專利名稱：具有抑菌與抗癌作用的小肽d及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小肽及其應(yīng)用，尤其涉及一種具有抑菌與抗癌雙重活性的小肽D及其應(yīng) 用，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥在全球是一個主要的死亡原因。2004年，癌癥死亡人數(shù)達(dá)740萬(約占所有死 亡人數(shù)的13%)。在各種癌癥中，肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近數(shù)十年發(fā)病率和死亡率 都有明顯增高的趨勢，在我國己經(jīng)成為死亡率最高的癌癥之一?；熀头暖熓鞘中g(shù)切除 之外的兩大治療癌癥的主要方法。目前所使用的絕大多數(shù)化療藥物，對正常細(xì)胞也有毒 性，特別是對那些新陳代謝旺盛的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞和黏膜細(xì)胞。所以腫瘤內(nèi)科醫(yī)生和 藥理學(xué)家所面臨的問題不只是尋找細(xì)胞毒性藥物，而是要尋找在保存宿主重要細(xì)胞及其 功能的情況下能夠選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的藥物。要是沒有耐藥現(xiàn)象或缺乏有選擇性的藥 物，腫瘤的化學(xué)治療很可能就如同抗結(jié)核治療一樣有效(常?？梢酝耆宄腥?。用 于人類的絕大多數(shù)抗癌化療尚未達(dá)到這種理想的狀態(tài)。腫瘤耐藥問題及如何克服化療耐 藥性等問題，仍然是化學(xué)治療學(xué)家關(guān)注的主要問題。
青霉素等抗菌藥物的廣泛使用，大大降低了人類受細(xì)菌感染引起死亡的威脅。也產(chǎn)
生了一些新的問題，其中最主要的是細(xì)菌耐藥性，致病菌的耐藥性己經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅
著人類的健康。所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的耐藥性致病株系，尋找全新類型的抗
生素是解決耐藥性問題的一條有效途徑。
近幾十年來,肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視。大量研究結(jié)果表明，蛋白
質(zhì)攝入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同時發(fā)現(xiàn)，多肽被吸收 的速度比同組成的氨基酸要快。多肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長和生殖等各個領(lǐng) 域,可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、衛(wèi)生、保健、食品、、化妝品等方面。多肽類藥物的主要特 點(diǎn)是用量小，生物活性強(qiáng)，對癌癥、自身免疫性疾病、記憶力減退、精神失常、高血壓和 某些心血管及代謝等疾病有顯著的療效和廣泛的應(yīng)用前途。隨著醫(yī)學(xué)及生化技術(shù)的發(fā)展， 多肽類藥物將成為21世紀(jì)重要的診斷、監(jiān)測、預(yù)防和治療藥。因此，開展多肽藥物的研 究具有重要意義。多肽類藥物的研究主要包括抗腫瘤多肽、抗菌性活性肽、多肽導(dǎo)向藥 物、多肽疫苗、細(xì)胞因子模擬肽、診斷用多肽及其它藥用小肽等7大類。

發(fā)明內(nèi)容
基于肽類藥物的基本特性以及癌癥與細(xì)菌感染臨床治療中的需要，本發(fā)明的目的是 提供一種具有抑菌與抗癌雙重活性的小肽(命名為小肽D)及其應(yīng)用。
本發(fā)明的小肽具有抗腫瘤細(xì)胞生長與抗細(xì)菌生長的活性，同等濃度下對人正常細(xì)胞 生長無抑制活性?？梢杂糜诎┌Y與細(xì)菌感染的治療以及用作動植物轉(zhuǎn)基因源頭序列和詞 料與食品、化妝等行業(yè)的添加劑。
本發(fā)明所述具有抑菌與抗癌雙重活性的小肽D，其特征在于它是SEQIDNO. l所
示的氨基酸序列；其所示信息為(a) 序列特征
*長度6氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型蛋白質(zhì)
(c) 序列描述SEQ ID NO. 1
Ser Gly His Thr Gly Pro 。 本發(fā)明提供的多肽氨基酸數(shù)目小于10個，不需任何修飾連接，為線性多肽，且
人工合成方便；試驗(yàn)證明具有抑菌與抗癌細(xì)胞生長兩種功能，同時對人正常細(xì)胞無毒 性。
本發(fā)明所述小肽D在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
功能實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明所述小肽D能抑制肺癌、胃癌、宮頸癌細(xì)胞株的生長，提示 其在癌癥臨床治療中具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價值。
上述制備抗癌藥物中的應(yīng)用中，所述抗癌藥物優(yōu)選是抗肺癌藥物。 進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明的小肽D對肺癌細(xì)胞株及人肺癌紫杉醇抗性株
H460taxR的生長有較明顯的抑制作用，同等濃度下對人正常成纖維細(xì)胞生長無有影響， 揭示本發(fā)明的小肽D為制備治療具有紫杉醇抗性的肺癌相關(guān)的藥物奠定了基礎(chǔ)并在肺癌
臨床治療中具有關(guān)闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明所述小肽D在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
功能實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明所述小肽D可以抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和霉菌等
多種致病菌的生長，為新型抗菌藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
上述制備抗菌藥物的應(yīng)用中，所述抗菌藥物優(yōu)選是抗革蘭氏陰性菌和/或抗革蘭氏 陽性菌藥物。
本發(fā)明所述小肽D在制備轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)已證實(shí)本發(fā)明的小肽D有抑菌和抗癌細(xì)胞生長作用；因此本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員根據(jù)氨基酸與密碼子的對應(yīng)關(guān)系反推而成的核酸序列可以作為功能基因用于制備轉(zhuǎn) 基因動物及植物，創(chuàng)造新品種及表達(dá)功能蛋白。
本發(fā)明所述小肽D在制備飼料、食品或化妝品用添加劑中的應(yīng)用。
鑒于本發(fā)明所述的小肽D有抑菌和抗癌細(xì)胞生長作用；因此本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可 以人工大量合成后，作為有抑菌效果的飼料、食品或化妝品用添加劑在工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中使用。


圖1. 2354號肽(小肽D)對Hela細(xì)胞生長的抑制作用，其中1為正常對照；2為 加小肽D作用后結(jié)果。
圖2. 2354號肽(小肽D)對H460texR和NHFB細(xì)胞生長的抑制作用檢測。 圖3. 2354號肽(小肽D)對大腸桿菌生長的抑制作用檢測。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1: 多肽的設(shè)計(jì)與合成
1、 提取國際主要抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http:〃鄰s. u咖c. edu/AP/main. php ; http://penbase.immunaqua.com/ ; http:〃www. bbcm. univ. trieste. it/ ; http:〃www. imtech. res. in/raghava/antibp/)中登陸的抗菌肽的序列，分析其一級結(jié) 構(gòu)與活性的關(guān)系的對應(yīng)關(guān)系，同時設(shè)計(jì)人工短肽序列。
2、 利用蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫http:〃www.e鄧asy.org/，分析已知活性的多肽序列與設(shè) 計(jì)的多肽序列的二級結(jié)構(gòu)的相似度，結(jié)合其它物理化學(xué)參數(shù)預(yù)測進(jìn)行設(shè)計(jì)序列的修正。
3、 多肽序列送至生物公司合成或利用自動多肽合成儀合成全序列。HPLC檢測純度要 大于96%，同時通過質(zhì)譜檢測確定多肽合成質(zhì)量。樣品以凍干狀態(tài)保存。
4、 合成后的多肽進(jìn)行抑菌及抗癌功能檢測篩選。
5、 通過功能檢測，最終獲得具有抑菌及抗癌雙重功能的多肽序列，試驗(yàn)序列號為 2354號肽，本發(fā)明中命名為小肽D，其氨基酸序列為Ser Gly His Thr Gly Pro 。
實(shí)施例2: 利用MTT法檢測多肽體外抑癌活性
2. 1材料與試劑
1) 2354號肽(本發(fā)明中命名為小肽D)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成
2) H460細(xì)胞(人非小細(xì)胞肺癌株系)、H460taxR細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞H460株系，抗紫杉 醇)、NHFB細(xì)胞(人正常成纖維細(xì)胞株系)、Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)，SGC-7901 細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞株系)，中國科學(xué)院細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源 中心。
3) RPMI1640培養(yǎng)基，為美國GIBCO公司產(chǎn)品
4) DMEM培養(yǎng)基，為美國HyClone公司產(chǎn)品
5) 新生小牛血清，為杭州四季青公司產(chǎn)品
6) 二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑(MTT)和胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品。 2.2實(shí)驗(yàn)
1) 用稀釋液(無菌PBS或無菌水或者相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基)將2351號肽稀釋至lmM的初 始測量濃度，過濾除菌，分裝后-2(TC凍存。
2) 細(xì)胞培養(yǎng):癌細(xì)胞于含10。/。小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(含IOO U/mL青霉素和鏈霉 素)培養(yǎng)，細(xì)胞每2—3天傳代1次；正常細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4-5天傳代一次。 細(xì)胞生長呈80%左右融合狀態(tài)時，采用胰酶消化的方法消化分離細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基 制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整合適的細(xì)胞濃度，分瓶傳代，置于37。C、體積分?jǐn)?shù)為5%0):的濕 化環(huán)境中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時用對數(shù)生長期細(xì)胞。
3) 細(xì)胞已貼壁后，棄去孔中原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有梯度稀釋(在初始濃度基 礎(chǔ)上以10倍體積稀釋)肽的100pL培養(yǎng)基。陰性對照組加入含有同等濃度稀釋液的同體
5積培養(yǎng)基，C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
4) 顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，然后每孔加入20ial (5mg/mL) MTT溶液。培養(yǎng)4h。
5) 小心吸盡孔中液體，每孔加入150pl DMSO，置于WD-9405B型水平搖床上輕搖 10min，以便紫色結(jié)晶充分溶解于DMSO中。
6) 使用Model680酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值，記錄數(shù)據(jù)。
7) 利用sigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。
結(jié)果顯示，2354號肽(本發(fā)明中命名為小肽D)在小于lmM濃度下能抑制肺癌、胃癌、 宮頸癌細(xì)胞株的生長，對肺癌細(xì)胞紫杉醇抗性株H460texR的半數(shù)致死濃度為lmM，同等 濃度下人正常成纖維細(xì)胞存活率為98%。結(jié)果見附圖l。顯微鏡觀察可見癌細(xì)胞生長速率 降低，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)小泡及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。
本發(fā)明的小肽D序列具有的對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力使其可以直接用于制備癌 癥治療的臨床藥物，或者開發(fā)為聯(lián)合化療的臨床藥物使用，有較好的應(yīng)用前景。
實(shí)施例3 :
利用液體生長抑制法檢測多肽的抑菌活性
3. 1材料、試劑
1) 氨節(jié)青霉素(Amp)為solarbio公司產(chǎn)品， 一次性濾器，為美國PALL公司產(chǎn)品，其它 藥品試劑為國產(chǎn)分析純。
2) 選用革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(^ c/〃zw^6"/" "/^e"6erg) Co/2")、金黃色
葡萄球菌(S啤/^/0C"C0C2^ "騰M51 i OMw6fl(c/z)、藤黃微球菌(M/CTOCOC冊/她M)、
蘇云金芽抱桿菌(^Sacz'/ZiAy ^mn>7gz'e/xs7\y)、巨大芽胞桿菌( 8ac///"5i附egafer/w附)；革蘭 氏陰性菌大腸桿菌(五w/^/c/2/flco//)、弧菌(W6n'o)、肺炎克氏桿菌(i/^wW/a /7腿附ow/ae);真菌茄病鐮刀菌(,固"'"/z so7,')、尖孢鐮刀菌(flwsri咖o，p。i""/H)、 瓜類炭疽病菌W2"etric/ i/ffl J柳/7arj'"歷)、蘋果炭疽病菌(67。easpori咖a化咖) 棉花黃萎病菌(KerWcj7h'咖ofe/Jj'ae)進(jìn)行測試。山東大學(xué)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌 種室提供。
3) 封閉液 0.4%BSA (w/v) ， 0.02%冰醋酸，配制后過濾除菌。
4) PB液體培養(yǎng)基
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 氯化鈉(NaCl) 5g/LPH 7.4-7.6
3.2實(shí)驗(yàn)
1) 向無菌96孔酶標(biāo)板所使用的孔中加入200nL封閉液，室溫封閉24h。
2) 用PB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)不同的細(xì)菌，轉(zhuǎn)培養(yǎng)使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。用PB培養(yǎng)基 調(diào)整菌液OD60()為約0.002。
3) 棄去封閉液,每孔加9(HiLOD,約為0.222的含菌PB培養(yǎng)基，再加入10pL無菌水配好的 不同濃度梯度(初始濃度lmM)的本發(fā)明的小肽D。陰性對照為90pL含菌培養(yǎng)基+l(HiL 無菌水；陽性對照為90pl含菌培養(yǎng)基+10nL濃度為0.25mg/mL氨芐青霉素溶液(終濃 度為0.025mg/mL,約62pM )。
4) 將加好菌液和藥品的酶標(biāo)板置于28'C搖床，100rpm恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后0h、 3h、12h、 15h、 24h、 36h，用BIOTEKELX800酶標(biāo)儀測定每孔的630nm吸光值(OD630)。 5)利用sigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。
結(jié)果表明，本發(fā)明的小肽D對革蘭氏陽性菌(以枯草芽孢桿菌為例)抑菌效果有濃 度依賴效應(yīng)，濃度越大，抑菌效果越強(qiáng)。在50uM濃度時短期抑菌效果(3小時)要優(yōu) 于氨芐青霉素(60nM)對照，長期抑菌效果G6小時)與對照相同；對革蘭氏陰性菌 (以大腸桿菌為例)，抑菌效果也有濃度依賴效應(yīng)，濃度越大，抑菌效果越強(qiáng)。50uM 濃度時，抑菌效果在3小時后始終優(yōu)于氨芐青霉素(62ixM)對照的抑菌效果。對真菌 的抑菌效果與革蘭氏陰性菌的類似。顯示了該小肽可用于制備相關(guān)的臨床用新型抗菌藥 物。
實(shí)施例4:
小肽序列用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的核酸序列及其使用方法
由于本發(fā)明的小肽D為線性序列，無任何修飾，根據(jù)密碼子表，此小肽可以由其氨 基酸對應(yīng)的三聯(lián)體密碼堿基序列的任意組合獲得相應(yīng)的核酸序列，根據(jù)密碼子的簡并 性，相對該序列可以獲得的核酸序列可達(dá)64左右。然后將此核酸序列通過載體或直接注 射入需要轉(zhuǎn)入基因的動物、植物或微生物體內(nèi)，使遺傳信息進(jìn)行翻譯表達(dá)便可。此方面 已有成熟、詳細(xì)的方法，視具體生物品種參照操作指南執(zhí)行。
例如以轉(zhuǎn)基因微生物為例，簡述如下，由本發(fā)明的小肽D可以獲得如下核酸序列-
5'ttacatcatgctattgct3'，將此核酸序列人工合成后，以常規(guī)方法連入基因工程載體如大腸 桿菌的表達(dá)載體pET30a，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3),獲得陽性克隆后，過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)培養(yǎng)3-4 小時后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，便可獲得轉(zhuǎn)入此核酸片段，同時有外源多肽產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因 微生物新品種。序列表
<110>山東大學(xué)
〈120〉具有抑菌與抗癌作用的小肽D及其應(yīng)用 <141〉 2009-9-10 〈■ 1 〈210〉 1 〈211〉 6 〈212〉 PRT 〈221〉人工序列 〈222〉 (1)…(6) 〈400〉 1 Ser Gly His Thr Gly Pro 權(quán)利要求
1.一種具有抑菌與抗癌雙重活性的小肽D，其特征在于它是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度6氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.1Ser Gly His Thr Gly Pro。
2. 權(quán)利要求l所述小肽D在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗癌藥物是抗肺癌藥物。
4. 權(quán)利要求1所述小肽D在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗菌藥物是抗革蘭氏陰性菌和/或 抗革蘭氏陽性菌藥物。
6. 權(quán)利要求1所述小肽D在制備轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述小肽D在制備飼料、食品或化妝品用添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抑菌與抗癌雙重活性的小肽D，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述小肽D在較低濃度下具有抗癌與抑菌活性的多肽序列，在相應(yīng)濃度時對人正常細(xì)胞的生長無影響。本發(fā)明還公開了所述小肽在制備抗癌和抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，在制備轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用以及在制備飼料、食品和化妝品用添加劑中的應(yīng)用。
文檔編號C07K7/00GK101648990SQ20091001875
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者孟令軍, 康翠潔, 王金星 申請人:山東大學(xué)