專利名稱：一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的苯并雙萘醌衍生物，其制備方法以及它們?cè)诳鼓[瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胡桃楸(Juglans mandshurica)又名山核桃，為胡桃科、胡桃屬植物，主要分布在東北海拔300-800米的溝谷兩岸及山麓濕潤沃土地帶。用胡桃皮、胡桃枝作為抗癌民間驗(yàn)方，歷史源遠(yuǎn)。其樹皮味苦、辛、性寒，關(guān)于胡桃楸有效化學(xué)成分的研究報(bào)道，主要集中在對(duì)胡桃果皮(青龍衣)的開發(fā)研究，其化學(xué)成分主要含有胡桃醌(G10H6O3)、黃酮甙、鞣質(zhì)及沒食子酸等。近年來，國內(nèi)外學(xué)者又從核桃楸的根及樹皮中分離鑒定出二芳基庚酮糖，萘醌，倍半萜烯等化合物，并對(duì)這些化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明部分化合物具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，但對(duì)其具體的作用機(jī)理未見報(bào)道。
對(duì)胡桃楸抗腫瘤的活性機(jī)理的研究，焦點(diǎn)一是鞣酸對(duì)細(xì)胞循環(huán)、DNA合成、凋亡和過度增殖的抑制的研究；二是胡桃醌的抗腫瘤機(jī)理研究，主要集中于肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPI)失活的機(jī)理，PPI的組分Pinl是腫瘤細(xì)胞存活和進(jìn)入有絲分裂所必須的酶。
胡桃楸的枝葉具有清熱解毒、明目醒腦、抗癌的作用。但國內(nèi)外對(duì)胡桃楸的葉子的研究較少。僅在1994年，有報(bào)道從胡桃楸的葉子里分離出二十九烷醇、二十八烷醇-2、β-谷甾醇、胡桃醌、3-甲氧基-7-甲基胡桃醌和琥珀酸等，但未對(duì)各化學(xué)成分的活性做進(jìn)一步研究。因此，本發(fā)明人經(jīng)過活性篩選，確定以胡桃楸的初春嫩葉為原料，采用提取、分離純化過程與細(xì)胞活性檢測(cè)相結(jié)合的方法，最終獲得具有抗腫瘤活性的單一化合物，并采用質(zhì)譜與高分辨核磁共振技術(shù)，確定了該化合物的結(jié)構(gòu)，命名為對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供一類新的具有藥用價(jià)值的苯并雙萘醌衍生物。
本發(fā)明的另一目是提供一種從胡桃楸中提取R1，R2，R3為氫，R4為CH3的本發(fā)明化合物的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供本發(fā)明化合物在治療腫瘤方面的用途。
本發(fā)明人從胡桃楸的葉子中分離出一種新的苯并雙萘醌衍生物，該化合物具有抗腫瘤的藥物活性。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物，其結(jié)構(gòu)通式(I)如下
其中R1，R2，R3，R4為氫、R5、COR5或C3～C8的單糖；其中R5為(CH2)n-R6；R6為H、R7、-OR7、NHR7、N(R7)2、N(R7)3+X-、-S-R7、OH、NH2、Cl、Br、I、CN、NO2、SO3M；R7為C1～C12的烷基、COR5、R5；X為Cl-、Br-、I-、ClO4-、SO3CH3-、SO3C2H4PCH3-，其中，n＝1～12，M＝Na、H、K、Ca、Mg、Zn、Li、Cu。所述的R1，R2，R3為氫，R4為CH3。上述C1～C12的烷基是指具有1～12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁酰、叔丁基、戊基等。
上述C3～C8的單糖是指具有3～8個(gè)碳原子的醛糖或酮糖，例如甘油醛、核糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木酮糖、果糖、辛酮糖等。R1，R2，R3為?；谋景l(fā)明化合物可以上述R1，R2，R3為氫的產(chǎn)品為原料，按照化學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法酰化而制得。例如在溶劑吡啶中用酸酐進(jìn)行?；?。R1，R2，R3為C3～C8的單糖的本發(fā)明化合物可以上述R1，R2，R3為氫的產(chǎn)品為原料，按照化學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法脫水縮合而制得。例如在堿性的條件下與葡萄糖反應(yīng)脫水縮合成糖苷。
R1，R2，R3為取代烷基的本發(fā)明化合物可以上述R1，R2，R3為氫的產(chǎn)品為原料，按照化學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法而制得。例如堿性的條件下與鹵代醇反應(yīng)成醚。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物是其中R1，R2，R3為氫，或C1～C4的酰基，C1～C4的醇代烷基，或己糖，R4為CH3的式(I)化合物。最優(yōu)選的是，其中R1，R2，R3為氫、乙?；?、乙醇基和葡萄糖，R4為CH3的式(I)化合物。其中R1，R2，R3為氫，R4為CH3的本發(fā)明化合物是從胡桃楸中提取而得到的，制備所述的R1，R2，R3為氫，R4為CH3時(shí)的一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物的方法，該方法包括以下步驟a將胡桃楸的葉子在乙醇中浸泡；b將胡桃楸的乙醇提取液濃縮后用水分散，依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯萃??；c將乙酸乙酯相用硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集氯仿∶甲醇＝4∶1洗脫下的紅色餾分；d、將c中的紅色餾分用葡聚糖LH-20色譜柱純化，用甲醇洗脫，收集紅色組分；f、將d中的紅色組分通過硅膠H減壓柱，以氯仿∶甲醇＝4∶1為洗脫劑，壓力0.02MPa，收集Rf值為0.45的洗脫液；h、將f中的洗脫液用高效液相色譜純化，高效液相色譜固定相采用C18反相色譜柱，在高效液相色譜上以乙腈—水為流動(dòng)相，梯度洗脫，從100％的水洗到100％的乙腈，流速為0.8-1ml/min，檢測(cè)波長為280nm，定性參數(shù)為保留時(shí)間，收集相應(yīng)的色譜峰，得到純度為95％-98％的該化合物。
本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用且對(duì)正常細(xì)胞具有較低的毒性。可用作制備抗癌藥物的用途。
本發(fā)明的有益效果是，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。為研究開發(fā)新的抗癌藥物提供了先導(dǎo)化合物，有利于進(jìn)一步開發(fā)天然藥物資源。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌的制備將100千克胡桃楸(Juglans mandshurica)的初春鮮嫩葉與400千克95％的乙醇浸泡48h，把乙醇浸泡液濃縮至浸膏狀，用水分散，再用石油醚，氯仿，乙酸乙酯依次萃取。將乙酸乙酯相濃縮，用干法上樣法，通過硅膠色譜柱，用氯仿-甲醇梯度洗脫，收集氯仿∶甲醇＝4∶1洗脫下的洗脫液，將該洗脫液濃縮后，通過sephadex LH-20色譜柱，用甲醇洗脫，收集紅色組分。將該紅色組分通過硅膠H減壓柱，以氯仿∶甲醇＝4∶1為洗脫劑，壓力0.02MP，收集Rf值為0.45的洗脫液。該洗脫液進(jìn)一步用高效液相色譜純化，高效液相色譜固定相采用C18反相色譜柱，在高效液相色譜上以乙腈—水(0.1％三氟乙酸)(0∶100-100∶0)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1ml/min，檢測(cè)波長280nm，定性參數(shù)為保留時(shí)間，收集相應(yīng)的色譜峰，得到含量為98％的本發(fā)明化合物，共500mg，該化合物為紅色針晶(甲醇)。
分子式為C23H12O8m.p.＞300℃ 高分辨質(zhì)譜M+＝416.0531IR(KBr)3579，3513，2958，2925，1721，1621，1583，1465，1262，769，703，685UV(MeOH)λmax280nm 390nm 480nm1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm3.01(s，3H，OCH3)，7.16～7.60(m，6H，芳香H)，13.76(s，2H，ph-OH)13CNMR (DMSO-d6)碳ppm1，1’179.472，2’127.703，3’134.684，4’184.895，5’161.796，6’123.037，7’134.688，8’117.259，9’122.8710，10’ 117.721” 167.892” 123.72
OCH351.65實(shí)施例21”-甲氧基-5，5’，2”-乙酰氧基-苯并雙萘醌的制備將100mg上述實(shí)施例的產(chǎn)物溶于10ml吡啶，向其中加入500mg乙酸酐，攪拌4小時(shí)后得到96mg目的產(chǎn)物，為紅色結(jié)晶固體。m.p.＞300℃。質(zhì)譜和各種光譜數(shù)據(jù)表明該產(chǎn)物是上述實(shí)施例化合物1的乙酸酯。
分子式為C29H18O11高分辨質(zhì)譜M+＝542.0431IR(KBr)2934，2912，1781，1711，1641，1590，1483，745，710，1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm2.08(s，，9H，CH3)3.01(s，3H，OCH3)，7.16~7.60(m，6H，芳香H)。
13CNMR (DMSO-d6)碳ppm1，1’182.202，2’124.303，3’132.684，4’182.895，5’153.806，6’125.137，7’132.618，8’126.259，9’134.7010，10’ 127.721” 160.592” 143.70OCH355.65CO169.10CH320.32實(shí)施例3雙胡桃醌并1’’-甲氧基-苯-2’’-0-吡喃葡萄糖苷的制備稱取氫氧化鈉1.2g和碘化鉀0.1g溶于20ml水中，再稱取實(shí)施例1中的產(chǎn)物0.2g，在磁力攪拌下分批加入上述堿溶液中，得淡紅色懸濁液，再加入20mL丙酮，溶液變澄清透明。稱取α一溴代乙酰葡萄糖2.63g，溶于20ml的丙酮中，通過恒壓漏斗慢慢滴入上述堿溶液中，反應(yīng)12小時(shí)后，TLC檢測(cè)，(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)，反應(yīng)完全，減壓蒸餾蒸去丙酮，將剩余物倒入冰水混合物中，充分?jǐn)嚢?，有固體析出，抽濾，將所得固體壓碎后用飽和碳酸鈉溶液洗2-3次，用乙醇溶解，重結(jié)晶，得到的固體溶于10mL甲醇中，滴入甲醇鈉溶液(50mg金屬鈉加到100mL的甲醇中)0.5mL，2.5小時(shí)后TLC檢測(cè)(氯仿∶甲醇＝10∶1)，水解完全，蒸去甲醇，硅膠柱層析(洗脫液∶氯仿∶甲醇＝7∶1)，得產(chǎn)物0.09g。由質(zhì)譜和各種光譜數(shù)據(jù)表明該產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。
分子式為C29H22O13高分辨質(zhì)譜M+＝578.1529IR(KBr)3479，2954，2929，1711，1653，1601，1449，745，7151H NMR(DMSO-d6)δ，ppm13.08(s，2H，ph-OH)3.12(s，3H，OCH3)，7.16～7.60(m，6H，芳香H)，糖基部分3.4～3.8(t，4H，CH)，3.79(d，2H，CH2)，5.88(d，1H，CH)，4.1(s，4H，OH)。
13CNMR (DMSO-d6)碳ppm1，1’182.292，2’123.903，3’131.984，4’183.095，5’152.906，6’125.537，7’133.028，8’125.859，9’134.8710，10’ 128.121” 161.192” 152.70OCH355.65糖基C 59.3～102.2實(shí)施例41”-甲氧基-5，5’，2”-乙醇氧基-苯并雙萘醌的制備將100mg上述實(shí)施例的產(chǎn)物溶于10ml氫氧化鈉，向其中加入500mg氯乙醇，攪拌2小時(shí)后得到105mg目的產(chǎn)物，為紅色結(jié)晶固體。m.p.＞300℃。質(zhì)譜和各種光譜數(shù)據(jù)表明該產(chǎn)物是目的產(chǎn)物。
分子式為C29H24O11高分辨質(zhì)譜M+＝548.0609IR(KBr)3567，3524，2915，2909，1734，1681，1596，1476，745，7101H NMR(DMSO-d6)δ，ppm3.98～4.15(t，12H，CH2CH2)，3.01(s，3H，OCH3)，7.16~7.60(m，6H，芳香H)，4.3(s，3H，OH)。
13CNMR (DMSO-d6)碳ppm1，1’182.102，2’124.653，3’132.144，4’182.915，5’158.106，6’125.337，7’132.548，8’126.549，9’134.60
10，10’127.721” 160.592” 155.60OCH355.65CH271.32CH2OH 69.41實(shí)施例5對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌抑制人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)活性實(shí)驗(yàn)1、MTT法1)細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞從液氮復(fù)蘇后，接種于4×6cm培養(yǎng)瓶中，在37C、5％C02的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基是RPMI1640補(bǔ)加10％滅活FBS、100U/ml青霉素、以及100mg/l鏈霉素。細(xì)胞每隔一天更換培養(yǎng)液，傳代時(shí)，先倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25％胰蛋白酶37℃消化2~3min，待消化完全后加入含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打數(shù)次，使細(xì)胞完全分散。倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2)用對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌處理Hela細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/ml的濃度接種于96孔板，每孔100μl，在37℃、5％CO2的孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，加不同濃度藥物，處理不同時(shí)間，以僅添加培養(yǎng)液孔做空白對(duì)照，每組4復(fù)孔，重復(fù)3次，加入藥物終濃度如下2.3Mm，5.9μM，9.2μM，11.4μM，13.6μM，16.8Mm，21.8μM，26.7μM3)加入MTT及用酶標(biāo)儀測(cè)量Hela細(xì)胞分別用不同濃度藥物處理24h，48h，72h后，棄去上清液，用PBS洗1遍，每孔加入90μl的新鮮培養(yǎng)基和10μl的MTT(5mg/ml，用1×PBS配制)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO 100μl，輕輕振蕩后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長的吸光值。根據(jù)下面的公式計(jì)算，繪圖求得IC50 對(duì)照孔—僅加細(xì)胞不加藥物空白孔—僅加培養(yǎng)基不加細(xì)胞和藥物實(shí)驗(yàn)孔—加細(xì)胞再加藥物結(jié)果表明對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌對(duì)人宮頸癌細(xì)胞有抑制作用，Hela細(xì)胞24h，48h，72h的IC50分別為13.1μM，10.3μM，8.9μM。
2、形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105/ml接種到24孔板中。每孔500μl，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別加入終濃度為16.8μM的對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌，作用48h，倒置顯微鏡下觀察。
倒置顯微鏡觀察結(jié)果Hela細(xì)胞加入對(duì)羥基甲氧基苯并雙胡桃醌溶液，作用48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增加減緩，倒置顯微鏡下單位面積的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞體積變小，變形，細(xì)胞膜完整，但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
權(quán)利要求
1.一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)通式(I)如下 其中R1，R2，R3，R4為氫、R5、COR5或C3～C8的單糖；其中R5為(CH2)n-R6；R6為H、R7、-OR7、NHR7、N(R7)2、N(R7)3+X-、-S-R7、OH、NH2、Cl、Br、I、CN、NO2、SO3M；R7為C1～C12的烷基、COR5、R5；X為Cl-、Br-、I-、ClO4-、SO3CH3-、SO3C2H4PCH3-，其中，n＝1～12，M＝Na、H、K、Ca、Mg、Zn、Li、Cu。
2.按照權(quán)利要求1所述的一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物，其特征在于，所述的R1，R2，R3為氫，R4為CH3。
3.制備權(quán)利要求2所述的一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a將胡桃楸的葉子在乙醇中浸泡；b將胡桃楸的乙醇提取液濃縮后用水分散，依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯萃??；c將乙酸乙酯相用硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集氯仿∶甲醇＝4∶1洗脫下的紅色餾分；d、將c中的紅色餾分用葡聚糖LH-20色譜柱純化，用甲醇洗脫，收集紅色組分；f、將d中的紅色組分通過硅膠H減壓柱，以氯仿∶甲醇＝4∶1為洗脫劑，壓力0.02MPa，收集Rf值為0.45的洗脫液；h、將f中的洗脫液用高效液相色譜純化，高效液相色譜固定相采用C18反相色譜柱，在高效液相色譜上以乙腈—水為流動(dòng)相，梯度洗脫，從100％的水洗到100％的乙腈，流速為0.8-1ml/min，檢測(cè)波長為280nm，定性參數(shù)為保留時(shí)間，收集相應(yīng)的色譜峰，得到純度為95％-98％的該化合物。
4.按照權(quán)利要求1-2所述的一類具有抗癌活性的苯并雙萘醌衍生物，其特征在于，其可用作制備抗癌藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的苯并雙萘醌衍生物，其中R
文檔編號(hào)C07C69/18GK1951896SQ20061013427
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2006年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月11日
發(fā)明者安利佳, 李智博, 包永明, 王靜云, 楊君 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)