抗原，諸如75-77 kDa抗原、56kDa抗原及 其他錐蟲(chóng)抗原元件。
可以使用本發(fā)明的rAb靶向的抗原通常基于許多因素選擇，所述因素包 括內(nèi)在化的可能性、免疫細(xì)胞特異性的水平、耙向的免疫細(xì)胞種類、免疫 細(xì)胞成熟的水平和/或活化等等。用于樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物的實(shí)例包括 但不限于，MHCI類、MHCII類、B7陽(yáng)2、 CD18、 CD29、 CD31、 CD43、 CD44、 CD45、 CD54、 CD58、 CD83、 CD86、 CMRF-44、 CMRF-56、 DCIR和/或 DECTIN-1等等；而在一些情況下還缺失CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD 19、 CD20、 CD56和/或CD57。抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞表 面標(biāo)記物的實(shí)例包括^f旦不限于，MHCI類、MHCII類、CD40、 CD45、 B7-l、 B7-2、 IFN-y受體及IL-2受體、ICAM-1和/或Fcy受體。用于T細(xì)胞的細(xì)胞 表面標(biāo)記物的實(shí)例包括但不限于，CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD20、 CDllb、 CD16、 CD45和HLA-DR。
用于遞送的細(xì)胞表面上的目標(biāo)抗原包括通常來(lái)源于腫瘤組織細(xì)胞的細(xì) 胞表面、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等的腫瘤抗原特征性的那些抗原。用于本 發(fā)明的抗體部分的腫瘤目標(biāo)的實(shí)例無(wú)限制地包括血液癌諸如白血病和淋巴 瘤；神經(jīng)腫瘤諸如星形細(xì)胞瘤或惡性膠質(zhì)瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭和 頸癌；胃腸腫瘤諸如胃或結(jié)腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖器腫瘤如宮頸、 子宮、卵巢癌，陰道癌，睪丸癌，前列腺癌或陰莖癌；骨胂瘤；血管肺瘤； 或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直腸、膽嚢、膽道、喉、肺和支氣管、膀胱、 腎、腦及神經(jīng)系統(tǒng)的其他部分、曱狀腺的癌癥；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋 巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤和白血病。實(shí)例包括腫瘤蛋白，例如突變的癌基因；與腫瘤相關(guān)的病毒蛋白；以及腫瘤 粘蛋白和糖脂?？乖梢允桥c腫瘤相關(guān)的病毒蛋白，其可以是來(lái)自上文指出 的各類別病毒的病毒蛋白。某些抗原可以是腫瘤特征性的(一個(gè)亞集，是腫 瘤前體細(xì)胞通常不表達(dá)的蛋白質(zhì))，或者可以是肺瘤前體細(xì)胞中通常表達(dá)的 蛋白質(zhì)，但是具有腫瘤特征性的突變。其它抗原包括具有改變的活性或亞細(xì) 胞分布的正常蛋白質(zhì)的突變型變體，例如，產(chǎn)生腫瘤抗原的基因突變。
腫瘤抗原的特定的非限制性實(shí)例包括CEA,前列腺特異性抗原(PSA), HER-2/neu， BAGE， GAGE, MAGE 1-4、 6和12, MUC(粘蛋白)(例如MUC匿1 、 MUC-2等)，GM2和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，ras, myc，酪氨酸酶，MART(黑色 素瘤抗原)，Pmel 17(gpl00), GnT-V內(nèi)含子V序列(N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶 V內(nèi)含子V序列)，前列腺Capsm， PRAME(黑色素瘤抗原)，p-連環(huán)蛋白， MUM-1-B(黑色素瘤遍在突變基因產(chǎn)物)，GAGE(黑色素瘤抗原)l， BAGE(黑 色素瘤抗原)2-10， c-ERB2(Her2/neu), EBNA(EB病毒核抗原)1-6, gp75,人 乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7， p53,肺抗性蛋白(LRP)， Bcl-2，以及Ki-67。此 外，免疫原性分子可以是自身免疫性疾病的起始和/或進(jìn)展中涉及的自身抗 原，該自身免疫性疾病的病理學(xué)主要是由于相關(guān)目標(biāo)器官、組織或細(xì)胞表達(dá) 的分子特異性的抗體的活性所引起，例如SLE或MG。在這些疾病中，可能 期望將進(jìn)行中的針對(duì)相關(guān)自身抗原的抗體介導(dǎo)的(即Th2型)免疫應(yīng)答指向細(xì) 胞(即Thl型)免疫應(yīng)答?；蛘?，可能期望在沒(méi)有感染，但是疑似易感染相關(guān) 自身免疫性疾病的受試者中通過(guò)預(yù)防性誘導(dǎo)針對(duì)適當(dāng)?shù)淖陨砜乖腡hl反 應(yīng)來(lái)防止針對(duì)自身抗原的Th2反應(yīng)的起始或降低其水平。目標(biāo)自身抗原無(wú)限 制地包括(a)對(duì)于SLE, Smith蛋白、RNP核糖核蛋白、及SS-A和SS-B蛋 白；以及(b)對(duì)于MG,乙酰膽堿受體的抗原。在一種或多種類型的自身免疫 應(yīng)答中涉及的其它各種抗原的實(shí)例包括，例如，內(nèi)源性激素，諸如黃體生成 素、卯泡刺激素、睪丸激素、生長(zhǎng)激素、催乳素及其他激素。
在自身免疫疾病、過(guò)敏癥和移植排斥中涉及的抗原可被用于本發(fā)明的組 合物和方法。例如，在任何一種或多種下列自身免疫疾病或障礙中涉及的抗 原可被用于本發(fā)明糖尿病(diabetes、 diabetes mellitus)，關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎)，多發(fā)性硬 化，重癥肌無(wú)力，系統(tǒng)性紅斑狼瘉，自身免疫性甲狀腺炎，皮炎(包括特應(yīng) 性皮炎和濕滲性皮炎)，銀屑病，斯耶格倫氏綜合征，包括繼發(fā)于斯耶格倫 氏綜合征的干燥性角膜結(jié)膜炎，斑禿，由于節(jié)肢動(dòng)物叮咬反應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)， 克羅恩氏病，口瘠性潰瘍，虹膜炎，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，潰瘍性結(jié)腸炎， 哞喘，過(guò)敏性哮喘，皮膚紅斑狼瘡，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥滲，麻瘋
19病逆向反應(yīng)，麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑，自身免疫性葡萄膜炎，過(guò)敏性腦脊髓炎，急 性壞死性出血性腦病，特發(fā)性雙側(cè)累進(jìn)性感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力喪失，再生障礙性 貧血，單純性紅細(xì)胞貧血，特發(fā)性血小板減少，多軟骨炎，韋格納氏肉芽胂 病，慢性活動(dòng)型肝炎，斯-約二氏綜合征，自發(fā)性口炎性腹瀉，扁平莒癬， 克羅恩氏病，格雷夫斯眼病，結(jié)節(jié)病，原發(fā)性膽汁性肝硬化，后葡萄膜炎和 間質(zhì)性肺纖維化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的實(shí)例包括谷氨酸脫羧酶
65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂蛋白脂質(zhì)蛋白、乙酰膽堿 受體元件、曱狀腺球蛋白和促曱狀腺激素(TSH)受體。在過(guò)敏癥中涉及的抗 原的實(shí)例包括花粉抗原諸如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麥草花粉 抗原，動(dòng)物來(lái)源的抗原諸如灰塵螨抗原和貓科抗原，組織相容性抗原和青霉 素及其他治療性藥物。在移植排斥中涉及的抗原的實(shí)例包括移植入移植物接 受者的移植， 抗原性元件，諸如心臟:，肺、肝臟、,胰、腎和神經(jīng)的移植物
如同本文使用的，術(shù)語(yǔ)"表位"指的是包括與位于由病原體DNA或RNA 編碼的多種病原體多肽之任何一種中的表位相似的一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的 肽或蛋白質(zhì)抗原。相似性的水平通常達(dá)到這樣的程度，即針對(duì)上述多肽的單 克隆或多克隆抗體也會(huì)與該肽或蛋白質(zhì)抗原結(jié)合、反應(yīng)或識(shí)別該肽或蛋白質(zhì) 抗原。多種免疫測(cè)定方法可以和上述抗體一起使用，例如蛋白質(zhì)印跡法、 ELISA、 RIA等，所有這些都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。適于在疫苗中使用的 病原體表位和/或它們的功能等價(jià)物的鑒定是本發(fā)明的一部分。 一旦分離和鑒 定，可以容易地獲得功能等價(jià)物。例如，可以使用如美國(guó)專利號(hào)4,554,101 中講授的Hopp的方法，其教導(dǎo)根據(jù)親水性從氨基酸序列鑒定和制備表位， 該文獻(xiàn)引入本文作為參考。其它一些論文中描述的方法及基于其的軟件程序 也可以用于鑒定表位核心序列(參見(jiàn)，例如，Jameson和Wolf， 1988; Wolf 等，1988;美國(guó)專利號(hào)4,554,101)。然后可以容易地通過(guò)運(yùn)用肽合成或重組 技術(shù)把這些"表位核心序列"的氨基酸序列引入肽中。
制備;注射劑，為液體溶液或懸浮液、；也可以制備適于在注射之;溶解或懸 浮于液體中的固體形式?？梢园阎苿┤榛?，包封在脂質(zhì)體中。通常把活性免 疫原性成分與藥學(xué)上可接受并與活性成分相容的載體混合。
術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"指的是在給予的受試者中不引起過(guò)敏反應(yīng) 或其它副作用的載體。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、 磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。此外， 如果需要，疫苗可以包含少量的輔助性物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕或乳化劑、pH緩沖 劑和/或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。可能有效的佐劑的實(shí)例包括但不限于氬氧化
20鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、 MTP-PE和RIBI,其包含在2。/。鯊烯/Tween 80乳劑 中的三種細(xì)菌提取成分，單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架 (MPL+TDM+CWS)。佐劑的其它實(shí)例包括DDA (溴化二甲基雙十八烷基銨)、 弗氏完全和不完全佐劑以及QuilA。此外，免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，諸如淋巴因子(例 如，IFN-y、 IL-2和IL-12)或合成的IFN-y誘導(dǎo)物(諸如聚I:C)可以和本文描 述的佐劑聯(lián)合使用。
如本發(fā)明所描述的，藥品可以包括具有單一或多拷貝的特定核苷酸序列 的棵多核苷酸，該特定核苷酸序列與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定 DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。多核普酸可以編碼生物活性肽、反義RNA或核酶并以 生理學(xué)上可接受的可給藥形式提供。可來(lái)自本發(fā)明的另一種藥品以生理學(xué)上 可接受的可給藥形式包括根據(jù)本文描述的方法從患者血液或其它來(lái)源分離 的高度純化的血漿脂蛋白部分和預(yù)先結(jié)合到純化的脂蛋白部分的、包含與存 在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的單一或多拷貝的 特定核苷酸序列的多核苷酸。
另一種藥品以生理學(xué)上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋 白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結(jié)合基序的 重組載脂蛋白片段，其預(yù)先結(jié)合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多 核苷酸上。另一種藥品以生理學(xué)上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿 脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結(jié)合基 序的重組載脂蛋白片段，其預(yù)先結(jié)合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列 的多核苷酸上。
給藥劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態(tài)以 及給藥途徑和治療頻率。包括預(yù)先結(jié)合到高度純化的脂蛋白部分的棵多核苷 酸的藥物組合物可以按1嗎到1 mg多核苷酸和1 )ig到100 mg蛋白質(zhì)的量 給藥。
rAb和rAb復(fù)合物給予患者可以遵循用于化學(xué)療法給藥的一般方案，如 果有的話，考慮載體的毒性。預(yù)料根據(jù)需要重復(fù)治療周期。還考慮，多種標(biāo) 準(zhǔn)治療以及外科干預(yù)可以與所述的基因治療聯(lián)合施用。
在考慮基因治療臨床應(yīng)用的情況下，需要制備復(fù)合物作為適于目的應(yīng)用 的藥物組合物。通常這需要制備基本上不含熱原以及任何其它對(duì)人或動(dòng)物有 害的雜質(zhì)的藥物組合物。通常還期望使用適當(dāng)?shù)柠}和緩沖液以使復(fù)合物穩(wěn)定 和允許復(fù)合物被目標(biāo)細(xì)胞纟聶取。
本發(fā)明的水性組合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在藥學(xué)上 可接受的載體或水介質(zhì)中。這些組合物也可以稱作接種物。用于藥物活性物
21質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用在本領(lǐng)域中為大家所熟知。任何常規(guī)介質(zhì)或試劑除非 與活性成分不相容，否則其在治療組合物中的使用被考慮。補(bǔ)充性活性成分 也可以加入組合物中。本發(fā)明的組合物可以包4舌典型的藥物制劑。也可以在 甘油、液體聚乙二醇及其混合物中和在油類中制備分散體。在通常的儲(chǔ)存和 使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
疾病狀態(tài)。取決于要治療的特定疾病，根據(jù)本發(fā)明的治療組合物的給予 可以經(jīng)任何常規(guī)途徑進(jìn)行，只要經(jīng)該途徑可達(dá)到目標(biāo)組織以使最大化遞送抗 原到位點(diǎn)來(lái)達(dá)到最大的(或在一些情況下最小的)免疫應(yīng)答。通?？梢越?jīng)原位、
皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射給藥。遞送的其它部位包括口、 鼻、頰、直腸、陰道或局部的。局部給藥對(duì)于皮膚癌的治療可能是特別有益 的。所述組合物通常作為包括生理學(xué)上可接受的載體、緩沖液或其它賦形劑 的藥學(xué)上可接受的組合物給藥。
本發(fā)明的疫苗或治療組合物可以經(jīng)注射胃腸外例如皮下或肌內(nèi)妾會(huì)予。適 于其它給藥方式的另外的制劑包括栓劑，以及在一些情況下口服制劑或適于 分配的制劑如氣霧劑。對(duì)于口服制劑，使用佐劑的T細(xì)胞亞型操作，抗原包 裝或添加單獨(dú)的細(xì)胞因子到多種制劑中產(chǎn)生具有最佳化免疫應(yīng)答的改良口 服疫苗。對(duì)于栓劑，常規(guī)的粘合劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或 甘油三脂；這些栓劑可以由包含0.5%到10%，優(yōu)選1%-2%范圍內(nèi)的活性成 分的混合物形成?？诜苿┌ㄍǔＪ褂玫馁x形劑，例如藥物級(jí)的甘露糖醇、 乳糖、淀粉硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳S臾鎂等。這些組合物釆取溶液、 懸浮液、片劑、丸劑、膠嚢、緩釋制劑或散劑的形式并且包含10%-95%的活 性成分，優(yōu)選25-70%。
本發(fā)明的編碼抗原的核酸可以作為中性的或鹽的形式配制入疫苗或治 療組合物中。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成的)，其 為與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或與有機(jī)酸諸如醋酸、草酸、酒石酸、馬來(lái)酸等 形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以源自于無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氫氧化銨、氫氧化4丐或氫氧化鐵和有機(jī)堿諸如異丙胺、三曱胺、2-乙氨 基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
疫苗或治療組合物以與給藥制劑相容的方式，以及以預(yù)防和/或治療有效 的量給予。要給予的量取決于要治療的受試者，包括例如受試者的免疫系統(tǒng) 對(duì)合成抗體的容量，以及期望保護(hù)或治療的程度。合適的劑量范圍為每次疫 苗接種具有約幾百微克級(jí)的活性成分，范圍為約0.1 mg到1000mg，諸如約 1 mg到300 mg的范圍，以及優(yōu)選約10 mg到50 mg的范圍。合適的初始給 藥和強(qiáng)化注射方案也是變化的，但是典型的是初始給藥然后是后續(xù)的接種或 其他給藥。給藥要求的活性成分的精確量取決于醫(yī)師的判斷且可能為每個(gè)受試者所特有。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，本發(fā)明的核酸分子或融合多肽的治療有 效量尤其取決于給藥方案，給藥抗原的單位劑量，核酸分子或融合多肽是否 和其它治療劑聯(lián)合給藥，接受者的免疫狀態(tài)和健康狀態(tài)，以及特定核酸分子 或融合多肽的治療活性。
組合物可以以單一劑量方案或以多次劑量方案提供。多次劑量方案中疫 苗接種的初始時(shí)程可以包括，例如1-10個(gè)單獨(dú)的劑量，隨后在以維持和或
加強(qiáng)免疫應(yīng)答要求的后續(xù)時(shí)間間隔給予其它劑量，例如在l-4個(gè)月給予第二 劑量，以及如果需要在數(shù)月之后給予后續(xù)劑量。需要每隔l-5年，通常3年 的定期加強(qiáng)劑量來(lái)維持需要的保護(hù)性免疫水平。免疫時(shí)程可以繼之以與 ESAT6或ST-CF共培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的體外增殖測(cè)定，以及測(cè)量 致敏淋巴細(xì)胞釋放的IFN-y水平。可以使用常規(guī)的標(biāo)記物諸如放射性同位素、 酶、熒光標(biāo)記物等進(jìn)行測(cè)定。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且可以在美 國(guó)專利號(hào)3,791,932、 4,174,384和3,949,064中找到,這些文獻(xiàn)的相關(guān)部分通 過(guò)引用并入本文。
模塊式rAb載體和/或結(jié)合的rAb載體-(粘附蛋白/錨定蛋白和/或錨定 蛋白-粘附蛋白)-抗原復(fù)合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以 一種或多種"單位 劑量"提供，這取決于是否使用核酸載體，最終純化的蛋白質(zhì)，或使用的最 終的疫苗形式。把單位劑量定義為包含計(jì)算以產(chǎn)生與該治療組合物給藥即適 當(dāng)?shù)耐緩胶椭委煼绞较嚓P(guān)的期望反應(yīng)的預(yù)定量的治療組合物。給藥量以及特 定的途徑和制劑在臨床領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。還可以評(píng)估待治療的受試 者，尤其是，受試者免疫系統(tǒng)的狀態(tài)和需要的保護(hù)。單位劑量不需要以單一 注射給藥，而是可以包括經(jīng)設(shè)定的一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)輸注。本發(fā)明的單位劑 量可以方便地用DNA/kg(或蛋白質(zhì)/Kg)體重來(lái)描述，以約0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25、 0.5、 1、 10、 50、 100、 1,000或更多mg/DNA或蛋白質(zhì)/kg體重 的范圍給藥。同樣地，遞送的rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以從約0.2到約 8.0mg/kg體重變化。因此，在特定實(shí)施方案中，可以把0.4mg、 0.5 mg、 0.8 mg、 1.0 mg、 1.5 mg、 2.0 mg、 2.5 mg、 3.0 mg、 4.0 mg、 5.0 mg、 5.5 mg、 6.0 mg、6.5 mg、 7.0 mg和7.5 mg的疫苗遞送到個(gè)體體內(nèi)。給藥的rAb-DC/DC-抗原疫苗的劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態(tài) 以及給藥途徑和治療頻率。包括預(yù)先結(jié)合到脂質(zhì)體或病毒遞送載體上的棵多 核苷酸的藥物組合物可以按從l嗎到lmg多核普酸到lpg到100mg蛋白質(zhì) 的量給藥。因此，特定組合物可以包括在約1昭、5 pg、 10 jig、 20昭、30嗎、 40(xg、 50(ig、 60|ig、 70嗎、80嗎、100嗎、150 (ig、 200昭、250嗎、500 嗎、600昭、700 )ig、 800嗎、900 (ig或1,000 jig之間的多核苷酸或蛋白質(zhì)， 該多核苷酸或蛋白質(zhì)獨(dú)立地與1 pg、 5pg、 lOjxg、 20jig、 3.0 pg、 40jig、 50
23(ig、 60 fig、 70 (ig、 80嗎、100 (ig、 150昭、200昭、250嗎、500 pg、 600 [ig、 700嗎、800 |ig、 900嗎、1 mg、 1.5 mg、 5 mg、 10 mg、 20 mg、 30 mg、 40 mg、 50mg、 60mg、 70 mg、 80 mg、 90 mg或100 mg載體結(jié)合。
在體外細(xì)胞系統(tǒng)中測(cè)試本發(fā)明，該體外細(xì)胞系統(tǒng)測(cè)量Flu抗原耙向的樹(shù) 突細(xì)胞對(duì)人Flu特異性T細(xì)胞的免疫刺激。本文顯示的結(jié)果證明在該系統(tǒng)中 單獨(dú)使用無(wú)效的抗原劑量下這些抗原特異性細(xì)胞的特異性擴(kuò)增。
本發(fā)明還可以用于制備模塊式rAb載體，該模塊式rAb載體例如是與來(lái) 自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B腸毒素的保護(hù)性抗原復(fù)合的重組人源化 mAb(抗特異性人樹(shù)突細(xì)胞受體)。該實(shí)體的潛在市場(chǎng)是所有軍事人員的疫苗 接種和儲(chǔ)備待用給大居民點(diǎn)服藥以應(yīng)對(duì)任何與這些試劑相關(guān)的生物威脅的
興趣的工業(yè)包括制藥和生物技術(shù)工業(yè)。
本發(fā)明包括包含疫苗的組合物和方法，其特異性靶向(遞送)抗原至抗原 呈遞細(xì)胞(APC)以引發(fā)針對(duì)該抗原的有效且廣泛的免疫應(yīng)答。這些組合物i秀 發(fā)針對(duì)衍生所述抗原的活性劑(病原體或癌癥)的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。 此外，本發(fā)明產(chǎn)生了這樣的試劑，其直接或與其他試劑一起通過(guò)它們與在抗 原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的CLEC-6受體的特異性結(jié)合而具有治療性作用。
才才津牛和方法
抗體和四聚體-用于DC和B細(xì)胞表面染色的抗體(Ab)，包括同型對(duì)照 Ab，購(gòu)自BD Biosciences (CA)。用于ELISA的Ab購(gòu)自Bethyl (TX)?？?BLyS 和抗-APRIL來(lái)自PeproTech (NJ)。四聚體HLA-A承0201-GILGFVFTL (Flu Ml) 和HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-1)購(gòu)自Beckman Coulter (CA)。
細(xì)胞和培養(yǎng)物-來(lái)自正常供體的單核細(xì)胞(lxlO"ml)在含有GM-CSF (100 ng/ml)和IL-4 (50 ng/ml) (R&D, CA)的Cellgenics (France)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 對(duì)于第3天和第6天的DC，分別在第1天和第3天將相同量的細(xì)胞因子添 加到培養(yǎng)液中。B細(xì)胞用陰性分離試劑盒(BD)純化。CD4和CD8 T細(xì)胞用 包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy， CA)純化。使用PercollTM梯度(GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)通過(guò)密度梯度離心從血沉棕黃層中 分離PBMC。對(duì)于DC活化，將lx105 DC在用mAb包被的96孔平板中培 養(yǎng)16-18h。在碳酸鹽緩沖液pH 9.4中的mAb (l-2嗎/孑L)在37。C下培養(yǎng)至少 3h。收集培養(yǎng)物上清液，細(xì)胞因子/趨化因子通過(guò)Luminex(Biorad， CA)測(cè)定。 對(duì)于基因分析，DC在mAb包被的平板中培養(yǎng)8h。在一些實(shí)驗(yàn)中，將可溶 性50 ng/ml CD40L (R&D， CA)或50 nM CpG (InVivogen， CA)添加到培養(yǎng)液 中。在DC和B細(xì)胞共培養(yǎng)中，將重懸在含有10% FCS和抗生素的RPMI1640
24(Biosource， CA)中的5xl03 DC首先在mAb包被的平板中培養(yǎng)至少6h，然 后加入lx 105用CFSE (Molecular Probes, OR)標(biāo)記的純化自體B細(xì)胞。在一 些實(shí)驗(yàn)中，DC用5 moi (感染復(fù)數(shù))熱滅活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脈沖攻擊 2h，然后與B細(xì)胞混合。對(duì)于DC和T細(xì)胞共培養(yǎng)，將5xl03 DC與lx105 純化的自體CD8 T細(xì)胞或者混合的同種異體T細(xì)胞一起培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最 后18h，用1(iCi/孔s[H]-胸普脈沖攻擊同種異體T細(xì)胞，然后通過(guò)用|3-計(jì)數(shù) 儀(Wallac, MN)測(cè)定cpm。以5xl05 PBMC/孔在mAb包被的平板中培養(yǎng)。 分別在第10天和第7天，通過(guò)用抗CD8和四聚體染色細(xì)胞來(lái)測(cè)定Mart-l和 Flu Ml特異性CD8 T細(xì)胞的頻率。將10 fiM的Mart-l肽(ELAGIGILTV)和 20 nM的含Mart-l肽的重組蛋白(參見(jiàn)下文)添加到DC和CD8 T細(xì)胞培養(yǎng)物 中。將20 nM純化的重組Flu Ml蛋白(參見(jiàn)下文)加到PBMC培養(yǎng)物中。
單克隆抗體-通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備小鼠mAb。簡(jiǎn)而言之，用含有Ribi佐 劑的20嗎受體胞外結(jié)構(gòu)域.hlgGFc融合蛋白對(duì)6周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行i.p. 免疫，然后在第10天和第15天，用20昭抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。3個(gè)月后， 在取出脾臟的前3天，再對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫?；蛘?，在30天至40天的期間內(nèi)， 每3-4天用在Ribi佐劑中的l-10jag抗原注射小鼠足墊。在最后加強(qiáng)免疫后 的3-4天，收集引流的淋巴結(jié)，將來(lái)自脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞的B細(xì)胞與 SP2/0-Ag 14細(xì)胞融合。對(duì)雜交瘤上清液進(jìn)行篩選，與單獨(dú)的融合伴侶或與 堿性磷酸酶融合的受體胞外結(jié)構(gòu)域(15)相比，分析受體胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白 的Ab。然后在FACS中使用用編碼全長(zhǎng)受體cDNA的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 293F細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行篩選。被選的雜交瘤是在CELLine瓶(Intergra， CA) 中克隆和擴(kuò)增的單個(gè)細(xì)胞。雜交瘤上清液與等體積的1.5 M甘氨酸、3 M NaCl、 lxPBS, pH7.8混合，并用MabSelect樹(shù)脂滾動(dòng)。用結(jié)合i爰沖液洗滌 樹(shù)脂，并用0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脫。接著用2MTris中和，用PBS透析 mAb。
ELISA -進(jìn)行夾心ELISA來(lái)測(cè)量總IgM、 IgG和IgA以及flu特異性免 疫球蛋白(Ig)。含有已知量的Ig的標(biāo)準(zhǔn)人血清(Bethyl)和人AB血清分別用作 總Ig和flu特異性Ig的標(biāo)準(zhǔn)。樣本中的Flu特異性Ab滴度，單位被確定為 具有相同的光密度的AB血清的稀釋系數(shù)。用ELISA試劑盒(Bender MedSystem, CA)測(cè)定BAFF和BLyS的量。
RNA純化和基因分析-用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，并用2100 Bioanalyser (Agilent)分片斤。生物素才示i己的cRNA草巴標(biāo)用Illumina totalprep標(biāo) 記試劑盒(Ambion)制備并雜交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的轉(zhuǎn)錄本) 上。這些微陣列由附著在3pm珠上的50mer寡核苷酸探針組成，所述珠固 定在硅片表面上蝕刻的微孔中。用鏈霉抗生物素-Cy3染色后，用Illumina(Beadstation 500X)生產(chǎn)的亞微米分辨掃描儀成像。用基因表達(dá)分析軟件程序 GeneSpring, Version 7.1 (Agilent)進(jìn)4亍凄t氺居分牙斤。
重組Flu Ml和MART-1蛋白的表達(dá)和純化-用PCR擴(kuò)增流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) Ml基因的ORF，同時(shí)加入起始密碼 子遠(yuǎn)端的Nhe I位點(diǎn)以及終止密碼子遠(yuǎn)端的Not I位點(diǎn)。將消化片段克隆到 pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml ORF讀框內(nèi)插入His6標(biāo)簽，從而編碼 His.Flu Ml蛋白質(zhì)。編碼插入在Nco I和Nhe I之間的來(lái)自熱纖梭菌(C. Aenwoce〃wm)(未公開(kāi))的N端169個(gè)殘基粘附蛋白結(jié)構(gòu)域的pET28b(+)衍生 物表達(dá)Coh.His 。為表達(dá)粘附蛋白-Flex-hMART-l-肽A-His ,序列
(SEQ ID NO.: 1) ( 編 碼
DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGE FCRYPSHWRP (SEQ ID NO.: 2)-帶陰影的殘基是免疫顯性的HLA-A2-限制 性肽，而該肽周?chē)鷰聞澗€的殘基來(lái)自MART-l)被插入到上述載體的Nhe I 位點(diǎn)和Xho I位點(diǎn)之間。蛋白在大腸桿菌菌抹BL21(DE3) (Novagen)或者T7 Express (NEB)中表達(dá)，這些菌抹在37。C下在LB中培養(yǎng)，以卡那霉素抗性 (40(ig/ml)選擇，并以200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶直至生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，同時(shí)添加120 mg/L IPTG。 3h后，通過(guò)離心收集細(xì)胞，保存在-80。C下。將來(lái)自每1L發(fā) 酵物中的大腸桿菌細(xì)胞重懸在30 ml含有0.1 ml蛋白酶抑制劑Cocktail II (Calbiochem, CA)的冰冷的50 mM Tris， 1 mM EDTA pH 8.0 (緩沖液B)中。 在水上超聲處理細(xì)胞2次，每次5分鐘，設(shè)定值為18 (Fisher Sonic Dismembrator 60)，其中有5分鐘靜止期，然后在4°C下以17,000 r.p.m. (Sorvall SA-600)離心20分鐘。為了純化His.Flu Ml,使50 ml細(xì)胞裂解物上清液部 分通過(guò)5 ml Q瓊脂糖珠，將6.25 ml 160 mM Tris、 40 mM咪唑、4 M NaCl pH 7.9添加到Q瓊脂糖流動(dòng)液中。將其以4 ml/分鐘速度上樣到5 ml帶有Ni++ 的ffiTrap螯合HP柱上。結(jié)合柱的蛋白質(zhì)用20 mM NaP04 , 300 mM NaCl pH 7.6(緩沖液D)洗滌，接著用100mMH3COONapH4.0再洗滌一次。結(jié)合的 蛋白質(zhì)用100mMH3COONapH4.0洗脫。合并峰值餾分，以4ml/分鐘的速 度上樣到用100 mM H3COONa pH 5.5平衡的5 ml HiTrap S柱上，用平衡緩 沖液洗滌，接著用在50 mM NaP04 pH 5.5中的梯度為0-1 M的NaCl洗脫。 合并用約500 mM NaCl洗脫的峰值餾分。為了純化Coh.Flu Ml.His，如上所 述將來(lái)自2L培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解。離心后，將2.5 ml Triton29 XI14加到上清
26液中，在水上培育5分鐘。在25。C下再溫育5分鐘后，在25。C下進(jìn)行離心， 從Triton XI14中分離上清液。重復(fù)提取操作，將上清液通過(guò)5ml的Q瓊脂 糖珠，在Q瓊脂糖流動(dòng)液中添加6.25 ml 160 mM Tris、40 mM咪唑、4 M NaCl pH7.9。如上所述，用1^++螯合的層析柱純化蛋白質(zhì)，并用在緩沖液D中的 0-500 mM 。米唑洗脫。
抗CLEC-6 mAb的L和H可變區(qū)對(duì)應(yīng)的具體序列-本發(fā)明包含如下所 示相應(yīng)于抗CLEC-6單克隆抗體的具體氨基酸序列，所述抗體是治療性或<呆 護(hù)性產(chǎn)品的期望組分(在例如人源化重組抗體情況下)。下面是嵌合小鼠V區(qū) (下劃線)-人C區(qū)(粗體)重組抗體中的所述序列。 rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6一9B9.2G12—Kv-V-hlgGK畫(huà)C] DIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASODISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSI
VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.:3) rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12一Hv-LV-hlgG4H畫(huà)C]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VL(JSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEV(JF鼎YVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
(SEQ ID NO.:4)。
本發(fā)明包括V區(qū)序列和相關(guān)序列的用途，該相關(guān)序列由本領(lǐng)域熟練技術(shù) 人員修飾以例如增強(qiáng)對(duì)CLEC-6的親和性和/或被整合到人V區(qū)閱讀框序列 中以工程化入表達(dá)載體中以指導(dǎo)能夠結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞上的CLEC-6的蛋 白形式的表達(dá)。圖7E顯示用于例如臨床前體外分析的工程化形式)。此外， 本發(fā)明中公開(kāi)的(或者使用用于本文公開(kāi)的獨(dú)特生物學(xué)的相似方法和篩選 獲得的)其它mAb可以通過(guò)相似的方式(最初通過(guò)PCR克隆和測(cè)序小鼠雜交 瘤V區(qū))以導(dǎo)入編碼相似的重組抗體(rAb)的表達(dá)載體中。這種抗CLEC-6 V 區(qū)可進(jìn)一步由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員"人源化"(即鼠-特異性結(jié)合序列移植到人 V區(qū)閱讀框序列中)以使治療性rAb的潛在的免疫反應(yīng)性最小化。
工程化重組抗CLEC-6重組抗體-抗原融合蛋白(rAb.抗原)是有效的體 外原型疫苗-可用不同的蛋白編碼序列，如與H鏈編碼序列框內(nèi)融合，來(lái)
27構(gòu)建表達(dá)載體。例如，抗原如流感病毒HA5、流感病毒M1、 HIV gag或來(lái) 自癌抗原的免疫顯性肽、或者細(xì)胞因子之后可表達(dá)為rAb.抗原或rAb.細(xì)胞因 子融合蛋白，其在本發(fā)明的情況下，可具有利用抗CLEC-6V區(qū)序列以將抗 原或細(xì)胞因子(或毒素)直接帶到具有CLEC-6的抗原呈遞細(xì)胞的表面的用 處。這可以允許例如抗原的內(nèi)在化-有時(shí)與受體的激活以及之后的啟動(dòng)治療
i構(gòu)思的疫苗可以采用如下所示的！^鏈^體i碼序列。上述圖7E顯示用于 臨床前體外分析的rAb的一個(gè)實(shí)例
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12 (下劃線)—Hv-LV-hlgG4H-C (粗體) -Flex-FluHAl-l-(斜體)6xHis]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VL(JSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS(JEDPEV(3F歴YVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDT
丄《渭&4虹皿FHHHHHH (SEQ ID NO. :5)
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12—(下劃線)Hv-LV-hIgG4H-C-(粗體) Flex-FluHA5-l-(斜體)6xHis]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSOEDPEV(JF而YVDGVEVHN
AKTKPREE(JFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
28VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW(JEGNVFSCSVMHEALHNHYTC KSLSLSLGKASDT
五CPOmS7W LKL4HHHHHH (SEQ ID NO.:6)
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC_6—9B9.2G12—(下劃線)Hv-LV-hlgG4H-C (粗體) -錨定蛋白(斜體)]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLC SSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS(JEDPEV(3FNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWCJEGNVFSCSVMHEALHNHYTCJKSLSLSLGKASiVS
K/i 孤ZLP/ (SEQ ID NO.: 7)
與基于抗CLEC-6重組抗體的原型疫苗的構(gòu)建相關(guān)的方法 嵌合小鼠/人mAb的cDNA克隆和表達(dá)-從雜交瘤細(xì)胞制備總RNA (RNeasy試劑盒，Qiagen)，并用于cDNA合成和PCR (SMART RACE試劑 盒，BD Biosciences),采用提供的5'引物和基因特異性3'引物 mlgGK ， 5 ，ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3 ， (SEQ ID NO. :8); mlgG入，5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3， (SEQ ID NO. :9); mlgGl, 5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3' (SEQ ID NO. :10); mlgG2a， 5,ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3， (SEQ ID NO.:l 1), 以及 mlgG2b ， 5 ， ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3 ， (SEQ ID NO. :12)。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆(pCR2.1 TA試劑盒，Invitrogen)，并通過(guò)DNA測(cè) 序表征。用來(lái)自小鼠H和L鏈V區(qū)cDNA的序列，采用特異性引物以進(jìn)行 PCR擴(kuò)增信號(hào)肽和V區(qū)，同時(shí)插入側(cè)翼限制性位點(diǎn)以克隆到編碼下游人IgGK 或IgG4H區(qū)的表達(dá)載體中。表達(dá)嵌合mVK-hlgK的載體通過(guò)擴(kuò)增由Xho I和 Not I位點(diǎn)側(cè)翼的殘基401-731 (gi|63101937|),并將其插入到pIRES2-DsRed2
29(BD Biosciences)的Xho I - Not I間隔中來(lái)構(gòu)建。使用PCR擴(kuò)增mAb Vk區(qū)， 從起始密碼子開(kāi)始，附加Nhe I或Spe I位點(diǎn)，接著是CACC，然后是編碼 區(qū)(例如，gi|76779294|的殘基126)，并附加X(jué)ho I位點(diǎn)。然后將PCR片段克 隆到上述載體的Nhe I - Not I間隔中。采用mSLAM前導(dǎo)區(qū)(leader)的嵌合 mVK-hlgK 載 體 通 過(guò) 將 序 列
5,ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaagggcccactcgag3， (SEQ ID NO.:13)插入到上述載體的Nhe I - Xho I間隔中來(lái)構(gòu)建。使用PCR擴(kuò)增預(yù)期成熟N末端密碼子(用SignalP 3.0 Server 確定)(Bendtsen, Nielsen等，2004)和mVK區(qū)的末端(如上所定義)之間的間隔， 并附加5'tegtacgga3，。用Bsi WI和Xho I酶切的片段插入到上述載體的相應(yīng) 位點(diǎn)中。對(duì)照hlgK序列相應(yīng)別49257887|殘基26-85和gil21669402l殘基 67-709。對(duì)照hlgG4H載體相應(yīng)gill9684072l的殘基12-1473，具有S229P和 L236E取代，其穩(wěn)定二硫鍵并消除殘基FcR結(jié)合(Reddy, Kinney等，2000)， 插入到pIRES2-DsRed2載體的Bgl II和Not I位點(diǎn)之間，同時(shí)添加序列 5'gctagctgattaattaa3， (SEQ ID NO.:14)代替終止密碼子。采用PCR擴(kuò)增mAb 的VH區(qū)，從起始密碼子開(kāi)始，附力。CACC，接著是BglII位點(diǎn)，然后是編 碼gi卩9684072l的殘基473。將PCR片段克隆到上述載體的Bgl II - Apa I間 隔中。采用mSLAM前導(dǎo)區(qū)的嵌合mVH-hlgG4序列的載體通過(guò)將下述序列 5，ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaagggccc3， (SEQ ID NO.:15)插入到上述載體的Nhe I - Apa I間隔 中來(lái)構(gòu)建。使用PCR擴(kuò)增預(yù)期成熟N末端密碼子和mVH區(qū)的末端之間的 間隔區(qū)，通過(guò)附加5'tcgtacgga3，。將用Bsi WI和Apa I酶切的片段插入到上 述載體相應(yīng)的位點(diǎn)中。
將不同抗原編碼序列插入到H鏈載體的Nhe I - Pac I - Not I間隔中，該 抗原編碼序列兩側(cè)為近端Nhe I位點(diǎn)和終止密碼子后的遠(yuǎn)端Not I位點(diǎn)。Flu HA1-1由近端為5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'序歹寸(Nhe I 位點(diǎn)，然后為編碼cipA粘附蛋白-粘附蛋白接頭殘基)和遠(yuǎn)端為 5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'序歹'J(編碼His6、終止密碼子和Not I位點(diǎn)) 的曱型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34(HlNl))紅細(xì)胞凝集素gi|216931681殘基 82-1025 (C982T改變)編碼。Flu HA5-1由結(jié)合有與Flu HA1-1相同序列的 gil50296052l曱型流感病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))紅細(xì)胞凝集素殘基 49-990編碼。Doc由具有近端Nhe I位點(diǎn)和遠(yuǎn)端Not I位點(diǎn)的gi|40671|celD 殘基 1923-2150 編碼 。PSA 由具有近端序列 5'gctagcgatac犯c3g犯cctgc犯c3cctec犯c3Cctgt犯c^c3ccg3C33c犯c3cttctegcgc3' (SEQ ID NO.: 16) (Nhe I位點(diǎn)和cipA間隔區(qū))和遠(yuǎn)端Not I位點(diǎn)的gi|34784812|
30前歹'J腺特異性抗原殘基 101-832 編碼。Flu M1-PEP 由 5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcga acgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc3' (SEQ ID NO.: 17)纟扁石馬。這個(gè) 以及所有其他肽編碼序列通過(guò)具有適于克隆入Nhe I和Not I限制性H鏈載
來(lái)-生?？偸鞘褂脙?yōu)選的人密碼子，除了限制性位點(diǎn)需要加入或在CipA間 隔區(qū)序列中的情況。
采用L鏈和H鏈構(gòu)建體各 2.5 iig和上述的方案，在5ml瞬時(shí)轉(zhuǎn)染物中 檢測(cè)rAb表達(dá)構(gòu)建體的生產(chǎn)水平。用抗hlgG ELISA (親和純化的山羊抗人 IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch)分析上清液。在該方案的^r測(cè)中，分泌 的rAb產(chǎn)生不依賴于H鏈和L鏈載體濃度，各DNA濃度在~ 2倍的范圍內(nèi) (即系統(tǒng)是DNA飽和的)。
本發(fā)明包括新的抗人CLEC-6劑的研發(fā)、鑒定和應(yīng)用，以及它們用于揭 示作為本發(fā)明以及預(yù)想的應(yīng)用的基礎(chǔ)的新生物學(xué)?？偠灾?，開(kāi)發(fā)了新的抗 CLEC-6單克隆抗體(mAb)，并用于揭示與存在于抗原呈遞細(xì)胞上的該細(xì)胞 表面受體相關(guān)的先前未知的生物學(xué)。該新的生物學(xué)高度預(yù)期激活該受體的抗 CLEC-6活性劑用于各種治療型和保護(hù)性應(yīng)用的用途。下述數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地支 持了最初的預(yù)期，并闡述了將本文揭示的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成臨床應(yīng)用的途徑。
針對(duì)人CLEC-6高親和力單克隆抗體的開(kāi)發(fā)-制備受體胞外結(jié)構(gòu) 域.hlgG (人IgGlFc)和AP (人胎盤(pán)堿性磷酸酶)融合蛋白，以分別用于小鼠免 疫和mAb篩選。DCIR胞外結(jié)構(gòu)域.IgG的表達(dá)構(gòu)建體以前已描述(15)，并利 用小鼠SLAM (mSLAM)信號(hào)肽引導(dǎo)分泌(16)。制備類似的hDCIR胞外結(jié)構(gòu) 域.AP表達(dá)載體，用PCR擴(kuò)增AP殘基133-1581 (gb|BC009647|),并添加近 端閱讀框內(nèi)Xho I位點(diǎn)和遠(yuǎn)端TGA終止密碼子和Not I位點(diǎn)。用該Xho I — Not I片段代替上述DCIR胞外結(jié)構(gòu)域.IgG載體中的IgG編碼序列。在相同的Ig 和AP載體系列中的CLEC-6胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體含有編碼CLEC-6 (bp 317-838, g"37577120l插入片段。釆用FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen)，根據(jù)產(chǎn)商操作方案(在1.3 ml Fectin試劑/L轉(zhuǎn)染物中1 mg總質(zhì) 粒DNA)制備CLEC-6融合蛋白。為產(chǎn)生rAb,等量的編碼H和L鏈的載體 進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)物上清液，添加新鮮的培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)2天。通過(guò)過(guò)濾澄清合并的上清液。受體胞外結(jié)構(gòu)域.MgG的純化 釆用HiTrap蛋白A親和層析，用0.1 M甘氨酸pH 2.7洗脫，然后用PBS進(jìn) 行透析。rAb (之后將描述的重組抗體)用HiTrap MabSelectTM柱作類似地純 化。小鼠mAb通過(guò)常規(guī)細(xì)胞融合技術(shù)制備。簡(jiǎn)而言之，6周齡BALB/c小鼠 用20 jig受體胞外結(jié)構(gòu)域.hlgGFc融合蛋白和Ribi佐劑腹膜內(nèi)注射免疫，然后在10天和15天后用20 (ig抗原強(qiáng)化免疫。3月后，在取出小鼠脾臟前3 天再次強(qiáng)化免疫?；蛘?，在足墊中每隔3-4天用在Ribi佐劑中的1-10昭抗 原對(duì)小鼠進(jìn)行注射，持續(xù)30-40天。在最后強(qiáng)化免疫后的3-4天，收集引流 的淋巴結(jié)。采用常規(guī)技術(shù)將來(lái)自脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞的B細(xì)胞與SP2/OAg 14 細(xì)胞(17)融合。與單獨(dú)的融合伴倡比較，或與AP融合的受體胞外結(jié)構(gòu)域(15) 比較，用ELISA篩選雜交瘤上清液中針對(duì)受體胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白的抗體。 陽(yáng)性孔然后使用編碼全長(zhǎng)受體cDNA的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞，用 FACS進(jìn)行篩選。選擇出的雜交瘤是單細(xì)胞克隆，適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，并在 CELLine瓶(Intergra)中擴(kuò)增。雜交瘤上清液與等體積的1.5 M甘氨酸，3 M NaCl, lxPBS， pH7.8混合，并用MabSelect樹(shù)脂混勻。用結(jié)合緩沖液洗滌 所述樹(shù)指，并用0.1M甘氨酸，pH2.7洗脫。然后用2MTris進(jìn)行中和，用 PBS透析mAb。
采用直接或間接ELISA鑒定純化的抗CLEC-6單克隆抗體用ELISA 檢測(cè)雜交瘤克隆的幾種抗CLEC mAb的相對(duì)親和性(即CLEC-6.Ig蛋白固定 到^f鼓量滴定板表面，以一系列劑量滴定檢測(cè)抗體結(jié)合CLEC-6.Ig的能力(用 抗小鼠IgG.HRP結(jié)合物試劑進(jìn)行檢測(cè)))。各圖片分別是mAb對(duì)CLEC-6.Ig 蛋白的反應(yīng)性(A和D); mAb對(duì)MgGFc蛋白的反應(yīng)性(B和E)以及mAb對(duì) CLEC-6.堿性磷酸酶融合蛋白的反應(yīng)性(C和F)。在后種情況中，mAb被滴定 板結(jié)合(通過(guò)抗小鼠IgG試劑)并且結(jié)合恒量的在溶液中的CLEC-6.AP。結(jié)果 表明抗CLEC-6 mAb與CLEC-6胞外結(jié)構(gòu)域具有高度親和性的特異反應(yīng)。
鑒定純化的抗CLEC-6單克隆抗體FACS對(duì)表達(dá)全長(zhǎng)CLEC-6的293細(xì) 胞通過(guò)FACS進(jìn)行幾種抗CLEC-6 mAb的相對(duì)親和性的4全測(cè)(即不同濃度 的CLEC-6.mAb與表達(dá)CLEC-6的293F細(xì)胞一起溫育；洗滌后，用PE衍生 的抗小鼠IgG試劑染色；結(jié)果是用染色的不表達(dá)CLEC-6的293F細(xì)胞進(jìn)行 校正的平均熒光強(qiáng)度)。所示的所有4種mAb特異性地染色含CLEC-6細(xì)胞， 染色能力的等級(jí)次序是12H7~12E3>9D5〉20H8。
體內(nèi)和體外培養(yǎng)DC表達(dá)CLEC-6 -用FACS測(cè)定來(lái)自正常供體的 PBMC上的CLEC-6的表達(dá)水平。如圖la所示，抗原呈遞細(xì)胞，包括CDllc十 DC、 CD14+單核細(xì)胞以及CD19+B細(xì)胞，表達(dá)CLEC-6。然而，CD3+T細(xì) 胞不表達(dá)CLEC-6。 CD56+ NK也不表達(dá)CLEC-6 (數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。還測(cè)定體 外培養(yǎng)的DC以及純化的血髓樣DC (mDC)和漿細(xì)胞樣DC (pDC)上的 CLEC-6表達(dá)水平。圖lb中的數(shù)據(jù)表明IL-4DC和IFNDC均表達(dá)顯著水平 的CLEC-6。體外培養(yǎng)的DC上的CLEC-6表達(dá)水平是顯著的，因此可以利 用這些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以揭示CLEC-6的功能。mDC也表達(dá)高水平的CLEC-6, 但pDC不表達(dá)CLEC-6 (數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。后一觀察結(jié)果尤其重要，因?yàn)樗鼈?br> 32適用于直接從血中分離的細(xì)胞，并表明CLEC-6并不是所有DC類型中均存 在-因此表明通過(guò)CLCE-6的生物學(xué)可針對(duì)特定的DC類型，而已知這些特定 的DC類型具有不同的免疫功能。
選擇能夠激活DC的抗CLEC-6 mAb -分離了 12種不同的產(chǎn)生小鼠抗 人CLEC-6 mAb雜交瘤克隆，并檢測(cè)所產(chǎn)生的mAb的激活DC的能力，通 過(guò)測(cè)量DC表型和DC分泌的細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)檢測(cè)。圖2中的凄史據(jù)顯 示可以鑒定激活DC的mAb的實(shí)例。在4種抗CLEC-6 mAb中，Ab49可以 激活DC,并誘導(dǎo)DC產(chǎn)生顯著量的分泌性IL-6、 MIP-la、 MCP-l、 IP-10以 及TNFa。這些抗CLEC-6 mAb也刺激DC產(chǎn)生IL-12p40 、 IL-1 a以及IL-1 b (數(shù) 據(jù)沒(méi)有顯示)。其它3種抗CLEC-6 mAb也激活DC,并且各mAb刺激DC 產(chǎn)生不同水平的細(xì)胞因子和趨化因子。
這些數(shù)據(jù)表明只有某些高親和性的抗CLEC-6 mAb才能激活人DC -這 是以前不為所知的生物學(xué)。這種引發(fā)DC分泌細(xì)胞因子的能力表明這種抗 CLEC-6劑可在體內(nèi)影響免疫應(yīng)答。
通過(guò)CLEC-6信號(hào)傳導(dǎo)激活DC細(xì)胞表面標(biāo)記物-DC是決定免疫應(yīng)答 結(jié)果的主要免疫細(xì)胞，即免疫誘導(dǎo)或耐受依賴于它們是否被激活(18)。本研 究中制備的某些抗CLEC-6 mAb可激活在體外培養(yǎng)的IFNDC (圖2)，還檢測(cè) 了 CLEC-6在激活不同的DC亞型(IL-4DC和血mDC. IL-4DC)中的作用。 IL-4DC用抗CLEC-6 mAb進(jìn)行刺激，圖3a中的數(shù)據(jù)表明通過(guò)CLEC-6的信 號(hào)傳導(dǎo)激活I(lǐng)L-4DC，導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86和HLA-DR的增強(qiáng)表達(dá)。 抗CLEC-6 mAb也激活體內(nèi)DC -純化的mDC用抗CLEC-6刺激18小時(shí)， 然后細(xì)胞用抗CD86、 CD80和HLA-DR染色。如圖3b所示，抗CLEC-6 mAb 激活mDC而使CD86、 CD80和HLA-DR的表達(dá)水平增加。圖3A和3B中 的數(shù)據(jù)表明由特異性抗CLEC-6 mAb激活DC，包括上調(diào)已知在DC功能中 重要的細(xì)胞表面分子。
通過(guò)CLEC-6的信號(hào)傳導(dǎo)特異性激活DC基因-同樣地，用抗CLEC-6 mAb刺激的DC的多種基因的表達(dá)水平增加，包括共刺激分子以及趨化因子 和細(xì)胞因子相關(guān)基因(圖4)。與通過(guò)其它凝集素，包括DC-ASGPR和LOX-1 的信號(hào)傳導(dǎo)(數(shù)據(jù)未顯示)相比，抗CLEC-6 mAb以獨(dú)特的方式激活DC,表 明通過(guò)CLEC-6激活的DC導(dǎo)致獨(dú)特的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
通過(guò)CLEC-6的信號(hào)激活不同DC亞型中的基因-當(dāng)用抗CLEC-6mAb 刺激時(shí)，體外培養(yǎng)的IL-4DC和mDC均產(chǎn)生顯著增加量的分泌性IL-12p40、 MCP-l和IL-8。在用抗CLEC-6 mAb刺激的DC的培養(yǎng)物上清液中也觀察到 其它細(xì)胞因子和趨化因子，包括TNFa、 IL-6、 MIP-la、 IL-la和IL-lb的水 平增加(數(shù)據(jù)未顯示)。這些細(xì)胞因子已知是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵介質(zhì)，而發(fā)現(xiàn)特異性抗CLEC-6活性劑激發(fā)它們的產(chǎn)生為這些試劑可能的治療性應(yīng)用提供支 持。
通過(guò)CLEC-6的信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)通過(guò)CD40的信號(hào)傳導(dǎo)-通過(guò)CLEC-6的 信號(hào)與通過(guò)CD40的信號(hào)協(xié)同用于增強(qiáng)DC的激活(圖6)。在CD40-CD40L 相互作用中CLEC-6結(jié)合導(dǎo)致顯著增加的細(xì)胞表面CD83的表達(dá)(圖6A)和分 泌性IL-12p70和IL-12p40的產(chǎn)生(圖6B)。其它細(xì)胞因子和趨化因子，包括 TNFa、 IL-6、 MCP-1、 MIP-la、 IL-la和IL-lb也顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)。這 是重要的，因?yàn)镃LEC-6可以作為體內(nèi)DC激活的共刺激分子。總而言之， 從圖1到圖6提供的數(shù)據(jù)證明通過(guò)CLEC-6的信號(hào)傳導(dǎo)可以激活DC,且 CLEC-6作為DC激活的有效共刺激分子。
通過(guò)CLEC-6刺激的DC誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答-DC通過(guò)提供T-依賴 型和T-非依賴型B細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)(20-23)并轉(zhuǎn)移抗原至B細(xì)胞(24、 25)而在 體液免疫應(yīng)答中起著重要作用。除DC外，經(jīng)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)作為第三級(jí) 信號(hào)是有效B細(xì)胞反應(yīng)所必需的(26、 27)。因此，我們測(cè)試了在TLR9配體
用抗CLEC-6 mAb進(jìn)行刺激，然后與純化^B細(xì)胞共培養(yǎng)。如圖7a所示， 與在CpG存在下用對(duì)照mAb刺激的DC相比，用抗CLEC-6 mAb激活的 DC導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的B細(xì)胞增殖(經(jīng)CFSE稀釋測(cè)定)和漿細(xì)胞分化 (CD38+CD2(T細(xì)胞群增加)。CD38+CD2(T B細(xì)胞具有漿細(xì)胞的典型形態(tài)，但 不表達(dá)CD138(數(shù)據(jù)未顯示)。大多數(shù)增殖細(xì)胞不表達(dá)CCR2、 CCR4、 CCR6 或CCR7 (數(shù)據(jù)未顯示)。
用ELISA測(cè)定產(chǎn)生的總免疫球蛋白(Ig)的量(圖7b)?？笴LEC-6與針對(duì) 其他凝集素LOX-l和DC-ASGPR的mAb進(jìn)4亍比較。與圖7a中的數(shù)據(jù)一致， B細(xì)胞與用抗CLEC-6激活的DC —起培養(yǎng)顯著增加了總IgM、 IgG和IgA 的產(chǎn)生。用抗L0X-1刺激的DC導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生類似水平的IgM、 IgG和 IgA。但與用抗CLEC-6和抗LOX-l mAb刺激的DC不同，用抗DC-ASGPR mAb刺激的DC導(dǎo)致IgG和IgA的量顯著降低，表明通過(guò)CLEC-6和LOX-l 的信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換。除總Ig外，由LOX-l觸發(fā)激 活的DC比用對(duì)照mAb刺激的DC對(duì)產(chǎn)生流感病毒特異性IgM、 IgG和IgA 更強(qiáng)烈(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗CLEC-6激活的DC導(dǎo)致增強(qiáng)的B細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制涉及增殖誘導(dǎo)配體 (APRIL)。 DC產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞刺激蛋白(BLyS, BAFF)和APRIL是重要的 分子，DC通過(guò)它們能夠直接調(diào)控人B細(xì)胞的增殖和功能(28-31)。圖7C中 的數(shù)據(jù)表明通過(guò)CLEC-6刺激的DC增加胞內(nèi)APRIL和分泌性APRIL的表
34達(dá)水平，但不增加表達(dá)BLyS (數(shù)據(jù)未顯示)。測(cè)量在混合培養(yǎng)物中的B細(xì)胞 上的BLyS和APRIL受體的表達(dá)水平，但是沒(méi)有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗CLEC-6mAb直接影響人B細(xì)胞-CD19+B細(xì)胞表達(dá)CLEC-6 (圖1), 表明CLEC-6在B細(xì)胞生物學(xué)中的作用。圖8a的凝:據(jù)顯示觸發(fā)B細(xì)J包上的 CLEC-6導(dǎo)致分泌性IL-8和MIP-la的產(chǎn)生增加，表明CLEC-6也對(duì)B細(xì)胞 激活起作用。相對(duì)于對(duì)照mAb，除IL-8和MIP-la夕卜，用抗CLEC-6 mAb 剌激B細(xì)胞時(shí)也觀察到IL-6和TNFa輕微增加(數(shù)據(jù)未顯示)?？笴LEC-6 mAb 激活的B細(xì)胞分泌的總IgG、 IgM和IgA的量增加(圖8b)。
這些觀察結(jié)果證明了在上述抗CLEC-6活性劑對(duì)B細(xì)胞生物學(xué)的間接影 響(即經(jīng)DC發(fā)揮作用)的研究中CLEC-6的直接作用。總而言之，這些數(shù)據(jù) 揭示體內(nèi)給予所述活性劑將刺激抗體的產(chǎn)生的高度可能性-例如作為疫苗
的佐劑，或者(如下所示)作為直接載體用于將抗原靶向DC和其它抗原呈遞 細(xì)胞以引發(fā)有效的抗原特異性抗體反應(yīng)。
T細(xì)胞應(yīng)答中的CLEC-6的作用-經(jīng)CLEC-6刺激的DC表達(dá)的共刺激 分子的水平增強(qiáng)和產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子的量增加(圖1、 2和3),表明 CLEC-6在細(xì)胞免疫應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮著作用。這通過(guò)混合淋巴 細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來(lái)測(cè)定。純化的同種異源T細(xì)胞的增殖被用CLEC-6特異性 的mAb激活的DC顯著增強(qiáng)(圖9a)。
通過(guò)CLEC-6激活的DC,在用Flu Ml的HLA-A2抗原表位(圖9B上部 的兩個(gè)圖片)以及重組FluMl蛋白(圖9B下部的兩個(gè)圖片)脈沖刺激DC時(shí)， 還導(dǎo)致增強(qiáng)的Flu Ml特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，這表明用抗CLEC-6激活的 DC增強(qiáng)了蛋白抗原的交叉呈遞。對(duì)于治療性應(yīng)用例如疫苗，如果通過(guò) CLEC-6的信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致DC對(duì)原始CD8 T細(xì)胞致敏(priming)和交叉致敏的 能力發(fā)生改變將是有益的。實(shí)際上，圖9C的數(shù)據(jù)顯示用抗CLEC-6mAb激 活的DC導(dǎo)致Mart-l特異性CD8 T細(xì)胞致^:的顯著增強(qiáng)(圖9C上部?jī)蓚€(gè)圖 片)以及交叉致敏的顯著增強(qiáng)(圖9C下部?jī)蓚€(gè)圖片)。總而言之，圖9A、 B和 C的數(shù)據(jù)表明CLEC-6在增強(qiáng)DC功能，引起抗原特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的 增強(qiáng)中起著重要作用。
為了確認(rèn)CLEC-6在疫苗中的潛在用途，抗CLEC-6 rAb-抗原復(fù)合物與 對(duì)照rAb-抗原復(fù)合物在抗原特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答方面進(jìn)行比較。用10 nM rAb-Mart-l融合蛋白負(fù)載IFNDC，并且與自體同源CD8 T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng) 10天。然后用抗CD8和Mart-l四聚體染色細(xì)胞。圖9d的凝:據(jù)顯示抗CLEC-6 rAb-抗原相對(duì)于對(duì)照而言誘導(dǎo)了顯著增強(qiáng)的Mart-l特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答 (圖9D上部?jī)蓚€(gè)圖片)。圖9D下部?jī)蓚€(gè)圖片的數(shù)據(jù)是在20 ng/ml LPS (來(lái)自 大腸桿菌)存在下獲得的數(shù)據(jù)。為了進(jìn)一步測(cè)試抗CLEC-6 rAb用于疫苗應(yīng)用
35的用途，mDC用抗CLEC-6-Flu HA1復(fù)合體或?qū)φ誶Ab-Flu HA1復(fù)合體負(fù)載。 純化的自體同源CD4 T細(xì)胞共培養(yǎng)7天，然后通過(guò)CFSE稀釋測(cè)定HAl-特 異性CD4T細(xì)胞增殖。如圖9E(上部?jī)蓚€(gè)圖片)所示，抗CLEC-6rAb HA1比 對(duì)照rAb-HAl誘導(dǎo)了更大的HAl-特異性CD4 T細(xì)胞增殖。圖9E下部?jī)蓚€(gè) 圖片中的數(shù)據(jù)是在20 ng/ml LPS (來(lái)自大腸桿菌)存在下獲得的數(shù)據(jù)，該LPS 掩蓋了 CLEC-6特異性作用。
下面顯示的數(shù)據(jù)作為采用抗CLEC-6抗原復(fù)合物用于疫苗接種目的的臨 床前驗(yàn)證。總之，它們表明這些原型疫苗能夠?qū)⒖乖瓕?dǎo)向靶標(biāo)DC,并且設(shè) 想與通過(guò)結(jié)合CLEC-6的相關(guān)激活一起以攝取、加工以及呈遞給特異性記憶 和原初T細(xì)胞，并且引起它們的后續(xù)擴(kuò)增。僅僅這種性質(zhì)足以引發(fā)抗原特異 性細(xì)胞應(yīng)答，其是癌癥疫苗(殺死癌癥細(xì)胞)或病毒疫苗(清除感染細(xì)胞)的關(guān) 鍵組成部分。而且，HA1-特異性D4的擴(kuò)增表明抗CLEC-6原型疫苗使T細(xì) 胞群類型擴(kuò)增，這是激發(fā)抗原-特異性體液(抗體)應(yīng)答的關(guān)鍵。上述數(shù)據(jù)顯示 抗CLEC-6活性劑對(duì)Ig類別轉(zhuǎn)換的作用進(jìn)一步增強(qiáng)了這些疫苗的高度潛在的 獨(dú)特特性。
非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)DC表達(dá)CLEC-6-為檢測(cè)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(食蟹猴) 的血DC是否對(duì)抗人CLEC-6 mAb有反應(yīng)，用抗CLEC-6 mAb和針對(duì)其它細(xì) 胞標(biāo)記物CD3、CD14、CDllc、CD27、CD56和CD16的抗體來(lái)染色猴PBMC。 圖10中的數(shù)據(jù)表明CD14和CD1 lc+細(xì)胞^皮抗L0X-1 mAb染色。然而，CD3+、 CD16+、 CD27+和CD56+細(xì)胞不表達(dá)CLEC隱6。
這些數(shù)據(jù)是重要的，因?yàn)轵?yàn)證了猴作為本發(fā)明預(yù)期的各種治療性抗 CLEC-6活性劑的效果和安全性的臨床前研究的相關(guān)模型。
考慮任何本說(shuō)明書(shū)中討論的實(shí)施方案可通過(guò)本發(fā)明的任何方法、試劑 盒、試劑或組合物實(shí)現(xiàn)，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可用于完成本發(fā) 明的方法。
應(yīng)理解，本文描述的特定實(shí)施方案以例證的方式顯示而不作為本發(fā)明的 限制。不背離本發(fā)明的范圍的前提下，可以在多種實(shí)施方案中使用本發(fā)明的 基本特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員將識(shí)別或僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定本文描述的特 定操作的許多等價(jià)物。這樣的等價(jià)物被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)并被權(quán)利 要求書(shū)所覆蓋。
在說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)指示了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù) 人員的技能水平。所有出版物和專利申請(qǐng)均引入本文作為參考，其程度如同 各單個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e且單獨(dú)地指出引入本文作為參考 一樣。
詞語(yǔ)"一"當(dāng)和術(shù)語(yǔ)"包括"、"包含"、"含有"在權(quán)利要求書(shū)和/或說(shuō)明 書(shū)中一起使用時(shí)可以表示"一個(gè)(種)"，但是也與"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"、"至少
36一個(gè)(種)"和"一個(gè)(種)或一個(gè)(種)以上"的意思一致。在權(quán)利要求書(shū)中術(shù)語(yǔ)"或" 的使用用于表示"和/或"，除非盡管公開(kāi)的內(nèi)容支持指代唯一的替換物以及" 和/或"的定義，但是權(quán)利要求書(shū)中明確指出指的是唯一的替換物或替換物是 相互排斥的。貫穿本申請(qǐng)，術(shù)語(yǔ)"大約"用于表示數(shù)值包括裝置、使用來(lái)測(cè)定 該值的方法的固有誤差變異，或存在于研究受試者之中的變化。
如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所用，詞語(yǔ)"包括"(及其任何形式)、"具有"(及 其任何形式)、"包含"(及其任何形式)或"含有"(及其任何形式)是包含的或開(kāi)放 的并且不排除另外的、未列舉的元件或方法步驟。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"或其組合"指在該術(shù)語(yǔ)之前列舉的項(xiàng)目的所有排列與
組合。例如，"A、 B、 C或其組合"意指包含A、 B、 C、 AB、 AC、 BC或ABC 至少一個(gè)，以及如果在特定的情況下順序是重要的，還包含BA、 CA、 CB、 CBA、 BCA、 ACB、 BAC或CAB。繼續(xù)這個(gè)例子，明確包括的是包含一個(gè) 或多個(gè)項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)的重復(fù)的組合，諸如BB、 AAA、 MB、 BBC、 AAABCCCC、 CBBAAA、 CABABB等等。熟練的技術(shù)人員可以理解在任何組合中通常沒(méi) 有對(duì)項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)數(shù)目的限制，除非從上下文中是顯然的。
按照本申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容而不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)，能夠制備及實(shí)施本文公開(kāi) 及請(qǐng)求保護(hù)的所有組合物和/或方法。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)就優(yōu)選 的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在不背離本發(fā)明的構(gòu)思、 精神及范圍的前提下，可以將變化應(yīng)用于本文所描述的組合物和/或方法以及 本文所描述的方法的步驟中或步驟的序列中。所有這樣的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言顯而易見(jiàn)的類似替代和修改被認(rèn)為在所附的權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā) 明的精神、范圍及構(gòu)思的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種用于增加表達(dá)CLEC-6的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞效力的方法，所述方法包括使所述抗原呈遞細(xì)胞與抗CLEC-6特異性抗體或其片段接觸，其中所述抗原呈遞細(xì)胞被激活。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括分離的樹(shù)突細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞、髓樣樹(shù)突細(xì)胞及其組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括已在體外與GM-CSF和IL-4、干擾素a、抗原及其組合一起培養(yǎng)的如下細(xì)胞分離的樹(shù)突細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、髓樣樹(shù)突細(xì)胞及其組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用GM-CSF和IL-4激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，其中與CLEC-6特異性抗體或其片段接觸增加抗原呈遞細(xì)胞上的CD86和HLA-DR的表面表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用CLEC-6特異性抗體或其片段激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，該激活增加抗原呈遞細(xì)胞上的CD86、CD80和HLA-DR的表面表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞，所述樹(shù)突細(xì)胞由CLEC-6特異性抗體以及GM-CSF和IL-4激活而具有圖4的基因表達(dá)語(yǔ)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞由CLEC-6特異性抗體激活而分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa及其組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞，所述樹(shù)突細(xì)胞由CLEC-6特異性抗體激活而分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、TNFa、 IL-12p40、 IL-la、 IL-lb及其組合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括樹(shù)突細(xì)胞，所述樹(shù)突細(xì)胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a、 CLEC-6特異性抗體或其片段和CD40配體接觸以增強(qiáng)該樹(shù)突細(xì)胞的激活。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括樹(shù)突細(xì)胞，所述樹(shù)突細(xì)胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a和CLEC-6特異性抗體或其片段接觸，增強(qiáng)了該樹(shù)突細(xì)胞的共刺激活性。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括共激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，該激活通過(guò)TLR9受體進(jìn)行，其中所述細(xì)胞增加細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括共激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，其通過(guò)用GM-CSF、 IL-4和TLR9受體配體激活所述細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，其中所述樹(shù)突細(xì)胞觸發(fā)B細(xì)胞增殖。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括共激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，其通過(guò)在B細(xì)胞存在下用CLEC-6和LOX-l激活所述細(xì)胞來(lái)進(jìn)^",其中所述抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換。
14. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括共激活所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟，該激活使用TLR9配體、抗TLR9抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6雜交抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6配體結(jié)合物中至少之一通過(guò)TLR9受體來(lái)進(jìn)行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段選自克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8及其組合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中用CLEC-6特異性抗體或其片段通過(guò)CLEC-6-受體激活的樹(shù)突細(xì)胞激活單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、B細(xì)胞及其組合。
17. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對(duì)的 一 半結(jié)合。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對(duì)的一半結(jié)合，而互補(bǔ)性一半與抗原結(jié)合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/粘附蛋白對(duì)的一半結(jié)合，而互補(bǔ)性一半與抗原結(jié)合，所述抗原選自分子、肽、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、病毒或其部分、細(xì)菌或其部分、真菌或其部分、寄生蟲(chóng)或其部分。
20. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對(duì)的一半結(jié)合，而該對(duì)的另一半與一種或多種細(xì)胞因子結(jié)合，所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF),血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),表皮生長(zhǎng)因子(EGF),結(jié)締組織活性肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長(zhǎng)因子的生物活性類似物、片段和衍生物，B/T細(xì)胞分化因子，B/T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促有絲分裂細(xì)胞因子，趨化細(xì)胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-(5， IFN-y，IU, IL2, IU, IL4, IL5， IL6, IL7, IL8， IL9， EL10, ILll， IL12， IU3,IL14， IL15， IL16， IL17， IL18等,瘦素，肌肉生長(zhǎng)抑制素，巨噬細(xì)胞刺激蛋白，血小板衍生生長(zhǎng)因子，TNF-a， TNF-卩，NGF， CD40L， CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF, M-CSF, GM隱CSF, PDGF， IL-la, ILl-p， IP畫(huà)IO，PF4， GRO， 9E3，促紅細(xì)胞生成素，內(nèi)皮抑素、血管抑素、VEGF，包括卩轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(例如TGF-pi、 TGF-p2、 TGF-(33)在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)超基因家族；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、抑制素B);生長(zhǎng)分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。
21. —種用于將髓樣樹(shù)突細(xì)胞與漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞分開(kāi)的方法，所述方法包括利用CLEC-6表達(dá)將表達(dá)CLEC-6的髓樣樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞或單核細(xì)胞與不表達(dá)CLEC-6的漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞分離。
22. 表達(dá)CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述CLEC-6特種細(xì)胞因子或既表達(dá)新的表面標(biāo)記物又分泌一種或多種細(xì)胞因子。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的雜交瘤，其中所述雜交瘤選自克隆12H7、 12E3、9D5、 20H8及其組合。
24. —種用于增強(qiáng)B細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括觸發(fā)B細(xì)胞上的CLEC-6受體，以增加抗體產(chǎn)生、分泌細(xì)胞因子、增加B細(xì)胞活化表面標(biāo)記物的表達(dá)及其組合。
25. 4艮據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所迷B細(xì)胞分泌IL-8、 MIP-la和其組合。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述B細(xì)胞增加IgM、 IgG和IgA的產(chǎn)生。
27. —種用于增強(qiáng)T細(xì)胞活化的方法，所述方法包括用CLEC-6特異性 抗體或其片段觸發(fā)樹(shù)突細(xì)胞上的CLEC-6受體，并使T細(xì)胞與CLEC-6活化 的樹(shù)突細(xì)胞接觸，其中T細(xì)胞的活化被增強(qiáng)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述T細(xì)胞是原初CD8+T細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)一步與GM-CSF和 IL-4、干擾素a、抗原及其組合接觸。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述T細(xì)胞增加IL-IO、 IL-15的分泌。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述T細(xì)胞增加4-1BBL的表面表達(dá)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述T細(xì)胞在暴露于用抗CLEC-6 抗體或其片段激活的樹(shù)突細(xì)胞時(shí)增殖。
33. 由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的抗CLEC-6免疫球蛋白或其部分和與所述免 疫球蛋白結(jié)合的抗原。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的免疫球蛋白，其中所述抗原特異性結(jié)構(gòu)域包括全 長(zhǎng)抗體、抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段， 以及Fabc片段和/或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的Fab片段。
35. —種疫苗，其包含由CLEC-6特異性抗體或其片段激活的樹(shù)突細(xì)胞。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的疫苗，其中所述疫苗選自SEQIDNO: 1-7。
37. —種模塊式rAb載體，其包含CLEC-6特異性抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種或多種包含粘附蛋白-錨定蛋白結(jié)合對(duì)的一半的抗原載體 結(jié)構(gòu)域連接。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37的rAb,其中所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體 的至少一部分。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37的rAb,其中所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與粘 附蛋白-錨定蛋白結(jié)合對(duì)的 一半構(gòu)成融合蛋白的抗體的至少一部分。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37的rAb,其還包含與抗原結(jié)合的粘附蛋白-錨定蛋 白結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)性一半，所述抗原與模塊式rAb載體形成復(fù)合物。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37的rAb，其還包含與抗原構(gòu)成融合蛋白的粘附蛋白 -錨定蛋白結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)性一半。
42. 根據(jù)權(quán)利要求37的rAb，其中所述抗原特異性結(jié)構(gòu)域包括全長(zhǎng)抗體、 抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、Fv片段，以及Fabc 片段和/或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的Fab片段。
43. 單獨(dú)或與共激活劑一起結(jié)合免疫細(xì)胞上的CLEC-6受體，組合激活 抗原呈遞細(xì)胞的試劑用于治療性應(yīng)用的用途。
44. 免疫細(xì)胞上的CLEC-6結(jié)合劑用于制備疫苗的用途，所述CLEC-6 結(jié)合劑與或不與激活劑 一起與 一種或多種抗原連接。
45. 抗CLEC-6劑作為免疫細(xì)胞的共激活劑用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途， 該免疫應(yīng)答是通過(guò)免疫細(xì)胞上表達(dá)的除CLEC-6外的細(xì)胞表面受體引起的。
46. 能夠通過(guò)CLEC-6受體結(jié)合并激活免疫細(xì)胞的抗CLEC-6抗體V區(qū) 序列的用途。
47. 與一種或多種毒性劑連接的CLEC-6結(jié)合劑用于治療性目的的用 途，該治療性目的是處在已知或懷疑由經(jīng)CLEC-6的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)激活 導(dǎo)致的疾病的情況下或在表達(dá)CLEC-6的病理細(xì)胞或組織的情況下。
全文摘要
本發(fā)明包括利用新的抗CLEC-6抗體及其片段用于調(diào)控免疫細(xì)胞的活性的組合物和方法。
文檔編號(hào)C07K17/14GK101668777SQ200880013398
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月23日
發(fā)明者G·祖拉夫斯基, J·F·班徹羅, S·吳, S·祖拉夫斯基, 李大鵬 申請(qǐng)人:貝勒研究院