專利名稱：從血清和血漿中制備dna的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從血清和血漿中制備DNA的方法，特別是在擴增反應(yīng)中用作目的DNA的DNA制備方法。
擴增和檢測核酸領(lǐng)域的技術(shù)進展十分迅速，特別當(dāng)其涉及對感染性疾病、癌癥和遺傳疾病提供早期檢測的商業(yè)診斷試驗時。目前已經(jīng)知道少量核酸的擴增，例如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))已相當(dāng)成熟的技術(shù)(參見美國專利號4683195；4683202；和4965188)。PCR的內(nèi)在靈敏性，即其擴增非常低濃度的目的DNA的能力，意味著PCR產(chǎn)物低水平的遺留以及樣品間的污染可以產(chǎn)生假陽性結(jié)果。在所有因素中，遺留和樣品污染是處理過程中所需的樣品操作次數(shù)的指標(biāo)。因此，具有使樣品暴露于周圍環(huán)境的最少次數(shù)的簡單程序是非常理想的。
傳統(tǒng)上，已經(jīng)就由全血得到的外周血白細(xì)胞(WBC)中經(jīng)PCR鑒定了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染引起的病毒血癥，并鑒定了其它病毒和細(xì)菌。在從WBC中提取HCMV DNA之前，通常需要從全血中分離WBC。這種分離程序包括紅細(xì)胞在葡聚糖溶液中的沉降(Rasmussen等，傳染病雜志.171177-82，1995)，用氯化銨溶液差別溶解(美國專利號5702884，Ekeze等)，或者應(yīng)用商業(yè)提供的方法(例如，來自Becton-Dickinson的CPT-VacutainerTM試管)。這些方法通常包括除去擴增的潛在抑制物的清洗步驟；或者，分離WBC以便除去這些抑制物，所述抑制物通常以高濃度存在于血漿或血清中。
分離出WBC后，溶解并提取DNA。這包括以下程序，例如煮沸、超聲、或WBC的冷凍干燥，或者應(yīng)用蛋白溶解酶和/或表面活性劑溶解細(xì)胞，然后提取DNA。提取DNA還可以應(yīng)用堿溶步驟(美國專利號5639599)。通常進行更嚴(yán)格的提取/純化步驟以便進一步確保純化到的DNA不含潛在抑制物，這些步驟包括，例如，應(yīng)用玻璃珠(Gene Clean II試劑盒，Bio 101，Inc.)、酚-氯仿提取程序、聚合物捕獲(美國專利號5582988)，旋轉(zhuǎn)柱吸附(Qiagen QLAamp試劑盒)，以及其它商業(yè)提供的DNA分離試劑盒(Puregene，Gentra SystemsInc.)。
值得注意的是，用于從WBC制備物中清洗掉或除去潛在抑制物的分離和溶解WBC的程序不能被用于血漿和血清。由于大量內(nèi)源性生化物質(zhì)和服用藥物、藥物的代謝產(chǎn)物等在血清和血漿中保留并嚴(yán)重累積，因此現(xiàn)有技術(shù)需要一種適用于血漿和血清的快速和強效的方法，該方法將除去潛在抑制物或使該抑制物失效。
感染個體中的胞外HCMV核酸存在于血漿和血清中。選擇血漿和血清作為PCR檢測HCMV核酸的樣品正逐步被接受。通常，目的DNA不以游離DNA的形式存在，而作為與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合聯(lián)合體的形式存在。必須從復(fù)合物中提取DNA，然后變性，以便使其適用于擴增反應(yīng)。通常對血清和血漿樣品進行加熱、表面活性劑處理、和蛋白酶處理。常使用另外一些精確的方案提取目的DNA，例如前面描述WBC時提到的那些(Spector等，臨床微生物學(xué)雜志，302359-65，1992；Nolte等，臨床微生物學(xué)雜志，331263-66，1995；Wolf等，移植，56330-4，1993；Patel等，臨床微生物學(xué)雜志，321431-4，1994)。堿處理也曾被使用。然而，堿處理通常需要高NaOH濃度，隨后需要中和步驟(Hansen等，傳染病雜志1701271-4，1994)。
因此，現(xiàn)有技術(shù)需要一種快速有效地從血清和血漿中提取DNA的并與PCR擴增方法相容的方法。
本發(fā)明提供了一種從血清或血漿樣品中提取DNA的方法。該方法包括(i)將血清或血漿與堿接觸，以制備堿化的血清或血漿；(ii)將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘；(iii)離心加熱的堿化血清或血漿；和(iv)提取含DNA的上清液。
在一個優(yōu)選的方面，在離心加熱的堿化血清或血漿之前，在步驟(iii)離心之前，將由步驟(ii)制備的加熱的堿化血清或血漿放冷，或冷卻至室溫，即25EC。
另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測在血清或血漿中可能存在含DNA的微生物，例如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的方法。該方法包括(i)將血清或血漿與堿接觸，以制備堿化的血清或血漿；(ii)將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘；(iii)離心加熱的堿化血清或血漿；(iv)提取含DNA的上清液；(v)用識別微生物DNA中的序列的寡核苷酸引物擴增上清液中的DNA以形成微生物特異性的擴增引物；和(vi)檢測擴增產(chǎn)物，其中特異于微生物的擴增產(chǎn)物的檢測表明血清或血漿中存在微生物。
在一個優(yōu)選的方面中，在步驟(ii)之后，步驟(iii)的離心之前，使加熱的堿化血清或血漿放冷或冷至室溫，即約25EC。
本發(fā)明提供了一種從血清和血漿樣品中簡便、快速、高效地提取DNA的方法，該方法使得到DNA制備物不需進一步操作即可適用于隨后的檢測分析。
該方法包括以下步驟(i)將血清或血漿與堿接觸，以制備堿化的血清或血漿；(ii)將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘；(iii)離心加熱的堿化血清或血漿；和(iv)提取含DNA的上清液。
優(yōu)選在加熱之后，離心之前，使加熱的堿化血清或血漿冷卻或冷至室溫，即約25EC。冷卻可以是消極的，即僅用室內(nèi)空氣平衡，也可以是積極的，即可以離心加熱的堿化血清或血漿、或?qū)⒓訜岬膲A化血清或血漿置于冰上、或置于水浴中，直到加熱的堿化血清或血漿的溫度達到室溫。
在本發(fā)明的實踐中，合適的堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、或上述種類的混合物。優(yōu)選使用氫氧化鈉。步驟(i)中制備的混合物中堿的終濃度約為10-90mM范圍內(nèi)，最優(yōu)選約為15-50mM范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的堿濃度約為20mM。一個優(yōu)選方案包括1體積的血清或血漿與約4體積的約25mM的堿水溶液制成混合物。
將加熱堿化的血清或血漿加熱到的溫度優(yōu)選約105EC，時間優(yōu)選約5分鐘。離心步驟優(yōu)選在環(huán)境溫度下約16,000Xg下離心約2分鐘。
可以直接將從離心混合物中提取到的上清液加入PCR擴增混合物中。然而，可以在將上清液加到PCR混合物之前，進一步處理或加入需要的試劑以調(diào)整上清液。本發(fā)明的堿處理用于滅活PCR抑制物并使蛋白質(zhì)變性，特別是導(dǎo)致目的DNA降解至不能被擴增的核酸酶。堿處理還用于使DNA變性，使它更易于與擴增引物雜交，從而進行PCR擴增。另外，本發(fā)明的簡便性極大地降低了樣品間污染以及PCR產(chǎn)物遺留的可能性。本發(fā)明還避免了對大量花費以及核酸常規(guī)分離純化中應(yīng)用的通常不穩(wěn)定的材料的需要。
本發(fā)明可用于制備診斷分析的DNA樣品，具體地說診斷分析是檢測DNA病毒例如巨細(xì)胞病毒、單純性皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、乙肝病毒和一些血液細(xì)菌的分析?？梢允褂肈NA制品的檢測方法包括但不限于任何涉及雜交的方法，包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。因此，本發(fā)明包括檢測含DNA微生物的檢測方法，該方法包括堿化來自受試者的血清或血漿、將堿化的血清或血漿加熱到約100-110EC之間保持約5-20分鐘、離心以便制備含DNA的上清液，收集上清液、用特異于含DNA微生物的DNA的引物擴增上清液中的DNA，從而得到特異于該微生物的擴增產(chǎn)物，然后檢測擴增產(chǎn)物，其中它們的存在表明受試者血液或血清中存在該微生物。
下列實施例說明但不限制本發(fā)明。方法1.血清和血漿樣品將全血樣品收集到含乙烯基二氨基四乙酸(EDTA)或其他抗凝劑(例如肝素和草酸鹽)的Vacutainer TM試管中，用于收集血漿，或者收集不加抗凝劑的全血樣品用于收集血清。
2.樣品的制備將20μl血清或血漿加入裝有80μl包含0.334μg/μl小牛胸腺DNA和每μl內(nèi)部陽性對照(IPC)質(zhì)粒目的DNA的1.67雙鏈拷貝的25mM NaOH溶液的螺旋蓋微量離心管中?；旌弦航?jīng)旋渦振蕩，于105EC加熱5分鐘。使樣品平衡到室溫，室溫下16,000Xg離心2分鐘。將25μl上清液加入75μl PCR反應(yīng)混合物(組成下述)中進行擴增。
3.聚合物捕獲-對照按照美國專利號5582988實施例3中描述的方法應(yīng)用聚合物捕獲法提取DNA，差別在于本試驗應(yīng)用20μl的血清或血漿。使DNA-聚合物復(fù)合物沉淀，棄去上清液(預(yù)期含有PCR的潛在抑制物)。然后用100μl 20mM NaOH溶液從沉淀中洗脫DNA，然后在105EC加熱5分鐘，隨后離心2分鐘。將上清液(25μl)加入75μl的PCR反應(yīng)混合物，進行擴增。聚合物捕獲法作為與本發(fā)明簡便的DNA提取法進行比較的對照。
4.PCR擴增和檢測PCR反應(yīng)混合物pH為8.0，含有160U/ml重組Taq聚合酶，5.28μg/ml TP4-9.2(過量5倍)和53.37μg/ml TPl-12.2抗Taq抗體，18mM Tris緩沖液，54mM氯化鉀，IPC引物(IPC-F1(正向)生物素-5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’<SEQ ID NO1>和IPC-R1(反向)5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’<SEQ ID NO2>)各0.2μM，CMV特異性分析引物(LB42M(正向)序列為Biotin-5’-TGCACTGCCAGGTGCTICGGCTCAT-3’<SEQ ID NO.3>和引物L(fēng)B41(反向)5’-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTIT-3’<SEQ ID NO.4>)各0.4μM，1.2mM所有脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，4mM氯化鎂，9.5％甘油，和防腐劑。典型地，需將Taq聚合酶和抗Taq抗體在室溫下預(yù)保溫10分鐘，將MgCl2作為單獨溶液在加樣品之前加入。CMV特異性分析引物設(shè)計為與編碼患者樣品中CMV晚期基因的pp65基質(zhì)蛋白的DNA互補。將IPC目的序列和CMV pp65基質(zhì)蛋白目的序列都克隆到Bluescript質(zhì)粒(Stratagene，La Jolla，CA)上作為測試對照。這樣可以用光譜分析進行準(zhǔn)確的定量分析，并符合Poisson’s分布。使用作為內(nèi)部陽性對照的目的DNA序列為5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATIACACCTITATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<SEQ ID NO.5>
將25μl處理后的樣品加入75μl PCR反應(yīng)混合物。加完并混合后，將反應(yīng)混合物倒進塑料袋狀PCR容器系統(tǒng)的擴增腔(Johnson & Johnson ClinicalDiagnostics，Inc.，美國專利號5089233；5229297；和5380489)。用PCR擴增和檢測處理裝置(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics，Inc.，美國專利號5567617)進行擴增和檢測。96EC初始預(yù)熱3分鐘后，使樣品在96EC(5秒)變性步驟和70EC(40秒)退火步驟之間交替，進行40次循環(huán)擴增。在103EC最后加熱5分鐘后，將擴增產(chǎn)物導(dǎo)入袋內(nèi)含對照和測試特異性探針(與捕捉玻珠相連)的檢測室(表1)。
表1
INC-26.7a作為內(nèi)部陰性對照，在操作適當(dāng)?shù)腜CR袋內(nèi)期望不給出信號。
然后目測玻珠上產(chǎn)生的顏色，并與顏色記錄卡比較，該顏色記錄卡具有10種藍色逐步增加的漸變顏色，相應(yīng)的編號為0到10(0＝無信號，10＝最高陽性信號)。2以上的目測記錄表明捕捉玻珠上的陽性試驗。另外，記錄PCR處理裝置測量得到的反射比密度(Dr)。Dr讀數(shù)大于0.13表明結(jié)果為陽性。實施例1應(yīng)用本發(fā)明的方法從血漿中提取DNA與聚合物捕獲法比較進行下述試驗以將本發(fā)明的提取法和聚合物捕獲法進行比較。
按照前面所述的本發(fā)明方法和聚合物捕獲法，從來自65位患者的血漿中制備樣品。在聚合物捕獲法中使用了20μl和50μl樣品。這些樣品在最初評價中，對通過聚合物捕獲方案制備的50μl樣品評價時均得到“未檢測到”的結(jié)果。當(dāng)內(nèi)部陽性對照捕捉玻珠給出假陰性結(jié)果時出現(xiàn)“未檢測到”的結(jié)果。導(dǎo)入樣品的IPC對照質(zhì)粒為每個終反應(yīng)混合物中10個拷貝。制備的所有樣品與PCR反應(yīng)混合物混合，進行如上述的擴增和檢測。
聚合物捕獲法得到“未檢測到”的幾率與本發(fā)明處理血漿樣品的方法得到“未檢測到”的幾率相對照，結(jié)果在下表2中列出。
表2
*IPC陰性結(jié)果的數(shù)目/操作的樣品總數(shù)50μl聚合物捕獲方法表明“未檢測到”的幾率為21％，而20μl聚合物捕獲方案和20μl本發(fā)明方法的失敗率為0％。對于上述兩種聚合物捕獲方法，顯然某些樣品的信號偏低，內(nèi)部陽性對照接近陰性。
因此，本發(fā)明的方法顯著優(yōu)于50μl聚合物捕獲方法，在IPC捕捉玻珠上出現(xiàn)假陰性結(jié)果方面，本發(fā)明的方法表現(xiàn)出比20μl聚合物捕獲方法進步。用50μl聚合物捕獲方法制備的樣品顯然含有PCR抑制物或者表現(xiàn)其它一些與聚合物捕獲有關(guān)的現(xiàn)象。
另外，有這樣一個使用20μl聚合物捕獲方法的實例，其中從CMV陰性患者獲得的樣品得到CMV(LBSA-11)捕捉玻珠上的假陽性結(jié)果。而相應(yīng)的50μl聚合物捕獲方法的結(jié)果為陰性(如果為真正的陽性，患者樣品中將出現(xiàn)多于2.5倍的CMV目標(biāo)DNA)，該結(jié)果例證了多步驟操作程序的復(fù)雜性，例如產(chǎn)物遺留。實施例2用本發(fā)明的方法從血清中提取DNA與聚合物捕獲法比較從來自100位CMV IgG-陽性，IgM-陰性的OB/GYN患者的血清樣品提取DNA，這些患者由Houston TX的Texas兒童醫(yī)院提供，在聚合物捕獲程序和本發(fā)明的方法中應(yīng)用20μl樣品(參見上述實施例1)。在制備樣品之前，將CMV對照質(zhì)粒DNA加到各樣品中，以制備在PCR反應(yīng)混合物中終單鏈拷貝數(shù)為20的CMV質(zhì)粒目的DNA。同時也將IPC對照質(zhì)粒加入樣品，使每PCR反應(yīng)混合物終水平為10拷貝。制備的所有樣品如上述與PCR反應(yīng)混合物混合。如上述在PCR袋中進行雙次擴增和檢測。
聚合物捕獲法與本發(fā)明應(yīng)用血清的方法相比，假陰性結(jié)果的幾率在下表3中列出。
表3
*IPC陰性結(jié)果數(shù)/操作的樣品總數(shù)樣品制備程序均沒有在IPC捕捉玻珠上給出陰性結(jié)果。然而，使用聚合物捕獲法時，將CMV質(zhì)粒目的物加入樣品在CMV玻珠上得到5％的假陰性幾率，表明對PCR的潛在抑制作用。相反，應(yīng)用本發(fā)明的方法無假陰性CMV玻珠結(jié)果。實施例3應(yīng)用本發(fā)明的方法從CMV患者人群得到的血漿提取DNA與GeneClean II樣品比較進行下列試驗以檢測本發(fā)明方法在從患者樣品提取DNA中的效能。
用下面兩種方法提取血漿樣品(i)用Gene Clean II法(Bio 101，Inc.)，特征在于利用非常靈敏的P32液體雜交CMV PCR分析和直接凝膠CMVPCR分析；(ii)用本發(fā)明的方法，分析過程如上面實施例1的描述。導(dǎo)入各樣品的IPC對照質(zhì)粒為每終反應(yīng)混合物25雙鏈拷貝。所有樣品與PCR反應(yīng)混合物混合，隨后在PCR袋中如上述進行雙次擴增和檢測。
CMV捕捉玻珠上的結(jié)果列于下表4中。
表4本發(fā)明方法與GeneClean II法制備血漿樣品的比較GeneClean+ -
本發(fā)明方法+-所有TCG血漿陽性樣品均認(rèn)為是非常低的陽性樣品，因為它們僅在液體雜交分析中表現(xiàn)陽性，而在直接凝膠分析中表現(xiàn)陰性，這表明樣品中CMV拷貝水平非常低。
兩種樣品制備方法具有80％的一致性。應(yīng)用本發(fā)明的方法，通過GeneClean法，12個陽性樣品中10個得到陽性結(jié)果，兩個給出陰性結(jié)果。對樣品制備進行重復(fù)測試后，起初的兩個假陰性樣品中一個變成陽性。對于GeneClean陰性血漿樣品，也遇到類似的結(jié)果。對于13個陰性樣品，這兩種樣品制備方法對于10個樣品給出一致的結(jié)果。
另外，還有三個本發(fā)明方法顯示為CMV陽性樣品的實例。重復(fù)測試樣品制備后，這三個樣品中的兩個再次表現(xiàn)CMV陽性結(jié)果。由于PCR分析的固有靈敏性，分析中常觀察到非常低的目的樣品給出矛盾的結(jié)果。這預(yù)示可能符合Poisson取樣分布。實施例4在血漿中加入潛在干擾物質(zhì)下列試驗用于檢測本發(fā)明方法排除血漿中潛在干擾物質(zhì)的能力。
處理常規(guī)血漿樣品組以調(diào)節(jié)pH，加入血樣收集添加劑和其它公知的或可能干擾樣品制備擴增或檢測的物質(zhì)。將化合物以估計血清峰水平三倍量加入樣品(表5)。
如前面實施例1的描述用本發(fā)明方法和現(xiàn)有技術(shù)聚合物捕獲法從20μl各樣品中提取DNA。IPC和CMV質(zhì)粒分別為每終PCR反應(yīng)混合物25和10個雙鏈拷貝。半數(shù)樣品僅含IPC質(zhì)粒，以便評價由于樣品交叉污染或產(chǎn)物遺留可能引起的假陽性結(jié)果(基于CMV探針玻珠上的顏色)。所有樣品與PCR反應(yīng)混合物混合，然后在PCR袋內(nèi)擴增并檢測。對于每種化合物，在四個PCR袋中分析，其中包括0和10 CMV拷貝水平。另外，同時操作含用于制備包括在分析中的化合物的各種溶劑(水、丙酮、酒精)的適當(dāng)對照。
注解*+表示存在目的物時所有CMV和IPC捕捉玻珠上均出現(xiàn)陽性結(jié)果；FP＝假陽性；FN＝假陰性(當(dāng)CMV水平為10拷貝時，在期望CMV陽性捕捉玻珠上出現(xiàn)CMV陰性結(jié)果)；NT＝在期望CMV陰性樣品中“未檢測到”，IPC捕捉玻珠為陰性(CMV＝Neg)；
在最初測試中，各樣品制備方法在CMV捕捉玻珠和IPC捕捉玻珠上均偶爾出現(xiàn)假陰性結(jié)果和幾次“未檢測到”結(jié)果，但聚合物捕獲法制備的樣品更多地觀察到上述結(jié)果。另外，幾個對照給出不期望的陰性結(jié)果，表明PCR袋失效所致。
再次測試前面的樣品制備方法，聚合物捕獲法和本發(fā)明方法對所有測試物質(zhì)均給出陽性結(jié)果，除了用聚合物捕獲法制備的25％的血樣(提取DNA之前將25體積份全血加入75體積份的血漿)。四個僅含IPC目的物(無CMV目的物)的樣品中，兩個再次在IPC捕捉玻珠上表現(xiàn)“未檢測到”結(jié)果。另外，四個含IPC和CMV目的DNA的樣品中的三個表現(xiàn)IPC捕捉玻珠的抑制，目視記錄僅為“1”。對于這四個樣品，CMV捕捉玻珠也表現(xiàn)抑制信號(目視顏色記錄為“3”和“4”)。還有一個利用聚合物捕獲技術(shù)得到假陽性結(jié)果的實例(在pH改變較小的條件下)，再次表明少數(shù)次操作步驟的簡單程序有利于防止遺留污染。
這些結(jié)果顯示，當(dāng)利用聚合物捕獲技術(shù)制備樣品時，在HCMV分析中25％全血表現(xiàn)抑制。相反，用本發(fā)明方法提取DNA不表現(xiàn)PCR擴增和檢測的抑制。這一點十分有意義，因為臨床試驗室中血清和血漿樣品常被紅細(xì)胞污染。另外，與相比較優(yōu)于聚合物捕獲法的本發(fā)明方法比較，聚合物捕獲技術(shù)比本發(fā)明方法更繁復(fù)，并使樣品更大程度地與環(huán)境接觸。
利用本發(fā)明方法提取DNA都不會導(dǎo)致任何試驗物質(zhì)對PCR擴增的抑制或擴增產(chǎn)物檢測的抑制。這種簡便的方法代表著對較笨拙耗時繁雜的現(xiàn)有技術(shù)方法的有意義的改進。
前面提到的所有專利、申請、文章、出版物和試驗方法均參考全文插入本文。
根據(jù)上述詳細(xì)描述，本發(fā)明的某些改變將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這種明顯的改變完全落入附加的權(quán)利要求界定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.從血清或血漿中提取DNA的方法，所述方法包括(i)將清或血漿與堿接觸，制備堿化的血清或血漿；(ii)將所述堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘，制備加熱的堿化血清或血漿；(iii)離心所述加熱的堿化血清或血漿，制備含DNA的上清液；和(iv)提取所述含DNA的上清液。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中在所述加熱步驟(ii)之后，所述離心步驟(iii)之前，將所述加熱的堿化血清或血漿放冷或冷卻至約25EC。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述堿為氫氧化鈉。
4.如權(quán)利要求2的方法，其中所述溫度約為105EC。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中所述時間約為5分鐘。
6.如權(quán)利要求2的方法，其中所述離心條件為約16000xg離心約2分鐘。
7.如權(quán)利要求2的方法，其中所述堿化的血清或血漿含有濃度約為15-50mM范圍內(nèi)的堿。
8.檢測血清或血漿中含DNA的微生物的方法，所述方法包括(i)將受試者的血清或血漿與堿接觸，制備堿化的血清或血漿；(ii)將所述堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘，以制備加熱的堿化或血漿；(iii)離心所述加熱的堿化血清或血漿，以制備含DNA的上清液；(iv)提取所述含DNA的上清液；(v)用識別所述含DNA微生物的DNA中的序列的寡核苷酸引物擴增所述上清液中的所述DNA，形成對所述含DNA微生物的特異性的擴增產(chǎn)物；和(vi)檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述擴增產(chǎn)物的檢測表明在所述血清或血漿中存在所述微生物。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中在所述接觸步驟(ii)之后，所述離心步驟(iii)之前，將所述加熱的堿化血清或血漿放冷或冷卻至約25EC。
10.如權(quán)利要求8的方法，其中所述溫度約為105EC。
11.如權(quán)利要求8的方法，其中所述微生物是細(xì)菌。
12.如權(quán)利要求8的方法，其中所述微生物是病毒。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述病毒是人巨細(xì)胞病毒。
14.如權(quán)利要求8的方法，其中所述堿化的血清或血漿含有濃度約為20mM的堿。
全文摘要
本發(fā)明描述了從血清或血漿中提取DNA的方法,方法包括將血清或血漿與堿接觸,制備堿化的血清或血漿,將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間,保持約5到20分鐘,離心加熱后的堿化血清或血漿,制備含DNA的上清液,將加熱的堿化血清或血漿冷卻至室溫,或冷卻至約25EC,最后提取含DNA的上清液。本發(fā)明還公開了檢測血清或血漿中的含DNA的微生物的方法。
文檔編號C12N15/10GK1270962SQ00104698
公開日2000年10月25日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月3日
發(fā)明者L·博格梅耶, K·L·安吉 申請人:奧索臨床診斷有限公司