專利名稱：疫苗組合物的制作方法
疫苗組合物本發(fā)明涉及用于在受試者中誘發(fā)針對甲型流感病毒具有保護性的免疫應答的疫苗組合物。本發(fā)明還涉及用于家禽和其他禽類的針對高致病性禽流感H5m的接種的組合物。 流感是由正粘病毒科(Orthomyxovihdae)的RNA病毒引起的哺乳動物和禽類的傳染病。一般地，其通過咳嗽和打噴嚏產生含病毒的氣霧(aerosol)從被感染的動物以及通過其糞便從禽類傳播。所述疾病還可通過與被感染的受試者的體液和與已被這類體液污染的表面接觸傳播。術語“禽流感病毒”通常被理解為意指甲型流感病毒，因為野生禽類是甲型流感病毒的天然宿主。一些甲型株被稱為低致病性的，因為此類株(LPAI病毒)通常具有低毒力， 雖然它們作為高致病性株(HPAI病毒)的前體(progenitor)。甲型流感H5m亞型的高致病性株在東南亞的禽類中是地方性的并且被認為代表長期世界性大規(guī)模疫病流行的威脅。這些株是在家禽例如雞與火雞之間傳染性很強。疾病在通常將禽類彼此緊密接觸集中飼養(yǎng)的家禽農場中爆發(fā)已導致100%的禽類死亡率。流感病毒在其表面具有兩種主要的抗原性糖蛋白血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)(也稱為唾液酸酶)。HA的主要功能是結合上呼吸道的細胞膜上和紅細胞的表面上的唾液酸受體位點和促進病毒基因組進入宿主中的靶細胞。NA具有幫助和促進子代病毒從被感染的細胞釋放的功能以及還在促進病毒進入宿主細胞中起作用。制藥工業(yè)已產生了用于抵抗流感感染的神經氨酸酶抑制劑。此類抑制劑通過阻止或抑制病毒神經氨酸酶行使其功能起作用。此類神經氨酸酶抑制劑的實例包括扎那米韋 (Zanamivir)和奧塞米韋(Oseltamivir)("達菲“)，它們通過阻斷病毒神經氨酸酶在從被感染的細胞釋放子代病毒顆粒中的活性起作用。不幸地，使用此類化合物的藥物療法通常在疾病被臨床識別后是無效的，因為到此時病毒已得到良好確立。此類化合物在家禽治療中的預防性使用對于家禽飼養(yǎng)場主，特別是其中H5W是地方性的地域的區(qū)域中的家禽飼養(yǎng)場主來說通常太昂貴了。本發(fā)明的目的是提供可用于針對甲型流感感染的預防性治療的大規(guī)模免疫計劃的高性價比的疫苗。因此，本發(fā)明提供了含有滅活的甲型流感病毒抗原和細菌唾液酸酶的疫苗組合物。令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)向疫苗組合物中摻入細菌唾液酸酶具有增加疫苗效價的作用。雖然我們不希望受理論束縛，但細菌唾液酸酶的增效作用可能因通過唾液酸酶從存在于宿主上皮表面上的唾液酸化膜糖脂選擇性除去唾液酸(從而阻止任何流感病毒結合在這些唾液酸受體位點上)而引起。通過阻止病毒進入宿主的易受攻擊的細胞，為由疫苗組合物中的抗原誘發(fā)的宿主的免疫應答提供更多時間來抵抗攻擊性流感病毒。此外，細菌唾液酸酶本身在宿主中可具有抗原性作用，從而可利用宿主的免疫系統(tǒng)誘發(fā)可具有抗流感神經氨酸酶作用的抗細菌唾液酸酶抗體的產生。已純化和表征了許多不同的細菌唾液酸酶。用于本發(fā)明的疫苗組合物的細菌唾液酸酶通常為不需要為了活性而存在任何金屬離子并且可來源于任何適當的細菌來源的唾液酸酶。取決于種，細菌唾液酸酶通常具有67 kD至90kD范圍內的分子量。唾液酸酶的適當來源的實例包括銅綠假單胞菌i^Pseudomorms)、產氣莢膜梭菌
{Clostridium(.Clostridium cAa歸ei )和敗血梭狀芽
孢桿菌(CVosirii/i Septicum^0優(yōu)選，細菌唾液酸酶獲自產氣莢膜梭菌，更優(yōu)選獲自A 型產氣莢膜梭菌菌株107 (高唾液酸酶菌株)。細菌唾液酸酶包括產氣莢膜梭菌唾液酸酶白勺)iz^生 / 純Ulil James Τ. Cassidy ^A ； Purification and Properties of sialidase from Clostridium perfringens \ J. Biol. Chem；第 240 卷，No. 9，September 1965, ρ 3501-3506進行了論述。在本文中在下列實施例中描述了來自A型產氣莢膜梭菌菌株107 的唾液酯酶的純化樣品的制備。根據本文中使用的方法，處理培養(yǎng)的細菌細胞以產生用福爾馬林處理的產氣莢膜桿菌類毒素，接著用硫酸銨處理該類毒素，然后通過透析濃縮來產生純化的酶。如上所述，用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的生產中的產氣莢膜桿菌唾液酸酶組分包含類毒素。已知產氣莢膜桿菌α毒素的非類毒素化形式(non-toxoided form)具有溶血性和壞死性并且是雞中傳染性壞死性腸炎的原因。據信，本發(fā)明的疫苗組合物中產氣莢膜桿菌唾液酸酶的使用在對其施用疫苗組合物的雞中具有提高對傳染性壞死性腸炎的抗性的額外作用。用于本發(fā)明的疫苗組合物的滅活的甲型流感抗原可以是來源于滅活的甲型流感病毒的任何抗原性材料。例如，其可包含滅活的完整病毒顆粒?？蛇x地，其可包含其中免疫原性蛋白質例如M2離子通道蛋白或糖蛋白得到保留的破裂病毒(disrupted virus)(裂解病毒，split virus) 0甲型流感病毒膜糖蛋白血細胞凝集素(HA)和/或神經氨酸酶(NA) 的純化制劑可用作疫苗組合物中的抗原性材料。根據本發(fā)明的疫苗組合物可包含一種或多種類型的此類抗原性材料。用于制備疫苗組合物的甲型流感病毒當然將取決于所述疫苗的受者將被保護免受其害的甲型流感。鑒于由H5W造成的威脅，優(yōu)選疫苗組合物包含來源于甲型流感病毒H5W亞型的至少一個株的滅活的抗原性材料。更優(yōu)選，疫苗組合物可包含來自超過1個H5W株的滅活的抗原性材料，以便在受試者中誘發(fā)抗循環(huán)中不同H5W株的更廣泛的保護作用。疫苗組合物可包含任何一種或多種適當的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑或其他添加劑，這在本領域內是常規(guī)的。由于流感病毒進入宿主細胞的主要點是通過上呼吸道中的粘膜表面，因此本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是使疫苗組合物適合于粘膜施用，更優(yōu)選適合于鼻內施用，鼻內施用的疫苗當然是公知的并且本領域技術人員的共同一般知識教導可如何制備用于鼻內施用的疫苗。疫苗領域中也公知的是將佐劑與疫苗的抗原性組分結合使用。佐劑是在受試者中增強對抗原的免疫應答的物質。除了抗原性材料以外，還已使用殼聚糖(以利用其加強穿過粘膜上皮的跨細胞和細胞旁轉運的能力)制備適合于粘膜施用的疫苗，特別是適合于鼻內施用的疫苗。殼聚糖是賦予一類通過殼多糖的去乙?；饔弥苽涞年栯x子多糖的通用名稱。殼多糖是在海洋甲殼類動物的外骨骼中豐富存在的天然生物聚合物。殼聚糖是線性陽離子聚電解質，其是無毒的、生物可降解的和生物相容的并且是白色或灰白色無定形半透明固體(該固體在稀釋的有機酸中是可溶的)。殼聚糖可有利地以無毒性酸加成鹽例如鹽酸殼聚糖的形式使用，該鹽形式比殼聚糖更可溶。此類材料可從NovaMatrix獲得。根據特別優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供了用于鼻內施用的疫苗組合物，其包含滅活的甲型流感抗原、細菌唾液酸酶和殼聚糖。殼聚糖通常是脫乙酰殼多糖，其至少70%脫乙?；?，優(yōu)選至少80%脫乙?；?。殼聚糖(大于75%脫乙?；?可從Sigma-Aldrich獲得。可以以有效地刺激對鼻內施用的甲型流感病毒抗原的免疫應答的任何量使用殼聚糖。用于本發(fā)明的疫苗組合物的殼聚糖的常見濃度基于水相疫苗組合物的體積按重量計在0. 05至5%，優(yōu)選0. 1至2. 0%，更優(yōu)選0.2至1.0%的范圍內。 可按照本領域內已知的方法將本發(fā)明的疫苗組合物，包括配制用于鼻內施用的疫苗組合物，配制為液體或干粉。優(yōu)選，可將疫苗組合物配制為液體，尤其是水相分散系、懸浮液或溶液，以作為滴劑或氣霧劑施用。本發(fā)明的疫苗組合物在水相體系(aqueous system) 中的使用是特別優(yōu)選的，因為這使得可能進行有效的大規(guī)模接種計劃(mass vaccination programme),由此可通過微滴或噴霧施用快速且相對便宜地治療大量禽類。鼻內施用，例如通過對待治療的禽類的一個鼻孔施用一滴水相疫苗，可由不熟練的操作者容易地在實地進行。此外，由于因鼻內接種而引起的增加的粘膜IgA水平，從而使得能夠產生抗天然感染途徑的隨后保護作用。當將殼聚糖在本發(fā)明的水相疫苗組合物中用作佐劑時，其是有益的，以便維持殼聚糖在水介質中的溶解性同時確保疫苗的抗原組分免受不利的影響，確保所述水性疫苗組合物具有約5. 0至6. 5范圍內的pH，優(yōu)選約5. 0的pH。將以有效地誘發(fā)對甲型流感病毒的免疫應答的量給受試者施用本發(fā)明的疫苗。確定將給受試者施用的適當和有效的劑量在本領域技術人員的能力和知識范圍內。雖然被施用疫苗的受試者可以是人，但本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是配制用于給禽類特別是家禽施用的疫苗。如下列實施例中所顯示的，使用對一個鼻孔以0.03 ml —滴的鼻內施用單劑量(含有(每0.03 ml劑量)懸浮于0. 5% w/v殼聚糖溶液中的100個病毒HA單位，122個產氣莢膜梭菌唾液酸酶單位)的液體疫苗來實現(xiàn)家禽的抗H5W Al病毒的成功接種。根據本發(fā)明，將細菌唾液酸酶摻入含有滅活的流感抗原的疫苗具有增加疫苗的效價的作用。因而，根據其他方面，本發(fā)明涉及細菌唾液酸用以提高疫苗，特別是鼻內施用的含有滅活的流感抗原的疫苗的效價的用途。本發(fā)明還涉及通過加入細菌唾液酸酶提高此種疫苗的效價的方法。實驗方法
1.滅活的病毒抗原的制備
在11日齡孵育的無特定病原雞胚中繁殖從被感染的雞分離和鑒定的高致病性H5m同株。使用含有128個HA單位/25 μ 1的工作種子病毒，通過用0. 2ml在磷酸緩沖鹽溶液pH 7.4 (PBS) +卡那霉素20mg/ml中的1/1000稀釋物注射至每一個胚的尿膜囊(allantoic sac)內來接種胚。然后將雞胚在37°C下孵育72小時。在25至27小時內記錄下胚胎死亡。將死亡的胚胎在4°C下冷凍，收集尿囊液，以3000 rpm離心15分鐘使尿囊液澄清， 以除去不需要的碎片。離心后，棄去沉淀的物質，含病毒的上清液經測試顯示具有血細胞凝集活性(通過引起雞紅細胞的凝集)。通過加入0. 1%福爾馬林，然后在37°C孵育18小時來處理上清液以滅活病毒。然后在4°C下持續(xù)攪拌的情況下，用0. 5% ν/ν氯仿裂解病毒，進行18小時。在28°C于IOOmbar的真空下進行2小時除去殘留的氯仿，并且就血細胞凝集活性再測試樣品。通過用0. 2ml的滅活的病毒懸浮液接種11日齡的孵育的雞胚來證明毒力的喪失。 全部胚胎在于37°C下再孵育5天后仍然活著。通過過濾使病毒液體澄清，將其于-20°C下貯存。2.細菌唾液酸酶的制備
(a)通過組合如下物質制備培養(yǎng)基
Oxoid L37 蛋白胨 2%
水解乳蛋白1 %
酵母提取物0. 5%
NaCl 1.0%
加水至4. 0升的體積
將培養(yǎng)成分(PH 7. 4)置于IOL Pyrex瓶中并且在121°C下高壓滅菌30分鐘。向高壓滅菌的培養(yǎng)成分中加入葡萄糖水溶液(50% w/v無菌葡萄糖水溶液)以在終培養(yǎng)基中產生 1. 0%的葡萄糖含量。然后將培養(yǎng)基快速冷卻至37°C以保持還原條件。通過在Robertson煮肉肉湯中重建冷凍干燥的種子來制備A型產氣莢膜梭菌菌株 107的接種物。向400ml培養(yǎng)基中加入接種物，然后將其加回大批培養(yǎng)基至4. OL的總體積。 在3個半小時的生長期中通過加入5/N NaOH來使培養(yǎng)基的pH維持在7. 0，并且將溫度維持在37°C。在生長期后，冷卻培養(yǎng)物，離心以除去細胞和其他固體物質。收集上清液，向其中加入0. 6% ν/ν福爾馬林，將用福爾馬林處理的溶液在37°C下孵育18小時以形成類毒素。利用下列方法測定產氣莢膜梭菌類毒素中受體破壞酶(RDE)即唾液酸酶的滴度。 使用96孔U形底微量培養(yǎng)板，在12個孔中于pH 5. 5磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中進行類毒素的二倍稀釋，在每一個孔中每一個稀釋度留下25 μ 1。向孔中的每一個稀釋物中加入25 μ 1 1%的pH 7.4 PBS中的經洗滌的雞紅細胞(RBC)，然后輕輕地混合每一個孔的內容物。讓唾液酸酶在28°C下吸附至RBC，進行1個半小時。向每一個孔中加入25 μ 1 4個HA單位的福爾馬林滅活的H5W血細胞凝集素，將每一個孔的內容物放置3小時，將溫度保持在28°C。 然后研究每一個孔的內容物，記錄抑制雞RBC凝集的類毒素的最高稀釋度。將凝集的抑制程度(即，酶的滴度)記錄為抑制凝集的類毒素的最高稀釋度的倒數，發(fā)現(xiàn)其為1024個RDE 單位 /25 μ 1 (40960 個單位 /ml)。按照下列方法純化和濃縮如上所述制備的產氣莢膜梭菌類毒素。向類毒素中加入50% w/v硫酸銨。棄去產生的沉淀，保留上清液以待進一步處理。向上清液中加入另外的35% w/v的硫酸銨(至飽和)，讓混合物靜置12小時。在靜置后，發(fā)現(xiàn)混合物含有褐色固體。當該固體漂浮至溶液的表面時通過撇取其來收集其。然后將收集的固體溶解于蒸餾水中，將其用蒸餾水透析8小時以除去殘留硫酸銨。然后按照已知的技術，通過使用聚乙二醇 (PEG)(分子量20，000)進一步透析來濃縮透析物，之后將其在-20°C下貯存。使用上述用于測定RDE滴度的方法，測定了如上所述制備的純化和濃縮的物質的RDE滴度。3.殼聚糖原液
將85%的螃蟹來源的脫乙?；瘹ぞ厶?NovaMatrix)在1% ν/ν pH 5.0醋酸水溶液、醋酸鈉緩沖液中配制為0. 5% w/v的溶液，通過將其在緊密的密封瓶中于121°C下高壓滅菌20 分鐘來進行滅菌。
4.疫苗的制備
向每100，000個HA單位的如上制備的滅活的病毒中加入3.0 ml (122880個RDE單位)的產氣莢膜梭菌唾液酸酶(未純化的，未濃縮的)制劑。通過在4°C下攪拌1小時混合滅活的病毒和細菌唾液酸酶。然后通過加入0.5% w/v的醋酸/醋酸鹽緩沖的無菌殼聚糖 CpH 5. 0)將混合物補足至30ml的總體積，然后在4°C下再攪拌1小時。測試最終的大批疫苗的無菌性，將其置于無菌的30 ml聚丙烯瓶中，該瓶中引入遞送每滴0.03 ml的滴嘴(dropper nozzle)。因此，每一個0.03 ml的劑量由懸浮于0. 5% w/ ν無菌殼聚糖pH 5.0中的100個HA單位的病毒和約122個RDE單位的細菌唾液酸酶組成。實施例1
A.使用無細菌唾液酸酶的普通疫苗的IgA反應
在一組雞中研究IgA血清學反應，已通過向一個鼻孔中施加一滴30 μ 1的水相疫苗來接種該組的每一只雞。所述水相疫苗包含(a)在雞胚中制備的且隨后用福爾馬林滅活的同源(homologous) H5W和(b)商購殼聚糖(85%脫乙?；?。每30 μ 1劑量的滅活的病毒的水平是結合0.4% w/v 85%脫乙酰化殼聚糖的100個HA單位。用于本實施例的鼻內疫苗因而不包含任何細菌唾液酸酶。疫苗的pH為5. 0。將總共30只9周齡的產蛋雞用于實驗中。首先在12日齡時用鼻內疫苗接種雞。 使用相同的疫苗在9周齡進行第二次接種。將雞分成6組，每一組由每組5只雞組成。在9周時期接種之前，從第一組獲得氣管拭子(tracheal swab)。如下文中所示，在9周時期接種后在不同時期從其他組獲取氣管拭子。Pre 在接種前從組I獲得氣管拭子
1在接種后1周從組II獲得氣管拭子
2在接種后2周從組III獲得氣管拭子
3在接種后3周從組IV獲得氣管拭子
4在接種后4周從組V獲得氣管拭子
5在接種后5周從組VI獲得氣管拭子
使用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測鼻內接種的雞的粘膜IgA反應。用于ELISA的試劑、條件和裝置如下 ELISA
包被 Ag:滅活的 Al (H5N1 )病毒(256 HA), 1 1600
樣品稀釋于300 μ 1 PBS的氣管拭子
取樣每周一次(在接種后5周前)
封閉TEN (Tris 堿，EDTA, NaCl) +0.2% 酪蛋白過夜
綴合物1:1500 (山羊抗雞 IgA-HRP (Bethyl Lab, Inc)
底物ABTS
ELISA 讀數器在 415 nm 的 Titertek EX
顯示為405 nm處的光密度的根據ELISA的結果(5個樣品的平均)如下 組1 (接種前) 0. 33 組2 (接種后1周)0.44組3 (接種后2周)0.31 組4 (接種后3周)0.33 組5 (接種后4周)0.37 組6 (接種后5周)0.4 這些結果也圖示于

圖1中。結果通過在接種后2至5周的時期內遞增的獲自免疫的禽類的鼻洗出液中IgA的出現(xiàn)證明了粘膜應答。接種后第一周內IgA的早期產生可能解釋在患病群體上進行的干預中觀察到的快速疾 病控制。在未免疫的組中存在可能來自母源卵內抗體(maternal in ovo antibody)的IgA的背景水平。實施例2
用本發(fā)明的疫苗鼻內接種的雞中的IgA反應
將24只20周齡的雞(從無特定病原的蛋孵育的)用于本實施例。將雞分成6組，每組包括4只雞。第一組雞不接種。通過對一個鼻孔施用一滴30 μ 1的液體疫苗鼻內接種其他組中的每一只雞。液體疫苗包含(a)在雞胚中制備并且隨后用福爾馬林滅活和用氯仿裂解的同源H5m，(b)商業(yè)殼聚糖(85%脫乙?；?和(c)獲自A型產氣莢膜梭菌菌株107 的細菌唾液酸酶。組分(b)與實施例中1所使用的相同。按照上述實驗方法制備組分(c) (唾液酸酶)。鼻內疫苗在每30 μ 1的劑量中包含懸浮于0. 5% w/v殼聚糖(85%脫乙?；?，pH 5. 0中的100個HA單位的病毒和122個單位的產氣莢膜桿菌唾液酸酶。如下從雞獲得氣管拭子 組1 未接種的
組2 :接種后1周組3 :接種后2周組4 :接種后3周組5 :接種后4周組6 :接種后5周
將每一個拭子的內容物洗提于0.4 ml PBS +抗生素(卡那霉素-10 mg/ml)中，然后于4°C下貯存。利用ELISA檢測雞(未接種的和鼻內接種的)的粘膜IgA反應。按照由Bethyl Laboratories Inc.對于禽類IgA的檢測所描述的測試方法進行ELISA。用于ELISA的試齊U、條件和裝置如下所示。ELISA 方法
微量培養(yǎng)板Nunc Maxisorp, U形底96孔
包被抗原裂解病毒1/200的4HA，稀釋于碳酸鹽緩沖液pH 9. 6中。于4 °C下保持過夜。使用0. 2%酪蛋白進行封閉過夜。將粘膜樣品稀釋至1/5，在室溫下振蕩1小時。綴合親和純化的HRP綴合的抗IgA (Bethyl Lab) 1/2000，在室溫下振蕩1小時。底物ABTS 在415 nm讀數。
顯示為在405 nm記錄的光密度的根據ELISA的結果(平均值)如下 對照綴合物OD (未加入樣品)0. 065
組1 (未接種的)0.674
組2 (接種后1周)0. 7325
組3 (接種后2周)O·8375
組4 (接種后3周)0.851
組5 (接種后4周)0.8385
組6 (接種后5周)0.7910
這些結果圖示于圖2中。測試的雞中對單個30 μ 1劑量的含有細菌唾液酸酶的鼻內疫苗的免疫應答產生比在實施例1中給予雙倍劑量的普通疫苗(無裂解病毒和無細菌唾液酸酶)的雞中觀察到的 IgA水平更高的IgA水平。由如利用ELISA測量的升高的粘膜IgA水平指示的免疫應答顯示鼻內施用至缺乏特異性免疫力(immunologically na ve)的雞的含有細菌唾液酸酶的疫苗提供了比使用不含細菌唾液酸酶的鼻內疫苗獲得的保護水平更高的保護水平。實施例3
參觀已報導和鑒定了 HP H5W禽流感暴發(fā)的商業(yè)種雞場。在所有情況下，死亡率已達到令人擔憂的水平。疾病的特征在于根據以前的經驗將導致100%死亡率的快速傳播。通過對一個鼻孔施用30 μ 1 一滴的如上所述制備的本發(fā)明的疫苗來鼻內接種每一個群體中的每一只禽類。每一個30 μ 1劑量包含懸浮于0. 5% w/v殼聚糖PH 5.0中的 100個HA單位的滅活的裂解病毒和122個RDE單位的細菌唾液酸酶。1.農場 Α: 禽齡20天
Al接種無
死亡率每天約500只
總群體25，000只
干預時的全部損失約5000只
使用本發(fā)明的鼻內疫苗
死亡在3天內停止。2.農場 B 禽齡> 5個月
接種史在第5周時肌內(IM)接種疫苗H5m RE 1(商業(yè)疫苗)，在第15周時重復接
種
死亡率約500只禽類/天
在暴發(fā)時施用本發(fā)明的鼻內疫苗加IM H5m RE 1 (商業(yè)疫苗) 死亡繼續(xù)，20%存活。3.農場 Cl 禽齡6個月
接種史在第6周時肌內施用H5N2(商業(yè)疫苗)，在第16周時重復施用死亡率約1000只/天在暴發(fā)時施用本發(fā)明的鼻內疫苗加IM H5N2(商業(yè)疫苗) 死亡繼續(xù)，無存活者。4.農場 C2:
禽齡< 4個月
接種史在第5 周時IM接種疫苗H5N2 (商業(yè)疫苗) 在暴發(fā)時只施用本發(fā)明的鼻內疫苗死亡在5天內終止。討論
我們已顯示在現(xiàn)有禽流感暴發(fā)期間，利用鼻內施用的本發(fā)明的疫苗的干預可顯著地影響圈養(yǎng)在集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)(intensive breeding system)中的所有年齡的家禽的病程。我們還從上述干預中證明鼻內疫苗的使用在2至5天內有效地控制了疾病。·在其中本發(fā)明的鼻內疫苗以及商業(yè)肌內和皮下疫苗同時使用的情況下，控制失敗并且疾病繼續(xù)?！ぴ谄渲兄贿M行鼻內疫苗施用的情況下，觀察到完全控制并且死亡率在2至5天內終止。結論
家禽中高致病性禽流感病是特急性的。在被感染的群體中，觀察到急劇上升的死亡率。 在此類暴發(fā)中，一部分禽類被亞臨床感染，雖然它們未顯示明顯的臨床疾病。參考上述農場B和C。此處農場主對獨立使用的本發(fā)明的鼻內疫苗的功效持保留意見并且決定同時用商業(yè)肌內或皮下疫苗接種全部禽類，結果該操作將病毒從亞臨床感染的禽類傳播至整個群體。本發(fā)明的鼻內疫苗主要用作產生高水平IgA (從而防止病毒通過天然傳染途徑進入)的屏障。因此，其在短時間內不能對通過多劑量自動注射器的針頭機械引入的病毒具有任何作用。然而，當在農場A和C2中用作單一干預時，不存在通過使用多劑量自動注射器產生的活病毒的意外傳播(incidental transmission)，且進一步的天然傳播在2至5天內被控制以及死亡完全終止。上述實地經驗清楚地證明本發(fā)明的鼻內疫苗通過在暴發(fā)之前和期間刺激普通粘膜免疫系統(tǒng)以防止活病毒進入易感禽類，阻止病毒進入和誘發(fā)粘膜IgA的產生作為一線防御的作用。實施例4
在6，700只產蛋雞的群體(breed Hi sex)(其形成60，000只禽類的總群體的部分)中， 當發(fā)現(xiàn)17只雞死亡時異常死亡率開始。在觀察到該異常死亡率的時間點上，群體中所有雞為28周齡。17只雞死亡的原因被鑒定為HP H5W感染(通過快速診斷測試確認的)。觀察到隨后隨著群體的死亡率因感染的傳播而增加，群體中雞的蛋產量開始下降。在首次觀察到異常死亡率的當天后第6天，611只雞死亡。在該天，在實驗方法中使用如上所述制備的疫苗接種群體所有存活的雞。通過對一個鼻孔施用30 μ 1—滴給每一只雞鼻內施用疫苗。 每一個30 μ 1劑量的鼻內疫苗包含懸浮于0. 5% w/v殼聚糖水溶液(85%脫乙?；?pH 5. 0中的100個病毒HA單位和122個單位的來自A型產氣莢膜梭菌菌株107的唾液酸酶。 在接種后，死亡率開始下降并且在接種后第5天(在首次觀察到異常死亡率后第11天)只有 3只雞因感染而死亡。隨后觀察到蛋產量的增加。血清的血細胞凝集抑制(HI)滴度在對雞施用疫苗后20天增加至峰值。為了阻止疾病至禽類主群體(最初總共60，000只)的傳播，用鼻內疫苗(如上所述的疫苗組合物和劑量)接種主群體中的所有剩余的禽類。未觀察到因H5m感染引起的死亡。圖3分別顯示隨時間的雞死亡率、蛋產量和血細胞凝集抑制。圖3中顯示的結果可部分地由接種后IgA的早期產生來解釋。然而我們認為對接種的應答也表明細菌唾液酸酶具有重要的作用。該作用可能由細菌唾液酸酶的作用導致， 該酶以經典的催化酶和底物模式作用于接種的禽類的粘膜上皮上的唾液酸化細胞受體以使這些受體不能被進入的病毒識別，從而阻止病毒附著和隨后的內吞作用。A. Gottschalk 禾口P. E. Lind, British Journal of Experimental Pathology,第XXX卷，No. 2, April 1949 和 G. K. Hirst, J. Exp. Med.，1942，August 1; 76(2)，195-209 已報導吸附至雞 RBC的流感病毒在一段時間后自發(fā)洗脫(從而使病毒保持功能完整)，但RBC發(fā)生不可逆地改變并且抗進一步的吸附。對于唾液酸酶可發(fā)生相同的作用，其中在完成酶/底物后，唾液酸酶被釋放以重復其作用。這樣的作用可解釋在接種后2至5天的時期內觀察到的死亡率的逐漸下降。在接種時，一些禽類已被亞臨床感染，從而接種不能阻止其死亡。通過胚胎接種和PCR檢查，每月從接種的禽類獲取的糞便拭子未能分離或顯示AI 病毒，從而表示病毒接種后全身清除。實施例5
調查在12日齡時接種的雞的血清學反應。在所有下列調察中，在實驗方法中使用如上所述制備的疫苗組合物進行接種。對每一只雞(12日齡)鼻內施用一個0.03 ml劑量的水相疫苗組合物，其包含懸浮于0. 5% w/v殼聚糖(85%脫乙酰化的)pH 5. 0中的100個病毒 HA單位和122個單位的來自A型產氣莢膜梭菌菌株107的唾液酸酶。通過對每一只禽類的一個鼻孔施用0. 03ml 一滴的疫苗組合物進行接種。調查編號1
在12日齡時接種13只肉雞，在32日齡時從采自雞的血清樣品測定HI Al滴度。結果示于下面的表1中。表 1
雞的編號HI滴度(Iog 2)
2 0 2 2 23
65
1 6 HI Al滴度(log 2)的平均值為3. 54 變異系數(CV)為57. 24%。調查編號2
在12日齡時接種6只產蛋雞，在28日齡時從采自雞的血清樣品測定HI Al滴度。結果示于下面的表2中。表 2
雞的編號HI滴度(Iog 2)1O
13
44
HI Al滴度(log 2)的平均值為3. 17 % CV 是 50. 59。調查編號3
在12日齡時接種3只產蛋雞，在21日齡時從采自雞的血清樣品測定HI Al滴度。結果示于下面的表3中。表 3
雞的編號HI滴度(log 2)
140
1 2
13 8 4
25 4 6 HI Al滴度(log 2)的平均值為2. 37 % CV 為 101. 39。上述表1、2和3中顯示的結果表示如通過血細胞凝集抑制測試測量的體液IgG 抗體反應。雖然疫苗的主要活性是分泌型IgA的快速產生和共同粘膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immune system,CMIS)的刺激，但上文中報導的調查顯示也產生體液抗體。血清轉化的禽類的抗體滴度在被0. I. E.(世界動物健康組織)認為是抗體的保護性水平(即 2 log 2)的可接受限度內。觀察到免疫記憶的其他證據，其中意外暴露由HPAI引起的自然感染的在12日齡時接種的禽類存活。實地經驗確認2至5天內感染的控制(實施例3和4以及圖3)是本發(fā)明的疫苗組合物的作用的共同特征。分泌型IgA的產生促成有效的阻斷作用并且，如實施例5中所證明的，IgG的全身性產生也發(fā)生。然而，2至5天的控制不能完全由這些作用解釋，尤其因為僅IgG的低全身性產量(如實施例5的表1、2和3中舉例說明的)將不足以對暴露的禽類感染的終止具有直接作用。此外，假定在實施例3的農場B和Cl中的禽類(所述禽類已被自然感染或意外感染)中已發(fā)生的低產量的IgG不能控制疾病。我們相信，除了粘膜上皮上的受體位點被唾液酸酶占據以外，這些降解的位點一定被淋巴細胞，特別是細胞毒性T淋巴細胞識別，這導致細胞介導的免疫系統(tǒng)的建立成為控制芽生病毒例如正粘病毒HP H5N1的主要因素。已報導在使用本發(fā)明的鼻內疫苗接種的12日齡禽類中，接種后花費至少10周達到高循環(huán)IgG HI抗體水平(大于64個HI單位)。這是中和已逃避一線粘膜防御但在第一次接觸的位點上幾乎沒有什么用處的病毒所期望的。細胞毒性T細胞是株特異性較低的并且顯示可具有中和通常遇到的次典型 (sub-typical)突變體的益處的更廣泛的交叉反應。當暴露于來自僅相隔20米的鄰近農場的感染時，在已對農場上的家禽使用兩次本發(fā)明的疫苗的鼻內施用的農場中展示了該保護性細胞介導的免疫的證據。在所述農場上在鼻內接種的家禽中未看到死亡，然而鄰近的農場遭受大量禽類損失。實地經驗確認如此接近 另一個農場的接觸傳染將百分之百地肯定到達鄰近處所。
權利要求
1.包含甲型流感病毒抗原和細菌唾液酸酶的疫苗組合物。
2.權利要求1的組合物，其中所述細菌唾液酸酶選自銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、鳴疽梭狀芽胞桿菌或敗血梭狀芽胞桿菌的唾液酸酶。
3.權利要求2的組合物，其中所述細菌唾液酸酶是A型產氣莢膜梭菌唾液酸酶。
4.權利要求3的組合物，其中所述細菌唾液酸酶是A型產氣莢膜梭菌菌株107唾液酸酶。
5.權利要求1至4的任一項的組合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含滅活的完整病
6.權利要求1至5的任一項的組合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含破裂病毒。
7.權利要求1至4的任一項的組合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含純化的膜糖蛋白。
8.權利要求1至7的任一項的組合物，其中所述甲型流感病毒是甲型流感病毒H5W亞型。
9.權利要求1至8的任一項的組合物，其額外地包含殼聚糖。
10.以水相懸浮液或溶液的形式存在的權利要求1至9的任一項的組合物。
11.權利要求1至10的任一項的適合于粘膜施用的組合物。
12.權利要求11的組合物，其中所述粘膜施用是鼻內施用。
13.在受試者中誘發(fā)對甲型流感病毒的免疫應答的方法，所述方法包括給所述受試者施用包含甲型流感病毒抗原和細菌唾液酸酶的組合物。
14.權利要求13的方法，其中所述受試者是禽類。
15.權利要求13或權利要求14的方法，其中所述甲型流感病毒是甲型流感病毒H5W亞型。
16.權利要求13至15的任一項的方法，其中所述細菌唾液酸酶是產氣莢膜梭菌唾液酸酶。
17.權利要求16的方法，其中所述產氣莢膜梭菌是A型107。
18.權利要求13至17的任一項的方法，其中所述組合物額外地包含殼聚糖。
19.權利要求13至18的任一項的方法，其中所述組合物適合于鼻內施用并且將其鼻內施用給受試者。
20.用于在家禽中進行接種的方法，其包括給所述家禽鼻內施用根據權利要求12的組合物。
21.細菌唾液酸酶用以加強包含甲型流感病毒抗原的疫苗組合物的效價的用途。
22.權利要求21的用途，其中所述疫苗組合物額外地包含殼聚糖。
23.權利要求21或22的用途，其中所述疫苗適合于鼻內施用。
24.權利要求21至23的任一項的用途，其中所述細菌唾液酸酶是來自A型產氣莢膜梭菌的唾液酸酶。
25.權利要求21至24的任一項的用途，其中所述甲型流感病毒抗原是來自高致病性 H5N1亞型病毒的抗原。
全文摘要
用于受試者中誘發(fā)針對甲型流感病毒具有保護性的免疫應答的疫苗組合物包含甲型流感病毒抗原和細菌唾液酸酶。用于家禽治療的抗高致病性H5N1亞型病毒的鼻內疫苗優(yōu)選地包含滅活的H5N1抗原、來自A型產氣莢膜梭菌菌株107的唾液酸酶和殼聚糖。還公開了細菌唾液酸酶加強流感病毒抗原疫苗的用途。
文檔編號C07K16/10GK102203134SQ200980144032
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權日2008年11月7日
發(fā)明者E·E·沃拉爾 申請人:安海達諾生物學有限公司